枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
枯草芽孢杆菌试验方案
枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案一、材料准备（1）实验仪器培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪（2）实验试剂NA培养基：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105（3）培养基配方牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。
二、实验步骤（1）制备菌液称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①；用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧;（2）进行涂板向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记；每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次；将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。
（3）菌落计数以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数：当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数；若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。
若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数；若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
芽孢杆菌活菌数及芽孢数检测方法
芽孢杆菌活菌数及芽孢数检测方法1主题内容与适用范围本方法规定了芽孢杆菌总数的测定方法；本方法适用于测定微生物制剂中芽孢杆菌总数2方法提要芽孢杆菌总数是指水样在一定条件下培养后(培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等)所得1mL水样所含菌落的总数。
按本方法规定所得结果只包含一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的芽孢杆菌菌落总数。
3培养基与试剂3.1营养琼脂成分蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，琼脂20g，水1000mL。
3.2制法:将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.2，分装于玻璃容器中(如用国产含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
3.3生理盐水的制备：按总体积的0.9%称量NaCl并混合均匀，然后用移液枪或移液管吸取9ml生理盐水加入到试管中，并在121℃灭菌20min备用。
4仪器高压蒸汽灭菌器，干热灭菌箱，培养箱，36±1℃，电炉，天平，冰箱，pH计，灭菌试管，平皿(直经9cm)、刻度吸管等。
5活菌计数方法5.1取固体样品5.0g，溶于95mL蒸馏水(此时稀释20倍)，加入适量已灭菌玻璃珠，于200rpm摇床中振荡20min。
5.2用移液枪从锥形瓶取1ml样品液至装有9ml无菌水的试管中，逐步稀释至适当梯度。
5.3吸取0.2mL适当稀释梯度的菌液放入对应平板中，用已灭菌的涂布棒来回涂匀。
5.4涂匀的平板置于30℃培养箱中培养20~30h，待长出清晰可见的菌落，进行计数。
6菌落计数及报告方法作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌落不到平皿一半，而其余一半中菌落数发布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2以代表全皿菌落数。
科诺枯草芽孢检测方法
科诺1000亿枯草活芽孢检测方法1.1 鉴别试验根据菌株的生理生化特征，并结合个体形态和群体形态特征，参照《微生物分类学》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对菌株进行鉴定。
见资料性附录A。
1.2 1.0×1011活芽胞/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂芽胞数的测定1.3 枯草芽孢杆菌原药芽孢数的测定1.3.1 方法提要本孢子浓度法用来计算每克枯草芽孢杆菌原药的活芽孢数量。
1.3.2 试剂和溶液稀释液: 氯化钠18g，吐温80 2mL，蒸馏水2000mL，加热充分溶解后分装到5个500mL的三角瓶中，灭菌备用。
营养琼脂培养基与培养皿的制备：蛋白胨：10g，酵母浸粉：5g，NaCl：10g，琼脂粉：15g，蒸馏水1000mL,pH值：7.0-7.2。
灭菌后倒培养皿，备用。
1.3.3 仪器、设备警示:所有器皿必须洁净、无菌；不得使用矿质化的玻璃器皿；移液器具用前需校正。
分析天平：精度0.1mg；立式圆形压力蒸气灭菌锅；恒温培养箱；水浴锅:0-100℃；磁力搅拌器；超声波水浴器；旋涡混合器；中性瓶:250mL；试管: 18×150 mm；刻度量筒: 100 mL；移液枪：100 uL、1000 uL；移液枪头：100 uL、1000 uL；玻璃涂棒；培养皿: 90mm。
1.3.4 测定步骤1.3.4.1 样品的预处理每个样品重复检测3次。
a) 称取0.99～1.0lg(准确至0.0002g)的试样于250mL中性瓶中。
b) 再准确量取100mL稀释液倒入中性瓶中,然后把250mL中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min，之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。
c) 将已混合好试样的250ml中性瓶放入超声水浴器中（水浴器的水平面必须等同于试样液面，中性瓶应放在超声波振源处），共超声15min（7min时停止，猛烈摇动试样瓶，然后再超声8min）。
