PCR技术及应用
简述PCR技术的主要原理及应用
简述PCR技术的主要原理及应用1. PCR技术的主要原理聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，其主要通过在一系列循环中扩增特定DNA片段，最终获得大量目标DNA的倍增产物。
PCR技术广泛应用于基因测序、基因克隆、突变分析、分子诊断等领域。
PCR技术的主要原理包括以下三个步骤：1.1 反应体系的准备PCR反应体系主要由以下组分组成： - DNA模板：即待扩增的目标DNA段，可以是从任何来源提取的DNA片段。
- 引物：由两个单链DNA片段构成，分别与目标DNA序列的两个相邻区域互补，作为DNA复制的起始点。
- DNA聚合酶：用于引导DNA的复制，具有高温稳定性。
- 反应缓冲液：提供适宜的酶活性和其他反应条件。
1.2 热循环反应PCR反应通过一系列的循环反应，完成DNA的扩增。
每个循环包括以下三个步骤：1.热变性（Denaturation）：将PCR反应管中的DNA双链变性为单链，提供引物结合的机会。
2.引物结合（Annealing）：反应体系通过降温，使引物与目标DNA互补的区域结合。
3.DNA扩增（Extension）：通过DNA聚合酶在适宜温度下复制DNA模板。
1.3 扩增产物的倍增反复进行热循环反应会连续复制目标DNA段，导致DNA的指数级扩增。
经过多个循环之后，扩增产物的数量将呈指数式增长。
2. PCR技术的应用PCR技术在生物学研究和医学诊断中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：2.1 基因测序PCR技术在基因测序中起到关键作用。
通过扩增需要测序的DNA片段，可以获得足够的模板量，用于测序仪的读取。
2.2 基因克隆PCR技术可用于基因克隆，通过引物的设计，扩增目标DNA片段后，将其插入到表达载体中，实现目标基因的表达。
2.3 突变分析PCR技术可以用于突变分析，通过引物的设计，扩增包含突变位点的DNA片段，然后通过测序或其他分析方法确定突变的存在与否。
2.4 分子诊断PCR技术在分子诊断中广泛应用。
简述pcr的原理和应用
简述PCR的原理和应用1. PCR简介PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种通过体外扩增DNA 片段的技术，由美国生物学家Kary B. Mullis于1983年发明。
PCR技术的成功应用在分子生物学和遗传学领域取得了革命性的突破，成为现代生物学研究的重要工具之一。
2. PCR的原理PCR技术主要依赖于DNA的体外复制过程，包括三个主要步骤：变性（Denaturation），退火（Annealing）和延伸（Extension）。
以下是PCR的原理概述：•变性（Denaturation）：将待扩增的DNA双链分离，通常通过加热至94-98℃来破坏氢键，使DNA变为单链。
•退火（Annealing）：将DNA的温度降至反应溶液中引物（引导扩增的短DNA序列）的退火温度，使引物与目标DNA序列互补结合。
•延伸（Extension）：在适宜的温度下加入DNA聚合酶（常用的是Taq聚合酶），使引物的3’端延伸，合成新的DNA链。
经过多个PCR循环，每个循环产生的DNA片段会成倍增加，最终得到大量的目标DNA序列。
3. PCR的应用PCR技术在许多领域具有广泛的应用，以下是PCR在不同方面的应用概述：3.1 基因检测和诊断•PCR可以检测和诊断遗传性疾病，例如常见的唐氏综合征、囊性纤维化等。
通过扩增目标基因的特定序列，可以检测是否存在特定的突变或基因缺陷。
•PCR还可用于检测病原微生物的存在，例如检测病毒、细菌和真菌等。
通过扩增目标基因的保守序列，可以确认病原体的存在并进行鉴定。
3.2 法医学应用•PCR技术被广泛应用于法医学领域，可用于识别个体身份和DNA指纹鉴定。
通过扩增特定DNA区域，可以从样本中获得个体独特的遗传特征，如指纹、DNA序列等。
•PCR还可用于研究遗传疾病的家族史，通过扩增特定基因的片段，可以确定家族成员是否遗传了特定的遗传变异。
3.3 生物学研究•PCR技术在基础生物学研究中扮演着重要角色。
PCR 技术及应用
PCR条件的选择
• DNA聚合酶
• 在其它参数最佳时，每100ul反应液中含12.5U(比活性为20U/pmol)Taq DNA聚合酶为佳。 然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物 而变化。当优化PCR时，最好在每100ul反应体积 中加入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果 浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩 增带；过低时，则靶序列产量很低。
引物及dNTP的优化
酶及溴酚蓝的优化
PCR反应的最佳模式（CT为例）
• • • • • • • • • CT DNA PCR最佳反应体系： 反应混合物 终浓度 20×反应缓冲液 1× dNTP混合物 200M 引物Ⅰ 15pmol 引物Ⅱ 15pmol MgCl2溶液 2.0mM 无菌去离子水至 26l/反应管 取26l反应混合物，加入已经分装的Taq DNA聚合酶1u （固定化的酶）的离心管中， 加入2l待测DNA模板，混匀，铺上石蜡，37℃保温10分钟，然后进行PCR循环： 94℃ 300秒 – 94℃ 45秒 – 55℃ 45秒 35次循环 – 72℃ 45秒 – 72℃ 300秒
PCR反应基本原理
