注意事项目的要求了解密度梯度离心分离原理
高中生物 实验二 密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光观察
叶
绿 体
叶 脉
叶 肉 细 胞
菠菜叶横切图（10×40）
保卫细胞
叶绿体
菠菜表皮细胞
（匀浆后，示表皮细胞、保卫细胞、叶绿体。 10×40）
蔗糖梯度离心分离菠菜叶绿体（10×40）
菠菜叶肉细胞、表皮细胞（匀浆后10×40）
（叶绿体浓度过大）
荧光显微镜的光路及主要部件
光源 激发光挡片 激发光滤色镜 分色镜
实验二 密度梯度离心法分离提 纯叶绿体及叶绿体荧光观察
一、实验目的
学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶 绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。
二、实验原理
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗 粒的大小、形状和密度，也同离心力以及 悬浮介质的粘度有关；
用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在 离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小 的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降 系数较大的细胞组分沉到离心管底部， 这样，可粗 器材：光学显微镜、台式高速冷冻离心机，
研钵、剪刀、托盘、玻皿等 3. 试剂： （1）匀浆介质（0.25 mol/L蔗糖、
0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液，pH7.4） （2）50%蔗糖溶液，（3）15%蔗糖溶 液。
四、实验步骤
1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、 主脉后，称取2~3g，剪碎置研钵中。
2. 加入10ml匀浆介质于研钵中，研磨成糜状。 3. 用双层纱布过滤捣碎液到烧杯中。 4. 将滤液倒于离心管内，500rpm离心10min，
轻轻吸取上清液。
5. 先将50%蔗糖溶液0.4ml加入离心管，再取 15%蔗糖溶液0.4ml小心沿管壁缓缓注入， 不能搅动50%蔗糖液面，使两种溶液界面 可见，制成密度梯度。
6. 加入0.4ml上清液，严格平衡离心管后，用 水平转头8000r/min离心，20min。
密度梯度离心法的原理解析
密度梯度离心法的原理解析密度梯度离心法是一种广泛应用于生物化学、分子生物学和医学领域的实验技术，用于分离和纯化生物大分子、细胞和次细胞结构。
该方法基于样品中不同组分的密度差异，利用离心力和密度梯度分离的原理来实现。
密度梯度离心法的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. 密度梯度制备：制备一个由多个密度层构成的梯度液体。
这些密度层是根据密度逐渐增加或减少排列的，通常由离心管或离心管中的夹层形成。
常用的密度梯度制备物质包括蔗糖、葡萄糖或碘化物等。
2. 样品处理：将待分离的样品加入到密度梯度中。
样品可以是生物大分子如蛋白质、核酸或多肽，也可以是细胞或次细胞结构如细胞核或线粒体等。
3. 离心分离：通过高速离心设备，施加离心力将密度梯度中的样品分离。
离心过程中，样品中的各个组分受到的离心力不同，根据其密度的差异在密度梯度中上下移动。
离心力越大，移动距离越远。
4. 提取和分析：离心分离后，不同密度层中的组分被提取出来，然后进一步进行分析。
这可以是采用分光光度法、蛋白质电泳、质谱分析或核酸杂交等技术。
通过分析不同密度层中的组分，可以获取样品中各种生物大分子或细胞结构的纯度和数量信息。
密度梯度离心法的优点是可以实现高分辨率和高效率的分离和纯化。
这是因为，不同密度的组分在离心力的作用下可以根据其密度差异均匀地分布在梯度液体中，从而实现准确分离。
该方法对样品体积和细胞大小没有特别严格的要求，适用于分离和研究多种不同类型的生物样品。
密度梯度离心法还可以用于研究细胞功能和结构的多个方面。
它可以用于分离不同亚细胞器如线粒体、内质网和高尔基体等，进一步研究它们的功能和组成。
该方法还可用于分离和纯化蛋白质复合物、染色体和病毒等，为进一步研究它们的生理和生化特性提供有力的工具。
