蛋白质的测定使用凯氏定氮法解说讲课教案
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凯氏定氮法课件
2NH4Cl + 4H3BO3
(注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds )
整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定
1. 消化
要预防暴沸
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提升溶液沸点， 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后能够提升 至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。
凯氏定氮法
测定蛋白质含量旳措施 凯氏定氮法
双缩脲法
Folin－酚试剂法
紫外吸收法
• 其中： • 凯氏定氮法——最常用旳，国内外应用普遍。
凯氏定氮法
• 凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改 善后旳改良凯氏定氮法。
微量法：取消化液旳10%加碱蒸馏
常量法：取消化液旳全部加减蒸馏。
（一）常量凯氏定氮法
(NH4)2SO4 检验
⑩蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或 黑褐色↓（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如 颜色不变可能碱不够 。
⑾蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗 管口，再蒸1分钟后关掉热源．不然可能造成吸 收液倒吸。
⑿H3BO3吸收液旳温度不应超出40℃，不然对 NH3旳吸收作用减弱而造成损失。
原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中 旳有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏， 使氨蒸出。
① 用H3BO3吸收后再以原则HCl滴定或H2SO4溶液滴定。 根据原则酸消耗量能够计算出蛋白质旳含量。
② 也能够用过量旳原则H2SO4或原则HCl溶液吸收后再ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ以原则NaOH滴定过量旳酸。
马铃薯含非蛋白氮多。
7第七节 凯氏定氮法测定蛋白质及挥发性盐基氮含量22p
第三节 蛋白质的定量测定
一、凯氏定氮法 (一)常量凯氏定氮法 1.原理 (1)消化 A.样品与浓硫酸共热时，有机物被破
坏，其中的碳和氢被氧化成二氧化碳和 水而逸去，而氮转变为氨再与硫酸结合 成硫酸铵留在消化液中。
H2SO4 SO2＋H2O＋[O]
2CuSO4 Cu2SO4＋SO2＋2[O] Cu++为催化剂加速[O] 产生
主要(也是最常用的)用凯氏定氮法测定总氮量， 然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白 的氮，所以只能称为粗蛋白的含量 2.蛋白质的测定方法 (1)根据物化性质：折射率、比重、紫外吸收等。 (2)化学方法：凯氏定氮法、双缩脲反应、染料结 合反应、水杨酸比色法 (3)仪器分析法：红外分析仪 二、食品中蛋白质的含量 三、一些蛋白质的含氮量
3.消化装置
漏斗
10%Na2CO3
需通风柜的消化装置
凯氏烧瓶 电炉
不需通风柜的消化装置
4.常量凯氏定氮法测定装置与微 量凯氏定氮测定装置特点
(1)常量凯氏定氮法测定装置特点 A.因参加反应是消化液的全部，消化产生的
氨能全部被蒸馏出，相对(半)微量凯氏定氮 测定装置产生的氨要多得多，故滴定时用去 的标准盐酸也多，这样滴定精密度要高一些。 适用于蛋白质含量较低的样品，操作简单。 B.一个样品消化液最多能使用一次，如果实 验失败必须重头来过。耗用NaOH和较多。
6.蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为何要 用硫酸调成酸性?
