烟草转化方法及各类培养基配方
表1 烟草转化中使用培养基
Table.1 List of the culture mediums in genetic transformation of tobacco
培养基
Culture medium 成分
ingredients
pH值
pH
继代培养基
Subculture medium MS 5.8 共生培养基（To）
Symbiotic culture medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA 5.8 筛选培养基（To＋）
Sifting medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 壮芽培养基（P8＋）
Budding selection medium MS+0.1mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 生根培养基（1/2MS＋）
Rooting medium 1/2MS+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 注：cef：头孢霉素，kam：卡那霉素； Note: cef: cefotaxime；kan: Kanamycin
MS基础培养基配方：（1L的配方）1/2 MS基础培养基配方：（1L的配方）MS 大量：50ml MS 大量：25ml
MS 微量：5ml MS 微量：2.5ml
MS 铁盐：5ml MS 铁盐：5ml
MS 有机：5ml MS 有机：5ml
糖：30g 糖：30g
琼脂：7.5g 琼脂：7.5g
6-BA母液浓度：0.5mg/ml
NAA母液浓度： 0.5mg/ml
Cef（头孢霉素）母液浓度：200mg/ml
Kam（卡那霉素）母液浓度：100mg/ml
注意：高温会导致Cef（头孢霉素）和Kam（卡那霉素）分解，因此需要在培养
基灭菌冷却后再在超净工作台内加入。
LB培养液配方：（1L的配方）
NaCl 10g （10g/L）
胰蛋白胨（TRYPTONE）10g （10g/L）
酵母提取物（YEAST EXTRACT）5g （5g/L）
LB固体培养基在液体配方的基础上1L加13g琼脂粉。
转基因烟草方法
2．材料与方法2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。
高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10gMS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。
挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。
活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。
取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。
加入100ml的MS0培养基，混匀。
2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。
将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。
然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
烟草茎段快繁实验报告
烟草茎段快繁实验报告一、实验目的通过烟草茎段快繁技术，培养和增殖烟草品种。
二、实验材料和方法1.实验材料：烟草茎段、MS培养基、植物生长调节剂（激素）、琼脂、蔗糖、高温恒温培养箱等。
2.实验方法：(1)实验前的准备工作：将烟草茎段从烟草植株中切取出来，并在无菌条件下进行消毒处理。
(2)消毒处理：将烟草茎段放入含有消毒剂（如酒精或漂白粉）的容器中，进行消毒处理，去除外表的细菌和真菌。
(3)培养基的配制：将MS培养基配制好，调整pH值，加入适量的蔗糖和琼脂。
(4)茎段培养：将消毒好的烟草茎段放入含有培养基的培养器中，培养条件为25-28摄氏度、光照强度为2200-4400勒克斯的高温恒温培养箱中。
(5)茎段增殖：培养一段时间后，将茎段移至新鲜的含有培养基的培养器中，继续培养。
(6)转入土壤：当茎段长出新的叶片和根系后，将其转入含有适量水分的植物培养土中。
三、实验结果经过烟草茎段快繁实验，观察到烟草茎段在培养基中有较好的生长表现。
起初，茎段的表面开始出现白色的细胞分裂斑点，并逐渐扩大。
之后，茎段的细胞开始分裂增多，并逐渐延伸出新的茎段与根系。
在适当的培养条件下，茎段的增殖速度较快，最终能够长出完整的植株。
四、实验讨论实验结果表明，烟草茎段快繁技术是一种有效的烟草繁殖方法。
烟草茎段在培养基中，通过细胞分裂增殖的方式，逐渐延伸出新的茎段与根系，最终形成完整的植株。
同时，培养基的成分和环境条件对茎段的生长和增殖也有很大的影响。
如培养基中的营养物质和激素的浓度、pH值和温度等，都会影响茎段的生长速度和根系的发育情况。
五、实验总结烟草茎段快繁技术是一种非常有潜力的烟草繁殖方法，可以大大加快烟草的繁殖速度和品种的培育过程。
通过合理调配培养基成分和提供适宜的环境条件，可以进一步提高茎段的生长和增殖效果。
此外，烟草茎段快繁技术还可以应用于其他植物的繁殖和育种研究。
在今后的实验中，我们可以对培养基配制和培养条件进行进一步的优化，以提高繁殖效果和质量。
烟草的组织培养与植株再生
烟草的组织培养与植株再生作者：梁程李一鹏来源：《读天下》2017年第10期摘要：在MS培养基上，接种烟草无菌苗的叶片，分别放在光照和黑暗条件下诱导愈伤组织，接种于MS分化培养基上，在光照下分化再生植株。
结果表明：光照和植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导和植株再生产生影响。