d) 在超声之后，再次用磁力搅拌混合60min。
发酵工程实验
发酵⼯程实验发酵⼯程实验 Prepared on 24 November 2020实验⼀酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）实验⽬的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与⽅法。
2、了解市售酸奶的⽣产⼯艺。
3、掌握乳酸菌活菌计数⽅法与操作。
实验原理：乳酸菌在乳中⽣长繁殖，发酵分解乳糖产⽣乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋⽩在其等电点附近发⽣凝集。
乳酸菌属于兼性厌氧微⽣物，在⽆氧条件下⽣长繁殖较好，实验室条件下利⽤混菌培养的⽅法，尽可能让乳酸菌在⽆氧条件下⽣长，每个单菌落代表⼀个微⽣物细胞。
实验内容：（⼀）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热⽔（80℃左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶⼝味，在调制乳中加⼈4-8％的蔗糖。
3、灭菌：⽅法有两种：将乳加热⾄90℃，保温5min；4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加⼊乳酸菌，接种量为2%-5%。
5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进⾏分装，须是将含有乳酸菌的⽜乳培养基先分装到⼩容器中，加盖后送⼊恒温室培养，在⼩容器中发酵制成酸奶。
6、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃，⼀般发酵时间为3-6h。
发酵终点的确定有两种⽅法：1）检测发酵奶的酸度，达到65-70 T°。
2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，⽽且瓶中部有细微颗粒出现。
7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，⽤冷风迅速将其冷印到10℃以下，⼀般2 h，使酸奶中的乳酸菌停⽌⽣长，防⽌酸奶酸度过⾼⽽影响⼝感。
8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。
9、感官指标1）⾊泽：⾊泽均匀⼀致，呈乳⽩⾊，或稍带微黄⾊。
2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，⽆⽓泡，允许少量乳清析出。
3）⽓味：具有清⾹纯净的乳酸味，⽆酒精发酵味，⽆霉味和其他外来不良⽓味。
（⼆）乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋⽩胨15g，⽜⾁膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉20g，⽔1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置⽔浴52℃保温备⽤。
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测是确保饲料添加剂的质量和安全性的重要环节。
以下是一种常用的检测方法：
1.样品准备：从混合型饲料添加剂中取得适当的样品量，确
保样品代表性。
将样品进行适当处理，如研磨或稀释等，以便后续的分析操作。
2.菌落计数：使用枯草芽孢杆菌特异性培养基（如PYG，
Plate Count Agar等），将样品接种于培养基表面，利用平板计数法进行枯草芽孢杆菌的菌落计数。
3.PCR检测：使用枯草芽孢杆菌的特异性引物和探针进行
PCR（聚合酶链式反应）检测，通过扩增枯草芽孢杆菌的DNA片段来确认其存在。
4.实时荧光定量PCR：使用荧光探针和枯草芽孢杆菌特异性
引物进行实时荧光定量PCR（qPCR），检测和定量枯草芽孢杆菌的DNA，同时可以根据标准曲线计算样品中的枯草芽孢杆菌数量。
5.基因测序：对样品进行基因测序，通过分析样品的DNA
序列来确认枯草芽孢杆菌的存在和鉴定特定菌株的种属。
需要注意的是，枯草芽孢杆菌的检测方法可以根据实际需要进行选择，并结合相关标准和法规要求。
同时，实验室应该有足够的设备和技术来执行这些检测方法，并参考相关的操作指南和质量控制要求，以确保检测的准确性和可靠性。
枯草芽孢杆菌活菌计数方法
枯草芽孢杆菌活菌计数法
1.实验器材
培养箱,超净台,灭菌锅
90mm培养皿,玻璃涂布棒,三角瓶,5ml、1ml、100μl移液枪及枪头,试管架,
试管,无菌水(器具耗材均需提前高温高压灭菌)。
2.实验方法
1)配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨1%
牛肉膏0.3%
氯化钠0.5%
葡萄糖1%
琼脂2%
121℃高压灭菌20分钟。
2)接种
a)将已灭菌的营养琼脂培养基倒入已干灭好的培养皿中,约25mL/90mm培养皿,待凝固后备用。
b)以准确称取检样0.1g(或1.00mL)放入含有100mL无菌水的玻璃三角瓶中,
充分溶解,即配制成1:1000的稀释液。
c)取0.1mL 1:1000的稀释液注入含有9.9mL无菌水离心管中,涡旋混匀,此为10-5的稀释液。
d)按上述操作顺序做10倍递增稀释液,每稀释一次,换用一个1mL无菌吸头,根据对样品菌落生长情况的预实验,选择合适的稀释
度,最终选择10-7,10-8,10-9 三个稀释梯度。
e)吸取0.25mL稀释液于营养琼脂平板上,用涂布器将菌液涂布均匀,每个稀释度做3个平皿,倒置于30℃恒温培养箱中,培养24h 后取出,计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
3 计数
计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
QBHHS JC009-2013 枯草芽孢杆菌活菌计数办法
1检测方法
平板菌落计数法
2
准备材料2.1普通肉汤培养基：试剂名称
添加数量试剂名称添加数量蛋白胨
10克琼脂15g 牛肉膏
5克蒸馏水1000毫升
NaCl 5克配好后高压灭菌倒平板，37℃培养箱置16h（无菌检查），备用。
2.2
0.05％的琼脂生理盐水，高压灭菌2.3
1ml 枪头，高压灭菌2.4
0.2ml 枪头，高压灭菌2.5灭菌的试管