Thank you
食品检验学 楼明
(二)微量凯氏定氮法
1.原理及适用范围同前 2.与常量法不同点(见下)
(三)凯氏定氮法测定装置介绍 1.常量凯氏定氮法测定装置 加液漏斗
凯氏烧瓶 玻璃珠 电炉
实验二蛋白质含量的测定凯氏定氮法1ppt课件
滴定：标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度
为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩 尔数)，计算出样品中的总氮量。
NH42B01O92/1+2/2H7Cl → HBO2+NH4Cl
滴定
三、试剂与器材
1、消化液：H2O2：H2S04 ：H2O=3：2：1 2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物
2019/12/27
– 若样品为液体(如血清等)，可取一定体 积样品直接消化测定。
2019/12/27
• 取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠; • 1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂200
2、消化
mg，消化液5 mL。3及4号瓶中各加相 加样时应直接送人瓶底，不 同量的催化剂和消化液-----对照，以测 要沾在瓶口和瓶颈上。
定试剂中可能含有的微量含氮物质。
消化开始时应控制火力，不使液体
冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开
始分解并放出SO2白烟后，适当加强火 力消化，直至消化液呈透明淡绿色。
• 定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加 随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次， 洗液并入容量瓶，定容。
1.凯氏烧瓶 2.凯氏定氮仪 3.分析天平 4.酸式滴定管 5.烘箱 6.消化炉 7.容量瓶
等等
四、操作方法
1. 消化前样品处理 – 固体样品: 某一固体样品中的含氮量是 用100g该物质(干重)中所含氮的g数来 表示(％)。 – 固体样品105℃烘干至恒重。
• 用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至 室温后称重，按上述操作继续烘干样品。 每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量 数值不变，即达恒重。
CH2NH2COOH+3H2SO4
为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩 尔数)，计算出样品中的总氮量。
NH42B01O92/1+2/2H7Cl → HBO2+NH4Cl
滴定
三、试剂与器材
1、消化液：H2O2：H2S04 ：H2O=3：2：1 2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物
2019/12/27
– 若样品为液体(如血清等)，可取一定体 积样品直接消化测定。
2019/12/27
• 取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠; • 1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂200
2、消化
mg，消化液5 mL。3及4号瓶中各加相 加样时应直接送人瓶底，不 同量的催化剂和消化液-----对照，以测 要沾在瓶口和瓶颈上。
定试剂中可能含有的微量含氮物质。
消化开始时应控制火力，不使液体
冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开
始分解并放出SO2白烟后，适当加强火 力消化，直至消化液呈透明淡绿色。
• 定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加 随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次， 洗液并入容量瓶，定容。
1.凯氏烧瓶 2.凯氏定氮仪 3.分析天平 4.酸式滴定管 5.烘箱 6.消化炉 7.容量瓶
等等
四、操作方法
1. 消化前样品处理 – 固体样品: 某一固体样品中的含氮量是 用100g该物质(干重)中所含氮的g数来 表示(％)。 – 固体样品105℃烘干至恒重。
• 用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至 室温后称重，按上述操作继续烘干样品。 每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量 数值不变，即达恒重。
CH2NH2COOH+3H2SO4
5实验五 凯氏定氮法检测食品中蛋白质含量
黄山学院教案
周次 课题 重点 难点 教学 目标 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴 定及蛋白质含量计算等。 教学 方法 教学 手段 1．要求学生实验前认真预习实验内容，实验前教师检查并批改预 习报告，了解学生预习情况。 2．实验前先进行重点的讲解和示范基本操作、实验步骤中的注意 事项，实验过程中巡回指导。
1
教 学 过 程