Mullis在建立PCR发明的初期，仅采用非常简单的三种温 度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的 Klenow片段来催化复性引物的延伸效应。由于该酶会在进 行DNA变性的温度下失活，所以每一轮反应中都要添加一 次酶，扩增片段的长度受到限制，操作繁琐。1988年， Saiki把一种耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）引入PCR 后，PCR技术的应用进入了实用阶段，随后PE-Cetus公司 推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。 PCR技术在微生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域中 的应用越来越广，据文献报道PCR技术用于检测病原体的 种类已超过100多种。
pcr技术在分子生物学中的应用
pcr技术在分子生物学中的应用PCR技术在分子生物学中的应用引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它可以快速、准确地扩增DNA片段。
PCR技术因其高效、灵敏和可靠的特点，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
本文将深入探讨PCR技术在分子生物学中的应用。
一、基因检测PCR技术在基因检测中有着重要的应用。
通过PCR扩增特定基因片段，可以检测个体是否携带某种基因突变或遗传病。
例如，PCR技术可以用于检测乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2的突变，帮助判断个体是否具有遗传乳腺癌的风险。
此外，PCR技术还可以用于检测病原体的基因，例如新冠病毒的核酸检测就是基于PCR原理。
二、疾病诊断PCR技术在疾病诊断中具有重要的应用价值。
通过PCR扩增患者体液中特定病原体的DNA或RNA片段，可以快速准确地检测出病原体的存在，从而帮助医生进行疾病的诊断。
例如，PCR技术可以用于检测艾滋病病毒的存在，帮助医生判断患者是否感染了艾滋病。
此外，PCR技术还可以用于检测细菌感染，例如通过检测脑脊液中的细菌DNA片段来诊断脑膜炎。
三、基因工程PCR技术在基因工程领域有着广泛的应用。
通过PCR扩增目标基因片段，可以快速获得大量的目标DNA。
这样就可以进行基因克隆、基因插入等操作。
例如，PCR技术可以用于构建重组质粒，将目标基因插入到质粒中，从而实现基因的表达和研究。
此外，PCR技术还可以用于基因突变的引入，通过引入特定突变的PCR产物，可以实现特定基因的突变。
四、法医学PCR技术在法医学中有着重要的应用。
通过PCR扩增样本中特定基因片段的DNA，可以对犯罪现场的DNA进行检测和鉴定。
例如，在刑事案件中，通过PCR技术可以检测凶手遗留在现场的DNA，从而确定凶手的身份。
此外，PCR技术还可以用于亲子鉴定，通过比对父母和子女的DNA片段，确定亲子关系。
总结：PCR技术作为一种高效、灵敏和可靠的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
PCR技术的原理与应用
PCR技术的原理与应用PCR（聚合酶链式反应）技术是一种体外扩增DNA的方法，其原理是在适当的条件下，通过对DNA序列的短端引物的特异性杂交和聚合酶的扩增作用，来快速合成指定序列的DNA。
PCR技术的应用非常广泛，涵盖了医学、生物学、农业等领域。
本文将分别从原理和应用两方面详细介绍PCR技术。
1.变性：将DNA的双链分离为单链，通常是通过加热至90-95摄氏度进行变性。
高温使DNA的双链断裂，形成两条单链，用于之后的PCR反应。
2.退火：将反应体系温度降低至50-60摄氏度，加入两个引物（即DNA的扩增首尾序列），引物通过碱基对特异性杂交到DNA模板的特定区域上。
3.延伸：将温度升高至72摄氏度，引物上的聚合酶开始将引物区域上的DNA模板扩增。
由于引物的方向相对，两个引物同时在相应的模板序列两侧将DNA扩增。
通过这三个步骤的循环，可以指数级地扩增特定DNA片段，从而使其可以被快速检测和分析。
1.分子诊断：PCR技术广泛应用于临床医学中的分子诊断。
通过扩增其中一种病原体的DNA片段，可以快速诊断感染或遗传病。
例如，HIV的检测、乳腺癌的早期诊断等。
2.犯罪学：PCR技术可以对指定的DNA样本进行扩增，并通过比对DNA指纹数据库来进行罪犯的辨认。
这一技术在犯罪学中被广泛应用。
3.基因工程：通过PCR技术可以扩增特定基因，然后进行突变或重组。
这一技术在基因工程研究和基因治疗中发挥了重要作用。
4.农业：PCR技术可以用于快速检测转基因作物，对粮食和蔬菜进行品种鉴定。
同时，PCR技术还可以被用于植物病理学研究、基因组学研究等。
5.法医学：PCR技术可以通过对DNA标记位点的扩增，来对遗传证据进行鉴定。
例如，通过扩增DNA片段并与被疑犯的DNA进行比对，从而确定罪犯的身份。
总之，PCR技术是一种简便、快速和高效的DNA扩增方法。
通过合理设计引物和选择合适的参数，可以对特定DNA片段实现精确扩增。
其在医学、生物学、农业等领域都有广泛的应用，为相应领域的科研和实践提供了强有力的工具。
PCR技术及其应用(医学分子生物学)
PCR技术是一种在实验室中用于从极微小的DNA样本中进行扩增的技术。它采 用特定的酶系统和温度循环，使得DNA片段可以被放大成大量可见的形式。
PCR技术原理
