动物细胞表达制备药用蛋白
动物细胞工程制药的研究进展
动物细胞工程制药的研究进展动物细胞工程制药的研究进展1161001413167 刘星星摘要：动物细胞工程制药是动物细胞技术在生物制药工业方面的应用。
本文介绍了动物细胞工程制药所涉及的主要技术及其进展，包括动物细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等，在此基础上探讨了动物细胞工程制药的发展趋势。
关键词：动物细胞工程；生物制药；细胞融合；转基因动物；细胞培养2.传代细胞系(continuous cell lines,CCL)原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株称为CCL。
许多CCL 建立于50年代，用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量，并且因为所用的细胞性质均一，通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题。
但 C C L 在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处, 有时是从肿瘤细胞衍生而来, 由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性, 因而数十年间未允许 C C L 用于生产。
7 0 年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性, WI-38 是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系。
二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养 5 0 代，且无致瘤性，现在C C L 已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系。
表 1 列出了一些常用的生产用动物细胞系。
3.工程细胞系工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。
用于构建工程细胞的动物细胞有BHK-21、CHO-dhfr、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9 等细胞系[1-2]。
SP2/0 - A g 1 4 工程细胞系是通过融合的方法，从抗羊红细胞活性的 B A L B / c 的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系P 3 X 6 3 A g 8 融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，可用于生产单克隆抗体[2]。
转基因动物制药PPT课件
编辑课件
3
• 以下是科学家“制造” 出的最神奇、最古怪 的10种转基因动物。
编辑课件
4
1、荧光鼠
• 2007年末，荧光鼠脑细胞的图片 传遍世界各地，从“福利客”超 市的宣传海报到“自然”杂志的 封面。这些五彩斑斓的脑细胞是 单个的神经元，鲜艳的色彩帮助 科学家将它们区分开来。英国哈 佛大学的杰夫-里奇曼为首的科 研小组在实验鼠的基因组中导入 水母的绿色荧光蛋白基因，使其 在紫色光线的照射下呈现出绿色 荧光。这种绿色荧光基因对小鼠 无害，只起到标记作用。
•
研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶
(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运
动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量
乳酸。乳酸可导致肌肉痉挛，即使耐力最强的运动员
也会发生肌肉痉挛。
•
科学家汉森教授说，超级老鼠主要利用脂肪转化
能量，体内只产生非常微量的乳酸，它们不吃不喝也
能跑4到5个小时。这种老鼠最多能以每分钟20米的速
被疟原虫感染不会杀死普通蚊子，但是会降低其繁殖率。
编辑课件
13
7、超级老鼠
编辑课件
14
• 一种超级老鼠可以不知疲倦地奔跑数小时、寿命更长、 拥有更强繁殖能力、吃得更多而不增加体重……美国 科学家培育出的这种转基因老鼠震撼了世界，引起人 们的遐想：培育超级老鼠的技术手段能否应用于人类，
改善人类的能力？第一只超级老鼠诞生于大约4年前。 如今，科学家已经培育出500只超级老鼠。
编辑课件
12
6. 转基因蚊子
• 伦敦帝国学院的科研小组培育了一种转基因蚊子，其中的雄性具 有荧光睾丸，很容易被识别，然后令其不育。研究者称，可以将 大量这样的转基因蚊子放到野外与普通的雌蚊交配，减少疟蚊的 产卵量，从而慢慢减少疟蚊的数目。这种转基因蚊子没有生育能 力，所以不会将基因遗传给野生蚊子。
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势蛋白质是生命机体中最重要的组成部分之一，在生物学、医学和工业领域都具有广泛的应用。
蛋白质表达则是将基因信息转化为蛋白质的过程，这一过程对于基础研究和工业化生产都具有重要作用。
在动物细胞中，蛋白质表达利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质具有一系列优势。
一、哺乳动物细胞表达的优势哺乳动物细胞是表达重组蛋白质的理想载体，其优势主要有以下几点：1.真核生物中的哺乳动物细胞能够在所有重组蛋白质修饰过程中提供最高水平的质量。
由于哺乳动物细胞在体内合成蛋白质时，可以发生多种复杂的修饰过程，例如酰化、糖基化和磷酸化等。
这些修饰可以提高蛋白质的稳定性、可溶性和生物活性，使重组蛋白质更加适合用于医学和工业方面。