总结和回顾上述内容，密度梯度离心法是一种基于样品中不同组分密度差异的分离和纯化技术。
它可以通过制备密度梯度、施加离心力和分析不同密度层中的组分来实现。
该方法具有高分辨率、高效率和广泛适用性的优点，可用于研究多种生物样品的分离和纯化，以及细胞和亚细胞结构的功能和组成研究。
密度梯度离心的原理是
密度梯度离心的原理是密度梯度离心是一种常见的离心技术，用于分离混合物中的不同组分。
它基于不同组分具有不同密度的原理，通过离心力将混合物分离出不同密度的组分。
密度是物质的质量与体积的比值，密度梯度则是指物质密度随着位置的变化而产生的梯度。
在密度梯度离心中，首先需要制备一个密度梯度溶液。
这种溶液由稀释剂和梯度形成剂组成，梯度形成剂具有不同浓度以及因而不同的密度。
通过调整梯度形成剂的浓度，可以得到具有不同密度梯度的溶液。
当样品被放置在密度梯度离心管中时，样品中的组分会在离心过程中根据其密度分布在不同位置。
由于组分在溶液中的密度与梯度形成剂产生的密度梯度相匹配，所以不同组分会沉降到与其密度相匹配的位置上。
离心力是实现密度梯度离心的关键。
通过高速旋转离心机，样品受到离心力的作用，产生向外的惯性力，导致组分发生沉降。
离心力的大小取决于旋转速度和离心机的半径。
根据斯托克斯法则，离心力可以表示为Fc=ω^2r^2ρ/9η，其中Fc为离心力，ω为角速度，r为离心机的半径，ρ为样品的密度，η为溶液的粘度。
根据这个公式，可以调整离心力的大小，以实现样品中不同组分的分离。
离心过程中，沉降速度与组分的密度相关。
密度较大的组分会沉降得更快，而密度较小的组分则沉降得更慢。
当离心结束后，根据不同沉降位置可以将样品分为不同的组分。
通常，离心机设有取样管，可以分别收集不同位置的组分。
密度梯度离心广泛应用于生物化学、分子生物学、细胞生物学等领域。
例如，在蛋白质纯化中，可以根据蛋白质的密度将其与其他杂质分离。
此外，密度梯度离心还可以用于分离细胞、核酸、病原体等。
它是一种快速、高效的分离方法，对于复杂样品的分析具有重要意义。
总结起来，密度梯度离心的原理是根据不同组分具有不同密度的特点，通过离心力将混合物分离成密度不同的组分。
旋转离心机产生的离心力使不同组分按照密度沉降到不同的位置，最终实现分离。
密度梯度离心在科学研究和实际应用中发挥着重要作用。
ficoll密度梯度离心法
ficoll密度梯度离心法ficoll密度梯度离心法是用于细胞分选的一种分离技术，它借助于物体表面质量和密度梯度来达到有效分离细胞的目的。
它具有高灵敏度、可同时分离多种细胞、保护细胞结构完整和特异性高等特点，因而在细胞分选方面被广泛应用。
ficoll密度梯度离心法的原理及其详细的实施步骤，以及其在细胞分选中的广泛应用，本文要讨论和介绍。
一、ficoll密度梯度离心法的原理ficoll密度梯度离心法是一种细胞分选技术，用于不同细胞之间的分离。
该方法借助于细胞质量和密度梯度的差异来达到分离效果。
首先，在试管内容入一定量的细胞样本，并在此基础上配制密度梯度介质（如ficoll），使梯度介质有一定的密度重要，随后将其放入离心机中离心，由于细胞质量不同，会根据梯度的上下限，在密度梯度中的不同位置定位并被受力分离开。
最后，比较轻的细胞会停留在梯度的上端，而比较重的细胞则被受力推动而离开密度梯度，并落入下层。
由此可见，ficoll密度梯度离心法是利用细胞质量和密度梯度差异来进行的分离，是一种非常有效的细胞分选技术。
二、ficoll密度梯度离心法的实施步骤（一）准备介质首先，进行ficoll密度梯度离心时，需要准备好梯度介质，一般采用ficoll-paque溶液，可以根据不同的应用需求选择不同的ficoll组合。
在使用ficoll梯度介质之前，需要先进行稀释，以确保其最终浓度与所需要的目标密度梯度相匹配。
（二）均质接下来，在准备好的ficoll梯度介质中，将样本液按照一定体积加入，并缓缓搅拌均匀，使样本液完全渗透到ficoll梯度介质中，以保证系统在离心前可以得到均匀的梯度介质。
（三）离心将准备好的细胞滴定液置入离心机中，根据实验需要设定离心力度和时间，使其能够在较短时间内完成离心。
（四）细胞回收当离心运行完毕后，在离心管的各层中可分离到不同的细胞。
然后，可以分别收集不同层的细胞，以便进行进一步的分析。
三、ficoll密度梯度离心法的广泛应用ficoll密度梯度离心法借助于物体表面质量和密度梯度的差异，可以进行有效的细胞分离。