PCR技术利用DNA聚合酶在体外合成DNA的特性。它涉及三个主要步骤：变性、引物结合和扩增。
PCR技术应用领域
基因组学研究
PCR技术在基因组学研究中发挥着重要作用，可以用于从复杂基因组中扩增特定的DNA区域。
遗传疾病诊断
PCR技术可以用于检测携带有致病基因突变的人群，帮助进行早期诊断和预防。
法医学鉴定
PCR技术在法医学中可用于鉴定嫌疑犯的DNA，为犯罪调查提供重要证据。
PCR技术在医学研究中的应用
基因表达研究
2
基因突变筛查
PCR技术可以用于筛查各种遗传性疾病的突变，帮助早期诊断和预后评估。
3
体外受精
Hale Waihona Puke PCR技术在体外受精过程中可以检测和筛查胚胎的遗传疾病，提高受孕成功率。
PCR技术在药物研发中的应用
1 药物代谢研究
PCR技术可以用于研究药物在人体内的代谢途径和速度，以及相关的影响因素。
2 毒性评估
PCR技术可以检测和分析药物对细胞和组织的毒性作用，帮助评估药物的安全性。
PCR技术可以检测和定量特定基 因的表达水平，帮助解析基因功 能。
细胞株鉴定
PCR技术可用于验证和鉴定细胞 株是否为纯种，以确保实验结果 的准确性。
基因克隆
PCR技术可以在研究中克隆和扩 增特定的基因序列，为后续研究 提供材料。
PCR技术在临床诊断中的应用
1
病原检测
PCR技术可以迅速检测出引起感染的病原微生物，为精确诊断和治疗提供依据。
pcr的原理和应用领域
PCR的原理和应用领域1. PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。
它是由美国生物学家凯瑟琳·梅利斯（Kary B. Mullis）在1983年发明的，因其在分子生物学领域的重要应用而获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的原理主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1.1 变性（Denaturation）将待扩增的DNA样品加热至94-98℃，使双链DNA解开成两条单链DNA。
这一步是为了使DNA分子的双链结构完全解链，以便后续的退火步骤。
1.2 退火（Annealing）将待扩增的DNA样品降温至50-65℃，加入引物（寻找特定靶序列的DNA寡核苷酸链），使引物与单链DNA序列互补配对结合。
这一步是为了使引物与待扩增的DNA序列特异性地结合，以启动PCR反应。
1.3 延伸（Extension）将待扩增的DNA样品在72℃下加入DNA聚合酶（如Taq聚合酶），使DNA引物双链结构被DNA聚合酶复制成两条新的DNA双链。
这一步是为了合成新的DNA链，使扩增物数量呈指数倍增。
经过多个循环的变性、退火和延伸步骤，可以在短时间内扩增出大量特定目标序列的DNA片段。
2. PCR的应用领域PCR技术具有高效、灵敏、特异性强等优点，因此在许多领域得到了广泛应用。
2.1 分子生物学研究PCR技术在分子生物学研究中扮演着重要角色，广泛应用于：•基因克隆和表达研究：PCR可以扩增特定基因片段，用于克隆和构建重组DNA。
可以通过PCR检测基因在不同组织和细胞类型中的表达水平，研究基因的功能和调控机制。
•突变检测和基因诊断：PCR可以检测基因突变，用于遗传病的诊断和预测。
例如，PCR可以用于检测致病基因的特定突变，如BRCA1和BRCA2基因突变与乳腺癌的关联。
•DNA指纹和个体识别：PCR可以扩增DNA中的特定序列，用于DNA指纹分析和个体识别。
PCR技术的应用
3、PCR在肿瘤相关基因检测中的应用
● 寡核苷酸探针杂交法 ● 限制性内切酶切片段长度多态性(RFLP)技术 ● PCR—RFLP技术 ● RNA酶A错配清除法 ● 核酸序列分析法
4、PCR技术在遗传病早期诊断中的应用
● 基因诊断技术的发展是现代医学发展的一个重要 标志，它从基因水平开辟了诊断学新领域。聚合 酶链反应(PCR)技术是基因诊断主要技术之一，以 PCR为基础的各种分子生物学新技术在遗传病的 基因诊断等方面得到广泛的应用。
2、PCR技术在传染病病原体检测中的应用
● PCR是一种具有高敏感性、且特异性好的靶DNA 快速检测方法，能对前病毒或潜伏期低复制的病 原体特异性靶DNA片段进行扩增检测，只要标本 中含有lfg靶DNA就可检出。可检出经核酸分子杂 交呈阴性的许多标本，而且对标本要求不高，经 简单处理后就能得到满意扩增。可做到早期及时 诊断，对防止传染病流行有重要意义。
四：用于基因定量
● 应用PCR技术可以定量监测标本中靶基因的拷贝数，这在研究基因的扩增等方面具有 重要意义，这种方法称为差示PCR(differential PCR)。它是将目的基因和一个单拷贝 的参照基因置于同一个试管中进行PCR扩增。电泳分离后呈两条区带，比较两条区带 的丰度；或在引物5’端标记上放射性核素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出 目的基因的拷贝数。利用差示PCR还可以对模板DNA(或RNA)的含量进行测定，在一 系列PCR反应中，分别加入待测模板DNA和参照DNA片段。参照DNA片段基本上按待 测DNA的方式进行构建，但增加了一小段内部连接顺序，这样使得两种DNA片段的 PCR产物可在凝胶电泳上分开。由于这两种不同的DNA片段可以在同一种寡核苷酸引 物作用下同步扩增，因此可以避免因使用不同的引物所引起的可能误差。这两种扩增 产物的相对量就反应了在起始反应混合物中的目的DNA和参照DNA的相对浓度。
PCR技术及应用