关键词：烟草；愈伤组织；植株再生一、实验目的1. 掌握植物组织培养的方法和要点。
2. 学习培养基配制方法、步骤及叶片培养环节中，外植体灭菌、接种、培养观察等技术环节。
3. 了解外植体脱分化及再生过程。
二、材料与器材1. 植物材料：烟草叶片。
2. 实验药品：MS培养基、蔗糖、琼脂、升汞、NAA、6-BA、NaOH。
3. 仪器设备：高压灭菌锅、光照培养箱、天平、pH计、超经工作台、酒精灯。
4. 器械及用具：镊子、手术刀、记号笔等。
5. 玻璃器皿：培养瓶、量筒、容量瓶等。
三、实验步骤（一） MS培养基母液配制大量元素配成50倍母液，使用时每1L培养基需要从母液中取20mL。
配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最后加入Ca2+，混合时要边加边混合。
微量元素配成100倍母液，使用时每配制1L培养基从母液中取10mL，配制时应注意充分溶解后再依次混合。
铁盐单独配制，与其他元素混合易造成沉淀。
一般采用螯合铁，即FeSO4与EDTA钠盐的混合物，一般扩大100倍。
EDTA钠盐须用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75℃～80℃之间让其螯合1h。
使用螯合铁的目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应Fe2+。
有机物质可配成100倍浓缩液，使用时每1L培养基加10mL。
（本次实验采用培养基粉末代替较为方便）（二）培养基的配制取1000mL烧杯，先加入500mL的蒸馏水，然后根据培养基成分及用量，吸取各种母液加入烧杯，称取蔗糖（一般用量3%）、琼脂（一般6～8g/L），按需要的浓度加入植物激素，加水至800mL，加热使琼脂融化，定容到1000mL，用1NNaOH或HCl调pH至5.8。
烟草遗传转化体系的建立
本科生毕业设计（论文）（ 2015届）农业与食品科学学院题目：烟草遗传转化体系的建立学号：姓名：专业班级：2015 年 5 月18 日本科生毕业设计（论文）诚信承诺书我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）《烟草遗传转化体系的建立》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。
承诺人（签名）：年月日目录本科生毕业设计（论文）.............................................................................................. 封1 本科生毕业设计（论文）诚信承诺书...................................................................................... 封2 1 前言. (1)1.1 农杆菌介导法 (1)1.2 基因枪法 (2)1.3 PEG法 (2)1.4 显微注射法 (2)2 材料与方法 (3)2.1 试验材料 (3)2.1.1 植物材料 (3)2.1.2 菌株和质粒 (3)2.2 试验方法 (3)2.2.1 农杆菌的制备 (3)2.2.2 叶片表面消毒 (3)2.2.3 预培养-侵染-共培养 (4)2.2.4 特美汀对农杆菌的抑制作用 (4)2.2.5 芽分化-卡那霉素浓度的测定 (4)2.2.6 根分化 (5)2.2.7 炼苗-移栽 (5)2.2.8 转基因植株的分子鉴定 (5)3 结果与分析 (6)3.1 农杆菌菌液侵染时间对转化效率的影响 (6)3.2 共培养时间对转化率的影响 (7)3.3 特美汀对根瘤农杆菌的抑菌效果 (7)3.4 卡那霉素浓度对烟草叶片外植体出愈率的影响 (8)3.5 转基因植株的分子鉴定 (8)4 讨论 (9)参考文献 (9)致谢 (11)烟草遗传转化体系的建立农业与食品科学学院农学111 吴春盛指导教师：郑志富摘要：利用农杆菌介导的转化法获得转基因植物,这是研究目的基因功能的一种有效方法。
亚细胞定位之烟草转化方法
亚细胞定位之烟草转化方法烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。
研究人员通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究或产生转基因烟草植株。
烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。
首先，需要构建一个携带外源基因的转化载体。
这个载体通常包含一个启动子、外源基因和终止子。
启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。
外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其他功能分子的序列。
构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将其导入烟草中。
烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。
其中，农杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。
首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。
接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。
经过一段时间的培养，将转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。
利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的定位。