三、实验步骤 1、样品消化 称取乳粉约 0.3g（±0.001g） ，移入干燥的 100mL 凯氏烧瓶中，加入 0.2g 硫酸铜 和 6g 硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入 20mL 浓硫酸，将瓶以 450 角斜支于有 小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物 全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续 加热 0.5h，取下放冷，小心加 20mL 水，放冷后，无损地转移到 100mL 容量瓶中，加 水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。 试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法 进行消化，冷却，加水定容至 100mL，得试剂空白消化液。 2、定氮装置的检查与洗涤 检查微量定氮装置是否装好。 在蒸气发生瓶内装水约三分之二， 加甲基红指示剂数 滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 测定前定氮装置如下法洗涤 2~3 次： 从样品进口入加水适量 （约占反应管三分之一 体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子 a，使反应管中的废 液倒吸流到反应室外层，打开夹子 b 由橡皮管排出，如此数次，即可使用。 3、碱化蒸馏 量取硼酸试剂 20mL 于三角瓶中，加入混合指示剂 2~3 滴，并使冷凝管的下端插 入硼酸液面下，在螺旋夹 a 关闭，螺旋夹 b 开启的状态下，准确吸取 10.0mL 样品消化 液，由小漏斗流入反应室，并以 10mL 蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。 使 10mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即 将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹 a，关闭螺旋夹 b，开始蒸馏。通 入蒸汽蒸腾 10min 后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏 2min。然后用少量水 冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。
周次 课题 重点 难点 教学 目标 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴 定及蛋白质含量计算等。 教学 方法 教学 手段 1．要求学生实验前认真预习实验内容，实验前教师检查并批改预 习报告，了解学生预习情况。 2．实验前先进行重点的讲解和示范基本操作、实验步骤中的注意 事项，实验过程中巡回指导。
1
教 学 过 程
三、实验步骤 1、样品消化 称取乳粉约 0.3g（±0.001g） ，移入干燥的 100mL 凯氏烧瓶中，加入 0.2g 硫酸铜 和 6g 硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入 20mL 浓硫酸，将瓶以 450 角斜支于有 小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物 全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续 加热 0.5h，取下放冷，小心加 20mL 水，放冷后，无损地转移到 100mL 容量瓶中，加 水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。 试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法 进行消化，冷却，加水定容至 100mL，得试剂空白消化液。 2、定氮装置的检查与洗涤 检查微量定氮装置是否装好。 在蒸气发生瓶内装水约三分之二， 加甲基红指示剂数 滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 测定前定氮装置如下法洗涤 2~3 次： 从样品进口入加水适量 （约占反应管三分之一 体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子 a，使反应管中的废 液倒吸流到反应室外层，打开夹子 b 由橡皮管排出，如此数次，即可使用。 3、碱化蒸馏 量取硼酸试剂 20mL 于三角瓶中，加入混合指示剂 2~3 滴，并使冷凝管的下端插 入硼酸液面下，在螺旋夹 a 关闭，螺旋夹 b 开启的状态下，准确吸取 10.0mL 样品消化 液，由小漏斗流入反应室，并以 10mL 蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。 使 10mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即 将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹 a，关闭螺旋夹 b，开始蒸馏。通 入蒸汽蒸腾 10min 后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏 2min。然后用少量水 冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。
蛋白质的测定使用凯氏定氮法解说共44页文档
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境3、人生就像一杯没有 Nhomakorabea糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