2、引物的设计： 引物包括两条，即5/端引物和3/端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度
引物设计的基本要求： （1）引物长度: 15~30 nucleotides （2）碱基的分布尽可能随机，避免出现嘌 呤或嘧啶碱基的堆积现象。 No GGG or CCC at 3’-end (G+C) 45%~ 55% Tm=4(G+C)+2(A+T)
（3）dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+ 浓度降低
5）镁离子浓度 TaqDNA聚合酶的激活剂 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响；在一般的 PCR反应中，各种NTP浓 度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜； Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增， 浓度过低会降低，Taq DNA聚合酶的活性 不够，使反应产物减少。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
• 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
• 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 • 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪 • 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
复制的起始
3
5 3
引物
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
复 制 过 程 简 图
PCR技术在食品检测中的应用和发展
PCR技术在食品检测中的应用和发展一、PCR技术在食品检测中的应用1.检测食品中的致病菌：PCR技术可以用于检测食品中的致病菌，如沙门氏菌、大肠杆菌等。
PCR技术在该领域的应用主要包括两个方面：一是快速检测方法的开发，能够在短时间内得到检测结果，提高检测效率；二是多重PCR技术的应用，能够同时检测多种致病菌，提高检测的准确性和可靠性。
2.检测食品中的转基因成分：PCR技术可以用于检测食品中的转基因成分，如转基因玉米、转基因大豆等。
通过PCR技术可以确定食品中是否含有转基因成分，并对其进行定量分析。
这对于食品质量的监管和食品安全的保障具有重要意义。
3.检测食品中的致敏成分：PCR技术可以用于检测食品中的过敏原分子，如鸡蛋、牛奶等。
通过PCR技术可以对食品中的致敏成分进行敏感、快速的检测，提高食品安全性。
4.食品品种的鉴别：PCR技术可以用于鉴别食品中的品种，如鉴别食用油中的橄榄油、花生油等。
通过PCR技术可以确定食品中包含的成分，避免食品欺诈行为。
二、PCR技术在食品检测中的发展1.快速检测技术的进一步改进：PCR技术在食品检测中的应用之一是快速检测方法的开发。
现有的PCR技术需要对样品进行DNA提取和准备，这些步骤都需要一定的时间和专业知识。
未来的发展方向是发展更为简化的快速检测方法，如发展直接检测方法，免去复杂的样品处理步骤。
2.高通量检测技术的应用：PCR技术在食品检测中可以应用于检测多种目标物。
目前已经有一些商业化的PCR芯片或PCR多孔板，可以同时对多个目标进行检测。
这些高通量检测技术的应用可以提高检测的效率，并降低检测的成本。
3.检测靶点的扩大：PCR技术在食品检测中一般针对特定的靶点进行检测，但随着PCR技术的不断发展，可以对多个靶点进行同时检测。
未来的发展方向是针对更多的靶点进行检测，从而更全面地评估食品的质量和安全性。
4.新一代测序技术的应用：PCR技术在食品检测中的应用可以结合新一代测序技术，如高通量测序。
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A.阳性对照
B.阴性对照
C.原位检测mRNA表达
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（四）mRNA 含量分析
1．反转录PCR（RT-PCR）
逆转录酶 DNA聚合酶
mRNA 杂化双链 cDNA
PCR扩增
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（四）mRNA 含量分析
1．反转录PCR（RT-PCR）
RT-PCR用于对表达信息进行检测或定 量。另外，还可以y(A)的mRNA。
ddH2O
pH值适当，避免污 染
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA 的微量分析 （四）mRNA 含量分析
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（一）目的基因的克隆
①利用特异性引物，以cDNA或基因 组DNA为模板获得已知的反应相结合， 直接从组织和细胞的mRNA获得目的基 因片段。该方法被称为RT-PCR技术。
适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（三）DNA 的微量分析
原位PCR的作用