相比之下，原核生物（如大肠杆菌）表达的蛋白质缺乏这些修饰过程，因此其生物活性和稳定性较低。
此外，哺乳动物细胞中的重组蛋白质也很少产生抗原性，因此更适合用于医学应用。
2.哺乳动物细胞中的蛋白质折叠和修饰过程更加类似于人类和其他哺乳动物中蛋白质合成的过程。
由于哺乳动物细胞与人类和其他哺乳动物有很大相似性，因此表达的重组蛋白质更符合人类进化历史和生物学功能。
这也意味着可以更好地预测重组蛋白质在生理环境下的稳定性和效力，缩短临床试验的时间和成本。
3.哺乳动物细胞表达的重组蛋白质能够以天然状态的形式分泌到培养基中。
重组蛋白质如果能够以天然状态的形式分泌到培养基中，可以节省纯化步骤和工艺流程，降低生产成本，提高重组蛋白质的产量和纯度。
而哺乳动物细胞中的重组蛋白质通常能够实现这一点。
此外，哺乳动物细胞的培养和维护工艺已经比较成熟，使用更加方便。
二、哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法有多种，主要有以下几种：1.哺乳动物细胞内表达哺乳动物细胞内表达是将重组质粒导入哺乳动物细胞内部，利用细胞自身的基因转录、转译和修饰等机制，表达出重组蛋白质。
动物细胞生产药用蛋白工艺的研究进展
动物细胞生产药用蛋白工艺的研究进展学院：专业：姓名：学号：动物细胞生产药用蛋白工艺的研究进展【摘要】近年来，由于哺乳动物细胞具有对重组蛋白质进行正确折叠、装配和翻译后修饰的优点，利用哺乳动物细胞生产医用蛋白质已成为生物制药产业的重要组成部分。
应用哺乳动物工程细胞系统生产药用蛋白显示了越来越重要的地位。
本文对动物细胞培养技术和提高蛋白质的产量进行了简述。
【关键词】动物细胞；药用蛋白；生产工艺近年来，动物细胞培养技术的快速发展极大地推动了现代生物医药产业的发展。
这一技术已广泛应用于蛋白质药物研发、疫苗制造、干细胞移植、人造组织器官培养等各个领域，日益成为当今生命科学研究和生物医药开发的强力工具。
目前，国内外一些科研机构和高新技术企业正专注于这一领域的研究与开发，并不断获得新的科研成果和技术产品。
这些新成果和产品的推广应用正引导着细胞培养工程技术走向当今生物医药领域的技术前沿［1］。
重组要用蛋白的翻译后修饰是充分发挥其药理活性、药代动力学行为以及体内稳定性所必需的。
这些翻译后修饰包括蛋白的正确折叠、二硫键的形成、多聚化、蛋白酶加工、磷酸化以及充分糖基化，是在内质网和高尔基体内进行的。
因此，有必要用哺乳动物细胞表达形容生产治疗用重组活性蛋白，特别是对与结构复杂、分子量巨大，或是二硫键数目多，或糖基化程度高的蛋白。
有些天然结构的药用蛋白只能用哺乳动物细胞培养生产。
目前，投放市场以及临床中试中的重组蛋白有70%来自哺乳动物细胞培养。
随着哺乳动物细胞培养技术的发展和重组药用蛋白的需求，哺乳动物细胞培养生产的药用蛋白正在不断增加[2]。
以下就目前动物细胞大规模培养工艺以及提高药用蛋白质量的方法作一简述。
1.目前公开发表工艺的研究蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳腺癌的Herceptin，免疫球蛋白肿瘤坏死因子(TNF) 受体融合蛋白治疗类风湿性关节炎的Enbrel 和灭活的甲肝疫苗Vaqta等。
动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术，并逐步形成商业化操作水平。
哺乳动物细胞表达重组蛋白
哺乳动物细胞大规模生产重组蛋白的关键之处
表达载体 改进表达载体，提高表达水平和产量 分泌表达 下游纯化
宿主细胞 新型细胞株的建立
培养工艺
一、 真核表达载体
人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含： 原核DNA序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因，便于 载体在原核细胞中扩增和大量制备。 转录相关元件：哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子 元件，以及终止子和加polyA信号序列。。 翻译相关元件：有效的mRNA翻译信号 其它：视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入 位点等。
利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本
采用无血清／无蛋白培养基(SFM／PFM)来降低细胞培养和产 品纯化的成本。双无培养基
但SFM／PFM缺乏生长刺激因子、黏附因子、扩展因子以及其 他细胞生长存活所必需的成分，在培养过程中细胞常表现出活力降 低、贴壁性差等现象，进而导致分泌目的蛋白的能力下降。
通过将生长刺激因子、黏附因子基因导入CHO细胞中，让 CHO细胞本身提供其自身生长所需要的成分，使其能在SFM／ PFM中生长良好。
抑制细胞凋亡，延长培养周期
细胞在大规模培养初期， 目的蛋白的表达和细胞的增殖速率呈正 相关。
但当反应器中细胞的密度达到饱和后，细胞继续增殖会导致养分 和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代谢产物的大量积累，细胞逐渐 凋亡，重组蛋白表达量逐渐降低。
哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中， 常用的细胞系有 中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 人胚肾细胞HEK293
中国仓鼠卵巢细胞（CHO的优势 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
11-10动物细胞表达制备药用蛋白
是直接取自动物组织器官,经过 消化分离而获得