蛋白质的测定使用凯氏定氮法解说 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
蛋白质含量的测定微量凯氏定氮法
实验结束后，应按照实验室规定正确处理废液。
实验准确性保证
1
确保使用的试剂和器具清洁无污染，避免误差。
2
在实验过程中，要严格控制反应温度和时间，确 保反应完全。
3
为保证准确性，建议进行多次重复实验，取平均 值。
实验失败的可能原因及解决方法
原因1
样品消化不完全。解决方法：检查样品是否符合要求，调整消化 条件（如温度、时间、试剂用量等）以确保消化完全。
原因2
蒸馏过程中出现故障。解决方法：检查蒸馏装置是否正常，确保冷 凝水畅通，及时排除故障。
原因3
滴定操作不当。解决方法：加强滴定操作训练，确保操作规范，减 小误差。
06
结论
微量凯氏定氮法的优缺点
优点
微量凯氏定氮法是一种准确、可靠的蛋白质含量测定方法，具有较高的精密度和准确度。该方法操作 简便，试剂用量少，适用于对样品量要求较小的实验。此外，微量凯氏定氮法还可以测定其他氮含量 较高的物质，如氨基酸、肽等。
价值
微量凯氏定氮法的应用价值主要体现在以下几个方面： 首先，在食品工业中，该方法可用于检测食品中蛋白质 的含量，确保产品的质量和安全；其次，在药品行业中 ，微量凯氏定氮法可用于检测药品中蛋白质的含量，保 证药品的质量和有效性；此外，在生物制品领域，该方 法可用于检测蛋白质药物的含量和纯度，为生物制品的 质量控制提供有力支持。因此，微量凯氏定氮法的应用 具有广泛的实际意义和价值。
结果的表示和误差分析
结果表示
测定结果以百分数表示，保留小数点后一位。
误差分析
误差来源可能包括试剂不纯、称样误差、滴定误差等，为减小误差，应选择高纯度试剂，提高称样精度，加强滴 定操作训练。
05
实验注意事项
实验准确性保证
1
确保使用的试剂和器具清洁无污染，避免误差。
2
在实验过程中，要严格控制反应温度和时间，确 保反应完全。
3
为保证准确性，建议进行多次重复实验，取平均 值。
实验失败的可能原因及解决方法
原因1
样品消化不完全。解决方法：检查样品是否符合要求，调整消化 条件（如温度、时间、试剂用量等）以确保消化完全。
原因2
蒸馏过程中出现故障。解决方法：检查蒸馏装置是否正常，确保冷 凝水畅通，及时排除故障。
原因3
滴定操作不当。解决方法：加强滴定操作训练，确保操作规范，减 小误差。
06
结论
微量凯氏定氮法的优缺点
优点
微量凯氏定氮法是一种准确、可靠的蛋白质含量测定方法，具有较高的精密度和准确度。该方法操作 简便，试剂用量少，适用于对样品量要求较小的实验。此外，微量凯氏定氮法还可以测定其他氮含量 较高的物质，如氨基酸、肽等。
价值
微量凯氏定氮法的应用价值主要体现在以下几个方面： 首先，在食品工业中，该方法可用于检测食品中蛋白质 的含量，确保产品的质量和安全；其次，在药品行业中 ，微量凯氏定氮法可用于检测药品中蛋白质的含量，保 证药品的质量和有效性；此外，在生物制品领域，该方 法可用于检测蛋白质药物的含量和纯度，为生物制品的 质量控制提供有力支持。因此，微量凯氏定氮法的应用 具有广泛的实际意义和价值。
结果的表示和误差分析
结果表示
测定结果以百分数表示，保留小数点后一位。
误差分析
误差来源可能包括试剂不纯、称样误差、滴定误差等，为减小误差，应选择高纯度试剂，提高称样精度，加强滴 定操作训练。
05
实验注意事项
蛋白质的测定—凯氏定氮法测定食品中蛋白质
食品中蛋白质的测定——凯氏定氮法
实验原理
• 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为 二氧化碳和水逸出样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵加碱蒸馏， 使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量 可计算出蛋白质的含量。
仪器
500ml凯 氏烧瓶
定氮蒸馏 装置
凯氏定氮法测食品中蛋白质的注意事项
（9）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，如高于40°C可置于冷 水浴中。
（10）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色， 在酸性溶液中呈红色。
课后思考
• 凯氏定氮法测定 食品中蛋白质还 有哪些需要注意？
常量蒸馏按下式计算: 微量蒸馏按下式计算：
W c(V2 V1 ) 0.014 F 100 m
W c(V2 V1 ) 0.0 1 4 F 1 0 0 m 10 100
食品中蛋白质的测定——凯氏定氮法
实验步骤——计算 • 式中W—蛋白质的质量分数，%； • c—盐酸标准液的浓度，mol/L； • V1—空白滴定消耗标准液量，mL； • V2—试剂滴定消耗标准液量，mL； • m—样品质量，g； • 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； • F—蛋白质系数。
• 凯氏定氮步骤包括消化、蒸馏、 吸收、滴定、计算。
凯氏定氮法测食品中蛋白质的注意事项
（1）凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量为粗蛋白
（2）所有试剂应用无氨蒸馏水配制
（3）消化过程应注意转动凯氏烧瓶，促进消化完全 （4）若样品含脂肪或糖较多时，易产生大量泡沫可采用小火或者可加入 少量辛醇、液体石蜡或硅油等消泡剂 （5）控制消化时间 ，一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含 有特别难以氨化的氮化合物的样品，消化时间需适当延长；
凯氏定氮法测定蛋白质含量---教学设计.