既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交 （ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于 10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标 准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度 很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。
内参照RNA必须使用与样品RNA同样的引物 识别序列，但是产物的大小不同，可以在电泳时 区别开。
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（四）mRNA 含量分析
3．荧光实时定量 PCR（real time PCR) 根据PCR反应动力学特点设计，通过荧光染料
DNA模板
纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物
浓度 浓度适当（一般100ngDNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加）
引物
设计 引物3＇端为关键碱基；5＇端无严格限制。 合成质量
浓度 50uL体系引物加量为10～20 pmol
（五）反应体系对PCR扩增的影响
30轮循环
（2）特异性
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
•引物的序列及其与模板结合的特异性 是决定PCR反应结果的关键。 •引物设计的最大原则是最大限度地提 高扩增效率和特异性；同时尽可能减 少非特异性扩增。
（三）PCR技术的特点
（3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可 以用电泳法检出1μg基因组DNA 中仅含数个拷贝的模板序列。
2．巢式PCR 巢式PCR(nested PCR)也称做嵌套式PCR， 主要作用是提高了目的基因获得的灵敏度和特异性。它是通 过设计两对引物，一对引物对应的序列在模板的外侧，称外 引物(outer-primer。)，另一对引物互补序列在同一模板的 外引物的内侧，称内引物(inter-primer)。外引物扩增的产 物较长，含有内引物扩增的靶序列。首先用外引物进行PCR 反应，获得的产物再利用一对内侧引物进行第二次PCR反应。
specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base
（四）PCR标准反应体系
Primer designed with the help of computer
DNA database conservative region comparision Primers or Blast
dNTP 耐热聚合酶：1969年，美国黄石国家公园温泉； 94KDa；活性：在几种水生栖热菌中活性最高， 200 000U/mg 。1988年引入了PCR技术
ddH2O
（四）PCR标准反应体系
DNA模板：纯化的基因组或质粒DNA；
由RNA转化得到的cDNA； 未经纯化的粗制生物样品（细菌 克隆或噬菌斑 ）
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（一）目的基因的克隆 1．反转录PCR RT-PCR是将RNA反转录和PCR结合起来 建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA，然后以 cDNA分子为模板,在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复 制的机制，使目的cDNA片段得到扩增。由于PCR反应的高 度敏感性，从少量的RNA样品，甚至不用进行mRNA的纯 化，就可以获得目的基因。
Mg 2＋浓度
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂； 0.5mmol/L～2.5mmol/L反应体系； Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性； Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度会影响反应中游离的Mg2+浓度。
dNTP Mixture
生物化学暨分子生物学教研室 关亚群
PCR技术的创建
• Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性, 与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆 DNA的设想。
• 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代 基因工程技术的发明使克隆基因成为可能， 所以，Khorana的设想被人们遗忘了……
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设 想得到实现。
一、PCR技术的基本原理
（一）基本概念
Polymerase chain reaction，PCR
即聚合酶链反应。是以拟扩增的DNA 分子为模板，以一对分别与模板5＇末端 和3＇末端互补的寡核苷酸片段为引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复 制的机制，使目的DNA片段得到扩增的 技术。
一、PCR技术的基本原理