密度梯度离心（density
密度梯度离⼼（density gradient centrifuge）⼀、概论在密度梯度离⼼中单⼀样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。
梯度液的密度随着离⼼本经的增⼤⽽增加。
密度梯度可以予形成，也可以在离⼼过程中⾃形成，经常，密度梯度的可以分为：速率⼀区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离⼼。
在速率⼀区带离⼼中混合样品的以很薄的⼀层铺在梯度液的上部，在离⼼过程中由于不同组份"颗粒"在梯度液中沉降速率的差别，⽽在离⼼的某⼀时刻形成了数个含左第⼀级份颗粒的"区带"。
离⼼过程在最垂"的样品（或者说沉降得最快的样品）形成沉殿前就停⽌了。
样品在离⼼后与梯度液⼀起收集，⽤常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。
每个单⼀组份的沉降速率取决于它们的形状、尺⼨、密度、离⼼⼒的⼤⼩、梯度液的密度和粘性系数。
对于相类似的⽣物体组份常常形状也相似。
在速率区带离⼼中我们常常使梯度液的最⼤密度不超过样品在该梯度中浮密度。
利⽤这类⽣物组份在尺⼨上的差异的形成的沉降速率的不同，选择某⼀特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停⽌离⼼即可以达到分离⽬的。
与速率⼀区带离⼼法不同的是，等密度离⼼是依赖于样品颗粒的不同密度来进⾏离⼼分离的。
混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚⾄和梯度液混在⼀起。
最后⼀种⽅法依靠离⼼⼒来形成梯度（⾃形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单⼀成份向它们⾃⼰的等密度区靠扰即达到了分离纯化的⽬的。
对于速率⼀区带离⼼，梯度液最⼤密度⼀般⼩于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉殿后来分离样品；⽽等密度离⼼法中，梯度液的初始最⼤密度常常超过样品各组份的密度，利⽤每个单⼀组份沉降或上浮到它们各⾃的等密度区来达到分离的⽬的。
密度梯度离⼼法的理论依据是（参考⽂献1）每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r式中V是某⼀时刻样品的沉降速度（厘⽶/秒）d：样品颗粒的直径（厘⽶），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。
密度梯度离心实验报告
实验一密度梯度离心法提取叶绿体[实验项目]密度梯度离心法提取叶绿体[实验目的]掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
[实验原理]不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。
用不同浓度的蔗糖制成浓度梯度，在离心条件下，叶绿体和比他沉降系数小的细胞组分会聚集中到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分则沉淀到离心管底部，这样可粗略的分离叶绿体。
[实验仪器设备]超速冷冻离心机（BECKMAN L8-60MR）一台荧光显微镜（(Olympus，FX-35WA，Japan)）一台组织捣碎机一台[实验材料]新鲜菠菜叶片[实验药品]匀浆介质(0.25mol/L蔗糖，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液 pH 7.4)；称取88.55g 蔗糖，6.05g Tris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约4.25ml 0.1mol/L HCl，最后定容至1000ml。
60%蔗糖溶液，50%蔗糖溶液，40%蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液。
[实验内容]1、洗净菠菜叶片，沥干水分，去除叶柄、主脉，称取50g，剪碎。
2、加入预冷到0℃的匀浆介质200ml，用组织捣碎机高档捣碎2min。
3、捣碎液双层纱布过滤到烧杯中。