3
试验步骤3.1
向各灭菌试管中加入4.5ml 琼脂生理盐水，每个样品准备至少7支试管；3.2无菌称取0.5g 混匀的新鲜样品，加入到第1支试管，充分混匀后，吸取0.5ml 至第2支试管，同样处理，直到第后一管；
注意：每支试管一定要充分混匀，这是试验成功与否的关键！
3.3分别从最后3管用移液器吸出20μl，再分别滴种到普通肉汤培养基上，每个梯度做三个重复；
注意：一定要从后向前做！
3.4将滴好的平板正置放置30min，使其充分干燥后，再将其拿出置37℃培养箱好氧培养约12h，即可观察结果；
4计数
培养结束后，取出平板，计数每个平板每滴的细菌数量，计算三个重复的平均数，再乘以相应的稀释倍数，即得原样品中的活菌数。
检测技术规范与标准方法
编号：QB/HHS JC009-2013修订：第1版第1次修改枯草芽孢杆菌活菌计数方法起草：赵丽霞
审核：刘永垒
批准：
执行日期：2013年6月15日。
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
文件名称枯草芽孢杆菌活菌数的测定操作规程文件编号编制人编制日期年月日颁发部门审核人审核日期年月日印制份数批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门质量管理部、生产部目的：建立枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程范围：本方法适用于的枯草芽孢杆菌活芽孢的测定责任人：内容：1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入90ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动60min，即成母液的菌悬液。
4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
4.3向每个灭菌培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。
4.4用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液0.2ml，加至已凝固好的培养基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37℃的恒温培养箱内培养18h—24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数：5.1 以平板上出现20个——200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
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目的：建立枯草芽抱杆菌活菌数含量的测定标准操作规程
范围：本方法适用于的枯草芽抱杆菌活芽抱的测定
责任人：
内容：
1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18 x 180mm 试管、500ml
角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管
2 •试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。
3. 检测培养基配方：牛肉膏 3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水
1000ml，调至 PH7.2 , 121 °C 灭菌 30min。
4. 检测步骤：
4.1困液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取 10.00g试样，
加入已火菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入 90ml已火
菌的无菌水，在摇床上200r/mi n 摇动60min，即成母液的菌悬液。
4.2用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入 9ml无菌水混匀成1 :
1 x 102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到 1 : 106； 1 ： 107； 1 ： 108； 1 ：10
等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
4.3向每个灭菌培养平皿中倒入约 12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。
4.4用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液0.2ml，加至已凝固好的培养
基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37 C的恒温培养箱内
培养18h — 24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入
无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5. 菌落计数:
5.1以平板上出现20个------ 200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为
稀释倍数。
5.2当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个一一200个之间时，则以该平均
菌落数乘以其稀释倍数。
5.3若有两个稀释度，其平均菌落数在 20个一一200个之间时，应按两者菌落数之比值来决定。
6、结果统计与计算
根据菌落数特征判定，分别数出平板中的枯草芽抱杆菌菌数及杂菌数（杂菌是指除枯草芽抱杆菌外的其他菌种）。
统计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数（B ）和杂菌数（E）。
6.1有效活菌总数按式（1）计算；
A=10 X B X C X 5 式中：
A--- 有效活菌总数，cfu/g
B--- 菌落活菌数；
C――稀释倍数。
6.2杂菌率按式（2）计算：(1 )
D=
式中：
D ――杂菌率，%
X 100 E――杂菌数
E+A。