（二）基本原理 无细胞分子克隆法： 变性--退火--延伸三个步骤 模板DNA的变性：93℃～95℃左右， 模板DNA与引物的退火(复性)：
Ta=Tm–3～5 ℃ 引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5＇→
3＇DNA聚合酶活性
一、PCR技术的基本原理
（二）基本原理
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（三）DNA 的微量分析
原位PCR(In situ PCR)
是由Haase等于1990年首创。它是利用完整 的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的 目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定 的检测手段来检测细胞内的扩增产物。
直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细 胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。
（4）用途广泛
生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学
（四）PCR标准反应体系
DNA模板： 引物 ：引物确定了扩增产物的序列和长度 反应缓冲液： 10-50mmol/L Tris-HCl
(pH8.3-8.8, 20℃) Mg2+：for Taq polymerase activity
预变性
94
温
度 72
（℃）
55 22
1
2
3
高温变性 低温退火
与引物复性
子链延伸 DNA加倍
DNA双螺旋
重复1-3步 25-30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
（三）PCR技术的特点 （1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
IS-PCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊 断中一种崭新的检测技术。该法在检测细胞内病 毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA 表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜 在感染方面也具有重要意义。
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（三）DNA 的微量分析 操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般 PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入； 2. PCR扩增细胞内目的片段； 3. 原位杂交检测扩增产物。
（四）PCR标准反应体系
Taq DNA聚合酶
离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。 最适浓度为50mmol/L。
忠实性: 没有校正单核苷酸错配功能———致命弱点。 一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环， 利用PCR克隆、测序时尤应注意。
抑制剂: 尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS• 及许多其他化学药剂。
酶：逆转录酶和DNA聚合酶 引物：随机引物、oligo(dT)或基因特异 性的引物（GSP）起始。 RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术
（四）mRNA 含量分析
2．竞争性RT-PCR
竞争性定量PCR(competitive quantitative PCR)技术是在反转录反应前，在 反应系统中加入外源性标准品RNA作为内参照。 这一标准品RNA与样品RNA同时经历RT-PCR 反应，根据已知浓度的标准品RNA的反转录和 PCR反应效率，计算出处于同一反应中的样品 RNA含量。
dNTP浓度取决于扩增片段的长度； 四种dNTP浓度应相等，避免反复冻融； 浓度过高易产生错误碱基的掺入， 浓度过低则降低反应产量； dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降, 影响 DNA 聚合酶的活性。
（五）反应体系对PCR扩增的影响
反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、
增强剂 提供缓冲环境
内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的 原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源 的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物， 会在无模板对照管出现扩增带。
保存: 在-20℃至少6个月
（四）PCR标准反应体系
PCR optimization
变性温度和时间： 92～95℃，富含G和C的序列，可适当提 高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。 退火温度与时间
二、PCR技术的主要用途及其衍生技术