常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。
荧光蛋白标记技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。
抗体标记技术则是将外源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外源基因的定位。
通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。
这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。
此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。
总结起来，烟草转化方法是利用烟草作为植物模型，将外源基因导入烟草中的方法。
通过亚细胞定位技术，可以了解外源基因在转基因烟草植株中的定位，进一步研究外源基因的功能和相互作用方式。
烟草转化方法为研究转基因植物提供了重要的工具和方法。
烟草转化方法及各类培养基配方
烟草转化方法及各类培养基配方表1 烟草转化中使用培养基Table.1 List of the culture mediums in genetic transformation of tobacco培养基Culture medium 成分ingredientspH值pH继代培养基Subculture medium MS 5.8 共生培养基（To）Symbiotic culture medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA 5.8 筛选培养基（To＋）Sifting medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 壮芽培养基（P8＋）Budding selection medium MS+0.1mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 生根培养基（1/2MS＋）Rooting medium 1/2MS+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 注：cef：头孢霉素，kam：卡那霉素；Note: cef: cefotaxime；kan: KanamycinMS基础培养基配方：（1L的配方）1/2 MS基础培养基配方：（1L的配方）MS 大量：50ml MS 大量：25mlMS 微量：5ml MS 微量：2.5mlMS 铁盐：5ml MS 铁盐：5mlMS 有机：5ml MS 有机：5ml糖：30g 糖：30g琼脂：7.5g 琼脂：7.5g6-BA母液浓度：0.5mg/mlNAA母液浓度： 0.5mg/mlCef（头孢霉素）母液浓度：200mg/mlKam（卡那霉素）母液浓度：100mg/ml注意：高温会导致Cef（头孢霉素）和Kam（卡那霉素）分解，因此需要在培养基灭菌冷却后再在超净工作台内加入。
LB培养液配方：（1L的配方）NaCl 10g （10g/L）胰蛋白胨（TRYPTONE）10g （10g/L）酵母提取物（YEAST EXTRACT）5g （5g/L）LB固体培养基在液体配方的基础上1L加13g琼脂粉。
烟草转化
2.11.1 播种烟草种子用70% 乙醇灭菌30 s，去掉乙醇，无菌水清洗一遍，再用2.5% 次氯酸钠表面消毒7 min，无菌水清洗3-4遍，然后播种于MS基本培养基中。
16 h 光( 50 μmol m-2 s-1)/8 h暗环境下25ºC生长，取4-5叶期左右大小的无菌苗叶片转化。
2.11.2农杆菌的活化和制备（1）用接种环蘸取-80ºC冰箱内保存的含有精氨酸脱羧酶基因的农杆菌涂抹在含50mg/ml Km 的LB平板上划线，放到28ºC的光照生化培养箱中暗培养1-2d；（2）当长出菌落后，用接种环挑取单菌落在含有相同浓度抗生素浓度的LB培养基上划线，放入生化培养箱中28ºC暗培养；（3）2-3d后，将培养基中长出的菌落用镊子刮入不含抗生素的液体MS培养基中，28ºC 200r/min 振荡培养1-2 h；（4）用分光光度计测定菌液的OD600值，并用液体MS稀释，直到OD600=0.4~0.6之间进行侵染。
2.11.3 烟草共培养取苗龄为60d左右烟草的无菌、健壮的、去主脉并用镊子切成5×5cm的叶盘，将其浸入到已经培养好的农杆菌菌液中进行侵染9-12min左右。
然后倒掉菌液，将叶片放到灭菌过的滤纸上吸干菌液，将吸干的叶盘背面朝下，放在放有滤纸的共培养基中进行暗培养3d。
2.11.4选择筛选培养共培养结束后，先用含有400mg/ml头孢霉素的灭菌水清洗叶盘2-3次，用灭菌的滤纸吸干叶盘表面的水分，将叶盘放在筛选培养基中进行筛选培养，一般每周继代一次。
2.11.5生根培养在筛选培养基中筛选2-3周以后，叶盘的周围会分化出抗性芽，当抗性芽长到2-3cm大时，用镊子切下放在生根培养基中进行生根培养。
表15 烟草转化培养基配方Table 15 Culture media used in transgenic tabacco培养基名称组分及含量Km（100mg/ml）将km粉末用水溶解，过滤灭菌，-20℃保存Cef (400mg/ml) 将Cef粉末用水溶解，过滤灭菌，-20℃保存MS基本培养基大量100ml/L，微量10ml/L，甘氨酸10ml/L，肌醇10ml/L，铁盐10m/L，VB 10ml/L，蔗糖35g/L，定容至1L，调PH值5.8共培养培养基MS基本培养基+ 6-BA （2.25mg/L）+ NAA (0.3mg/L)筛选培养基MS基本培养基+ 6-BA (2.25mg/L) + NAA(0.3mg/L) + Km(100mg/L)+ Cef(400mg/L)生根培养基MS基本培养基+ NAA(0.3mg/L) + Km(100mg/L)+ Cef(400mg/L)。