蛋白质含量的计算
知识目标
了解测定蛋白质的基本原理
了解蛋白质的测定方法
掌握凯氏定氮法的原理
掌握凯氏定氮法的操作要点
态度素质目标
积极进取，勤于思考
团结协作、乐于奉献
教学重点
凯氏定氮法测定蛋白质的原理
教学难点
凯氏定氮法测定蛋白质的操作要点和计算方法
凯氏定氮法测定蛋白质的操作要点和计算方法
教学条件要求
教材、图片、视频、技术标准
考核与评价
课堂表现、作业
课件、图片
听讲、思考、讨论
实施
凯氏定氮法的原理、操作要点及注意思考、讨论
深化（加深对基本能力的认识与体会）
归纳
凯氏定氮法测定蛋白质的特点
引导
总结
凯氏定氮法测定蛋白质的操作要点及注意事项
讲授
听讲、思考
作业
请大家思考蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？
教学方法与手段
案例引入、讨论交流、启发引导等教学方法
借助图片、视频等多媒体手段
参考资料
食品分析与检验技术贾君中国农业出版社
教学内容设计
步骤
教学内容
教学方法
教学手段
学生活动
告知（教学内容、目的）
介绍凯氏定氮法测定蛋白质的方法
讲授
多媒体课件
引入（任务）
凯氏定氮法测定蛋白质的特点和适用范围
案例引入、讨论交流
《食品理化检测技术》课程教学设计
项目
食品中营养成分的检验
学时
30学时
任务
食品中蛋白质和氨基酸的测定
学时
6学时
知识点（技能点）
凯氏定氮法测定蛋白质含量
学时
2学时
知识目标
了解测定蛋白质的基本原理
了解蛋白质的测定方法
掌握凯氏定氮法的原理
掌握凯氏定氮法的操作要点
态度素质目标
积极进取，勤于思考
团结协作、乐于奉献
教学重点
凯氏定氮法测定蛋白质的原理
教学难点
凯氏定氮法测定蛋白质的操作要点和计算方法
凯氏定氮法测定蛋白质的操作要点和计算方法
教学条件要求
教材、图片、视频、技术标准
考核与评价
课堂表现、作业
课件、图片
听讲、思考、讨论
实施
凯氏定氮法的原理、操作要点及注意思考、讨论
深化（加深对基本能力的认识与体会）
归纳
凯氏定氮法测定蛋白质的特点
引导
总结
凯氏定氮法测定蛋白质的操作要点及注意事项
讲授
听讲、思考
作业
请大家思考蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？
教学方法与手段
案例引入、讨论交流、启发引导等教学方法
借助图片、视频等多媒体手段
参考资料
食品分析与检验技术贾君中国农业出版社
教学内容设计
步骤
教学内容
教学方法
教学手段
学生活动
告知（教学内容、目的）
介绍凯氏定氮法测定蛋白质的方法
讲授
多媒体课件
引入（任务）
凯氏定氮法测定蛋白质的特点和适用范围
案例引入、讨论交流
《食品理化检测技术》课程教学设计
项目
食品中营养成分的检验
学时
30学时
任务
食品中蛋白质和氨基酸的测定
学时
6学时
知识点（技能点）
凯氏定氮法测定蛋白质含量
学时
2学时
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❖ 若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶液, 使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入
三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋白质含量:
蛋白氮=总氮-非蛋白氮
任务五：试验器具的清洗整理
【拓展学习】
❖ 1、其他蛋白质测定方法——分光光度法 ❖ （1）原理
❖ 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与 硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中 与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与 标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收
❖ 子任务1：仪器及试剂的准备 ❖ 仪器：
10mL
100mL 3只
子任务1：仪器及试剂的准备
❖ 水蒸气发生器： ❖ 装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基橙指示剂
数滴及硫酸数ml，使水呈微红色→按上图所示搭好 装置
❖ 〖注意〗 ❖ ①装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。 ❖ ②在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml以使其
试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消 化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？
样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶 液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？ 须采用什么措施？
❖ 子项目二 ❖ 14酱油中氨基酸态氮的测定
（GB/T 5009.39-2003 ）
任务三：试验器具的清洗整理
3、试剂 除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其他试剂与常量测定相同。
4、优点 灵敏、准确、快速以及用量少
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
❖ 子任务1：仪器及试剂的准备 ❖ 仪器： ❖ 25mL酸式滴定管1套
❖ 试剂 ❖ 0.0500mol/L HCL标准溶液
子任务2：盐酸滴定
❖ 接收瓶 以HCL标准滴定液滴定 灰色终点
记录VHcl
（1）硼酸吸收 液的颜色
（2）吸收氨气 后的硼酸吸收液
的颜色
（3）盐酸滴定 终点的颜色
❖ 〖注意〗
❖ ①混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中 呈灰色,在酸性溶液中呈红色。
样品（2N
）
H
2SO 4 催化剂 消化
(NH
4
)
2
SO
4
NaOH 蒸馏
2NH
3
H3BO 3（ 吸收
NH 4 )2 B4O7
2HCL 滴定
结果处理
❖ 氨基酸～HCl～N ❖ 〖注意〗
❖ 此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶 啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。
❖ （2）特点
❖ 快速、污染少、操作简单、省时
❖ 国家标准测定蛋白质第二法
❖ 2、改良式凯氏装置
江苏畜牧兽医职业技术学院
泰州市质监局
❖ 3、自动凯氏定氮法
1.原理 同常量凯氏定氮法
2.主要仪器 自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸 收和滴定装置以及自动数字显示装置。 消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外加热装置组 合成的消化炉。
项目七 食品中蛋白质及氨基
酸态氮的测定
【学习目标】
❖ 1、掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换 算。