4、滤液500r/min离心5min，轻取上清液。
5、在Polyallomer离心管内一次加入50%和15%蔗糖溶液（或依次加入60%，40%，20%，15%蔗糖溶液），注意要用滴管吸取15%蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50%蔗糖液面，一般两种溶液各加12ml（四个梯度各加6ml），加液完成后，可见两种溶液接口处折光稍有不同，这样密度梯度便制好了。
6、在制好的密度梯度上小心的沿着管壁加入3ml粗离心过的上清液。
7、严格平衡离心管，分量不足加入少许上清液。
8、用甩平转头离心（18000r/min）90min。
9、取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴于载玻片，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。
密度梯度离心的原理
密度梯度离心的原理密度梯度离心，听起来是不是有点高大上呢？其实呀，它的原理就像一场超级有趣的分层大派对。
咱先想象一下，有一个长长的管子，就像一个特别的游乐场滑梯管道。
这个管道里面呢，装着一种特殊的东西，叫做密度梯度介质。
这密度梯度介质啊，就像是不同浓度的糖水混合在一起，从下往上，浓度是逐渐变化的，就像在滑梯里从上到下铺了一层一层不同软硬度的棉花糖一样。
然后呢，我们把要分离的样品放进去。
这些样品里的小颗粒们就像是一群调皮的小娃娃，它们有着不同的密度。
密度大的小娃娃呢，就像那些比较重的小铁球，在这个密度梯度的“游乐场”里，它们就会拼命地往下钻。
为啥呢？因为下面的密度梯度介质浓度高，就像是比较厚的棉花糖层，能托住它们这些“小铁球”。
而那些密度小的小颗粒呢，就像是轻飘飘的小羽毛，它们在这个“游乐场”里就只能待在比较上面的地方，因为下面的“棉花糖”对它们来说太硬啦，它们只能在比较松软的“棉花糖”层里晃悠。
打个比方啊，就好像一群小动物要找自己的家。
有大象、有小鸟。
大象很重很大，它就会去那些能承受它重量的、比较坚实的地方，就像密度大的小颗粒会到密度梯度大的地方。
小鸟很轻很小，它就只能待在比较轻柔的地方，就像密度小的小颗粒在密度小的介质层里。
而且哦，这个过程是很温和的。
这些小颗粒们不是被粗暴地分开，而是慢慢地、自然而然地就找到自己的位置了。
就像在一场自由选择的舞会上，每个小颗粒都能找到最适合自己的舞池角落。
再从微观一点的角度看呢，这些小颗粒在这个密度梯度的环境里，受到的力是很微妙的。
密度大的颗粒受到的向下的力，和周围介质对它的浮力、阻力等等这些力相互作用，最后就使得它稳稳地落在下面。
而密度小的颗粒呢，它受到的力的组合就会让它待在上面。
这密度梯度离心啊，在好多地方都特别有用呢。
比如说在生物学里，要把细胞里的不同细胞器分开，就可以用这个方法。
就像把细胞这个小家庭里的不同成员，按照它们的“体重”和“性格”（也就是密度啦）分开一样。
密度梯度离心分离的原理和应用
密度梯度离心分离的原理和应用密度梯度离心分离，这个名字听上去有点高深莫测，其实嘛，简单来说，就是利用不同物质的密度差异，来实现分离的一种科学方法。
就像我们平常在家里洗水果时，把泥土和水分开一样。
想象一下，咱们把一个装满果汁的瓶子放进冰箱，果汁底下沉淀的那一层，正是因为密度不同而形成的。
在科学的世界里，这种现象被充分利用了。
得聊聊原理。
密度梯度离心分离的关键就是离心力和密度梯度的结合。
咱们知道，离心机就像个疯狂的旋转木马，把样品放进去，它就开始转，越转越快。
重的东西往下沉，轻的东西则停在上面。
科学家们利用这一点，设计了含有不同密度的液体的离心管。
想象一下，一个七彩的果汁瓶，底层是浓浓的糖水，上面是清清的水，再往上是淡淡的果汁。
离心一转，不同的液体就像被分开的小伙伴一样，乖乖待在各自的位置。
这项技术的应用可广泛了，咱们常见的就是在生物实验室里，科学家们用它来分离细胞、DNA和蛋白质。
比如说，研究人员想要提取某种特定的细胞，就可以通过这种方式，把其他细胞“踢出去”。
想象一下，一群小细胞在舞池里跳舞，突然DJ开了个大特效，轻的细胞飘起来，重的则被压在地上，最后咱们只留下一群想要的“舞者”。
太酷了吧！密度梯度离心分离在医学领域也是个明星。
咱们都知道，血液里面有红细胞、白细胞和血小板。
科学家们就可以通过这种方法，把它们分开，搞清楚血液里到底发生了什么。
这就像是咱们在参加聚会时，想知道谁在角落里悄悄说话，谁又在热闹的舞池里疯狂嗨。