❖ 2、掌握凯氏定氮装置的搭建技术。 ❖ 3、掌握蛋白质的测定技术。
【基础知识】
❖ 1、蛋白质及氨基酸概述
❖ 蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物， 它主要含的元素是C、H、O、N。
❖ ⑥在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断 汽,否则会发生倒吸。
❖ ⑦蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟， 将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开， 最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。
❖ ⑧所用的试剂溶液 必须用无氨蒸馏水配制。
任务三：盐酸滴定
b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；
c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑 色沉淀
硫酸钾 提高溶液沸点，从而加快有机物分解
浓硫酸 氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2
子任务2：样品预处理
样品充分混匀
固体试样 0.2~2g 半固体试样 2~5g 液体试样 10~25g
直接消化
子任务3：样品称量、消化
❖ 〖注意〗 ❖ ①加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应
室内液体颜色
❖ 加碱足量的判断：
❖ 溶液会变成深蓝色或产生黑色沉淀
❖ 原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化 铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑 色的氧化铜沉淀。
❖ 如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需 要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。
❖ ②样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，为防止样液 中氨气逸出。一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要水 封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程 中要注意接头处有无松漏现象
❖ ③加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只 呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收 氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐 。
❖ 一般来说，pro的平均含氮量为16/100，既一份氮相当于 6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。
❖ 所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%乘上pro的 换算系数K=6.25即为该物质的pro含量。
❖ 注意： ❖ ①含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。 ❖ ②不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等
数
初读
数
末读 消耗 数 体积
加甲醛后
初读 数
末读 数
消耗 体积 V1
空白滴定 V2
1
2 氨基酸态氮含量X（g/100mL）= 平均值
精密度
2.样品中游离酸中和
❖ 吸取5mL试样→100mL容量瓶中→定容→混匀后吸取 20.0mL→200mL烧杯→加水60mL→插入酸度计的指示 电极和参比电极→开动磁力搅拌器→0.050mol/L氢 氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2→记录消耗 体积
3、适用范围
❖ 国家标准第一法 ❖ 适用于各种食品中蛋白质的测定
4、任务分解
❖ 任务一：湿法消化
❖ 任务二：碱法蒸馏
❖
硼酸吸收
❖ 任务三：盐酸滴定
❖ 任务四：数据记录与计算
任务一：湿法消化
❖ 子任务1：仪器及试剂的准备
❖ 仪器：
子任务1：仪器及试剂的准备
试剂
作用
硫酸铜
a催化作用：加速有机物的氧化分解。
❖ ②酸式滴定管的正确使用
任务四、数据记录与计算
项目名称
检测日期
样品名称
检验依据
内容
1
2
样品质量m/g
V初 /mL V终 / mL 消耗的体积V1 /mL 吸取消化液体积V3 /mL 蛋白质含量（g/100g）
平均值（g/100g）
两次测定之差/平均值
精密度Cy
3 空白
（g/100g） F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数6.38
为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为 5.70、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳 及其制品为6.38。
2、原理
❖ 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾 一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫 酸胺。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸 标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质 的含量。
❖ ④冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸 收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出，若超过时可置 于冷水浴中使用。
❖ ⑤检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法。原理:NH4+或 NH3遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如 NH4+或NH3含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄 色或棕红色的沉淀反应
凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）→加 硫酸炭化黑色→消化后红棕色→ 棕褐 色→消化终点蓝绿色/墨绿色→淡蓝色
（冷却后溶液） 反应室：深蓝色或黑色沉淀
紫红色→绿色
甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色→灰色 甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色→蓝紫色
❖ 凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测 定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及 含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白 质含量。
3.滴定样品中氨基酸酸基含量
❖ 上述烧杯→加入10mL甲醛溶液→混匀→再用 0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2→ 记录消耗体积V1
【拓展】
❖ 本法原理： ❖ 氨基酸含有酸性的-COOH和碱性的-NH2，它们相互作
用使氨基酸成为中性的内盐，不能直接用碱液滴定 它的羧基。当加入甲醛时，氨基与甲醛结合，其碱 性消失，使羧基显示出酸性，这样就可以用氢氧化 钠溶液滴定-COOH，并用间接法测定氨基酸的总量。
1.000g奶粉 0.2g硫酸铜 6g硫酸钾 20mL浓硫酸 玻璃珠
轻摇
小火加热炭化 至泡沫完全停止
大火加热 保持瓶中液体微沸
同时做试剂 空白试验
冷却 加20mL水 冷却
至蓝绿色澄清透明 继续加热0.5～1h
思考
❖ 1、玻璃珠的作用？ ❖ 2、小漏斗的作用？ ❖ 3、消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？ ❖ 4、开始消化时为什么用小火？ ❖ 5、消化液不易澄清透明时可采用的措施？ ❖ 6、消化完成时的产物？ ❖ 7、加20mL水的作用？ ❖ 8、空白试验的目的？
三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋白质含量:
蛋白氮=总氮-非蛋白氮
任务五：试验器具的清洗整理
【拓展学习】
❖ 1、其他蛋白质测定方法——分光光度法 ❖ （1）原理
❖ 食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与 硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中 与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm下测定吸光度值，与 标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收
❖ 子任务1：仪器及试剂的准备 ❖ 仪器：
10mL
100mL 3只
子任务1：仪器及试剂的准备
❖ 水蒸气发生器： ❖ 装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基橙指示剂
数滴及硫酸数ml，使水呈微红色→按上图所示搭好 装置
❖ 〖注意〗 ❖ ①装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。 ❖ ②在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂数滴及硫酸数ml以使其
试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消 化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？
样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶 液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？ 须采用什么措施？
❖ 子项目二 ❖ 14酱油中氨基酸态氮的测定
（GB/T 5009.39-2003 ）
任务三：试验器具的清洗整理
3、试剂 除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其他试剂与常量测定相同。
4、优点 灵敏、准确、快速以及用量少
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
❖ 子任务1：仪器及试剂的准备 ❖ 仪器： ❖ 25mL酸式滴定管1套
❖ 试剂 ❖ 0.0500mol/L HCL标准溶液
子任务2：盐酸滴定
❖ 接收瓶 以HCL标准滴定液滴定 灰色终点
记录VHcl
（1）硼酸吸收 液的颜色
（2）吸收氨气 后的硼酸吸收液
的颜色
（3）盐酸滴定 终点的颜色
❖ 〖注意〗
❖ ①混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中 呈灰色,在酸性溶液中呈红色。
样品（2N
）
H
2SO 4 催化剂 消化
(NH
4
)
2
SO
4
NaOH 蒸馏
2NH
3
H3BO 3（ 吸收
NH 4 )2 B4O7
2HCL 滴定
结果处理
❖ 氨基酸～HCl～N ❖ 〖注意〗
❖ 此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶 啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。
❖ （2）特点
❖ 快速、污染少、操作简单、省时
❖ 国家标准测定蛋白质第二法
❖ 2、改良式凯氏装置
江苏畜牧兽医职业技术学院
泰州市质监局
❖ 3、自动凯氏定氮法
1.原理 同常量凯氏定氮法
2.主要仪器 自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸 收和滴定装置以及自动数字显示装置。 消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外加热装置组 合成的消化炉。
项目七 食品中蛋白质及氨基
酸态氮的测定
【学习目标】
❖ 1、掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换 算。
❖ 2、掌握凯氏定氮装置的搭建技术。 ❖ 3、掌握蛋白质的测定技术。
【基础知识】
❖ 1、蛋白质及氨基酸概述
❖ 蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物， 它主要含的元素是C、H、O、N。
❖ ⑥在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断 汽,否则会发生倒吸。
❖ ⑦蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1分钟， 将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开， 最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。
❖ ⑧所用的试剂溶液 必须用无氨蒸馏水配制。
任务三：盐酸滴定
b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；
c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑 色沉淀
硫酸钾 提高溶液沸点，从而加快有机物分解
浓硫酸 氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2
子任务2：样品预处理
样品充分混匀
固体试样 0.2~2g 半固体试样 2~5g 液体试样 10~25g
直接消化
子任务3：样品称量、消化