通过分离，咱们能获得更纯净的样品，更好地进行研究。
更有意思的是，在生物技术行业，这种分离方法也被用来筛选优质的细胞系。
想象一下，科学家们就像农夫一样，在一片田地里筛选出最好的种子，然后精心培育。
密度梯度离心就像那把筛子，把劣质的细胞“筛”出去，让优质的细胞留下来。
这可是为了发展新药、治疗疾病，做出的重要贡献。
密度梯度离心的魅力可不仅仅在于分离，还是一种探索的工具。
许多研究者用它来探寻生命的奥秘，揭开细胞的神秘面纱。
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21 目的要求 2 实验原理 3 材料用具 4 操作方法 5 注意事项 5
目的要求
了解密度梯度离心分离原理，了解DNA粗提方法。 掌握密度梯度离心制作过程及方法。
原理
在较大的离心力作用下，不同的DNA 由于其大小、形状 和密度不同，而悬浮在不同密度的位置上，从而达到分离。
核酸分子中的碱基含有共轭双键，具有一定的紫外吸收特 性，其最大吸收峰的波长为260nm。在波长为260nm，光程 为1cm，A260＝1时，相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单 链DNA为40μg/mL。紫外分光光度法可用于测定浓度大于 0.25μg/mL的核酸浓度。 DNA浓度计算公式：C（μg/mL）＝40μg/mL×1/光程×A260 ×
材料用具
新鲜的鸡肝
生理盐水（冷）、5%十二烷基磺酸钠溶液、45%乙醇、95%乙醇（冷）、 乙醇（冷）、丙酮（冷）、氯化钠粉末、5%、10%、20%、30%蔗糖溶 液（5%蔗糖溶液配制：称取蔗糖5g溶于100mL 蒸馏水液中，加5g活性 炭，于沸水浴中加热25min，过滤取清液）
离心机、灭菌离心管（10mL）、烧杯（1L）、大三角瓶、 筒、匀浆机、1.0mL注射器、超速离心机、No.22针头、紫 度计等。
C（μg/mL）＝40μg/mL×1/光织捣碎机捣碎的时间不可过长。
思考 题
为什么所用离心管等器皿必须灭菌？ 蔗糖密度梯度在离心中起什么作用？
DNA
样品 制备
（3）精制：将粗品DNA溶于适量蒸馏水，加 入5％的十二烷基磺酸钠，用1/10体积45％ 乙醇作溶剂，搅拌0.5h,经5000r/min离心 15min，上清液中加入NaCl至终浓度1 mol/ L，再缓慢加入冷95％乙醇，DNA析出。
（4）样品制备：取上述DNA溶于适量蒸馏水 中，用紫外分光光度计测其含量。备用。
梯度 溶液 的分 部收
集
离心后，取出离心管，置于冷室中。 用No.22针头将聚乙烯离心管底部正 中位置穿刺，梯度溶液慢慢流出。用 小试管将流出的梯度溶液分部收集， 每管25滴。
DNA 浓度 测定
用适量双蒸水稀释收集的样品，用紫 外分光光度计测定各管DNA样品的 A260，根据公式计算DNA浓度。
DNA
样品 制备
（1）组织破碎：取一定量的新鲜的鸡肝，加4 倍量生理盐水，经组织捣碎机捣碎l min， 匀浆，2500r/min离心30min,沉淀用同样体 积生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将 沉淀物悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再 捣碎3min。
（2）除杂蛋白：上述组织液中加入2倍量5％ 的十二烷基磺酸钠，用45％乙醇作溶剂， 搅拌20～30min,在0℃，2500r/min离心， 收集上清液并加入等体积的冷95％乙醇， 离心即可得到纤维状DNA。
蔗糖 密度 梯度 溶液 的制 备
将5%、10%、20%、30%蔗糖溶液各10mL，按
浓度依次减小的顺序逐个铺入离心管中即制 成不连续阶梯密度梯度。此离心管于2025℃静置2--3h，通过重力作用即成接近线 性的连续密度梯度液。若用细铁丝轻敲离心 管，静置时间可以缩短至0.5～1h。温度低 时所需静置时间较长，温度高时则较短。为 减少对流，静置后应将离心管置冰浴中备用。
（1）在每个离心管内的梯度溶液表面，分别
加入1.0mL DNA样品溶液。加样时，用注
梯
射器吸入样品，在梯度溶液表面上方
度
0.5mm左右，沿管壁慢慢加入。不允许自
离
由滴落，也不允许针头接触梯度液面。
心
（2）装好样品后，小心拧紧离心管帽，装好
套筒、转头，按使用程序启动超速离心机，
在0℃以25000r/min离心分离1～3h。