❖ 〖注意〗 ❖ ①加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应
室内液体颜色
❖ 加碱足量的判断：
❖ 溶液会变成深蓝色或产生黑色沉淀
❖ 原理：过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化 铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑 色的氧化铜沉淀。
❖ 如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需 要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。
❖ ②样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，为防止样液 中氨气逸出。一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要水 封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程 中要注意接头处有无松漏现象
❖ ③加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收，因为硼酸只 呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收 氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐 。
❖ 一般来说，pro的平均含氮量为16/100，既一份氮相当于 6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。
❖ 所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮%乘上pro的 换算系数K=6.25即为该物质的pro含量。
❖ 注意： ❖ ①含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。 ❖ ②不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等
数
初读
数
末读 消耗 数 体积
加甲醛后
初读 数
末读 数
消耗 体积 V1
空白滴定 V2
1
2 氨基酸态氮含量X（g/100mL）= 平均值
精密度
2.样品中游离酸中和
❖ 吸取5mL试样→100mL容量瓶中→定容→混匀后吸取 20.0mL→200mL烧杯→加水60mL→插入酸度计的指示 电极和参比电极→开动磁力搅拌器→0.050mol/L氢 氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2→记录消耗 体积
3、适用范围
❖ 国家标准第一法 ❖ 适用于各种食品中蛋白质的测定
4、任务分解
❖ 任务一：湿法消化
❖ 任务二：碱法蒸馏
❖
硼酸吸收
❖ 任务三：盐酸滴定
❖ 任务四：数据记录与计算
任务一：湿法消化
❖ 子任务1：仪器及试剂的准备
❖ 仪器：
子任务1：仪器及试剂的准备
试剂
作用
硫酸铜
a催化作用：加速有机物的氧化分解。
❖ ②酸式滴定管的正确使用
任务四、数据记录与计算
项目名称
检测日期
样品名称
检验依据
内容
1
2
样品质量m/g
V初 /mL V终 / mL 消耗的体积V1 /mL 吸取消化液体积V3 /mL 蛋白质含量（g/100g）
平均值（g/100g）
两次测定之差/平均值
精密度Cy
3 空白
（g/100g） F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数6.38
为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为 5.70、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳 及其制品为6.38。
2、原理
❖ 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾 一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫 酸胺。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸 标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质 的含量。
❖ ④冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸 收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出，若超过时可置 于冷水浴中使用。
❖ ⑤检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法。原理:NH4+或 NH3遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如 NH4+或NH3含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄 色或棕红色的沉淀反应
凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）→加 硫酸炭化黑色→消化后红棕色→ 棕褐 色→消化终点蓝绿色/墨绿色→淡蓝色
（冷却后溶液） 反应室：深蓝色或黑色沉淀
紫红色→绿色
甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色→灰色 甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色→蓝紫色
❖ 凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测 定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及 含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白 质含量。
3.滴定样品中氨基酸酸基含量
❖ 上述烧杯→加入10mL甲醛溶液→混匀→再用 0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2→ 记录消耗体积V1
【拓展】
❖ 本法原理： ❖ 氨基酸含有酸性的-COOH和碱性的-NH2，它们相互作
用使氨基酸成为中性的内盐，不能直接用碱液滴定 它的羧基。当加入甲醛时，氨基与甲醛结合，其碱 性消失，使羧基显示出酸性，这样就可以用氢氧化 钠溶液滴定-COOH，并用间接法测定氨基酸的总量。
1.000g奶粉 0.2g硫酸铜 6g硫酸钾 20mL浓硫酸 玻璃珠
轻摇
小火加热炭化 至泡沫完全停止
大火加热 保持瓶中液体微沸
同时做试剂 空白试验
冷却 加20mL水 冷却
至蓝绿色澄清透明 继续加热0.5～1h
思考
❖ 1、玻璃珠的作用？ ❖ 2、小漏斗的作用？ ❖ 3、消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？ ❖ 4、开始消化时为什么用小火？ ❖ 5、消化液不易澄清透明时可采用的措施？ ❖ 6、消化完成时的产物？ ❖ 7、加20mL水的作用？ ❖ 8、空白试验的目的？