的细胞悬液（109/g）。
需要大量动物，费钱费劳力。
常用的有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、
淋巴细胞。
（2）二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的 组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞 株。
二倍体细胞有正常细胞的特点：
10.4 基因工程细胞构建和筛选 在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各
种工程细胞。
被用构建工程细胞的动 物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、 Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。
10.4.1 真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： 1） 病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒 2） 质粒载体
9.2.1 细胞死亡与凋亡
大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有 挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由 于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物 反应器中死亡主要原因是细胞凋亡。 用基因工程方法将bcl—2基因这种细胞凋亡抑制 基因导入细胞，bcl—2基因的过量表达能抑制细胞凋 亡，提高细胞密度和目的蛋白产量。
能产生胶原，培养基用BME （Eagle’ Basal medium）。10%小牛血清，pH7.2,
倍增时间为24h，有限寿命50代。 安全，用于制备疫苗。
MRC-5：从正常男性肺组织
中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。 属成纤维细胞。
用培养基加小牛血清。 同工酶G6PD B型。 有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38快，对不 良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。 用于生产疫苗。
哺乳动物细胞生产药用蛋白研究进展
哺乳动物细胞生产药用蛋白研究进展利用哺乳动物细胞大规模培养来生产重组蛋白技术已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。
专家预言:蛋白治疗药物如糖蛋白,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场,预计在下一个10 年或20 年会有一个更为快速的发展。
蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过目前全世界的生产能力。
哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，开始常用的细胞系有CHO和HEK293两大类细胞。
使用较多的COS细胞，由于其强烈的贴壁作用，曾经限制了大规模悬浮细胞培养生产的实际应用。
随着生物技术的发展，CHO细胞可以贴壁培养，也可以经过驯化悬浮培养，是生产包括基因工程抗体药物（人源化或人源抗体）在内的重组糖蛋白的首选工具细胞。
HEK293细胞主要用于蛋白瞬时表达及腺病毒生产，尚未见以HEK293表达的药物获得批准。
目前，正在进行大规模培养生产的研发中的哺乳动物细胞株还有猿细胞衍生的Vero，Vero细胞是依赖于贴壁培养的细胞，主要用于病毒疫苗的生产；SP2/0和NS0主要用于制备杂交瘤细胞，生产鼠单抗，也有用来生产人源化单抗的报道；以及人的胚胎干细胞等。
建立和优化高效的表达载体系统是重组蛋白在哺乳动物细胞生产的关键，是抗体产业化的前提和瓶颈，是提高重组蛋白在单细胞中的表达量的基础。
人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含有原核基因序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因等，这样便于载体在原核细胞中扩增和大量制备。
另外含有能使外源基因在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终止子和加polyA信号序列。
目前常见的哺乳动物细胞表达系统主要有二氢叶酸还原酶基因扩增系统及GS基因拷贝扩增系统，但是这两种扩增系统所需时间为6~12個月，蛋白的表达不能在早期得以预测，是此表达系统的限速步骤。
造成限速的原因是由于基因的沉默现象产生了特定基因的转录降低或取消。
导致基因沉默的主要原因是目的基因所插入位点染色体的结构。
哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物取得的进展分析
天然蛋 白质相似的特性而取得 了重要应用。从蛋 白质药物制造技 术发展来看， 考虑到哺乳动物细胞培养制备的蛋 白质药物质量 较 高， 并且制备过程难度低、 制备成本不高， 由此决定了哺乳动物细胞培 养制备充足蛋 白质药物将在未来的制药领域取得全 面发 展和应用。基于这一认识 ， 我们应认真总结哺乳动物 细胞培养制备 充足蛋白质药物取得 的进展 ， 并深入探讨哺乳动物细胞培养制 备 充足 蛋 白质 药物技 术 的 发展 前 景 ， 做好 哺 乳 动物 细 胞培 养 制备 充 足蛋 白质 药物 的 研制 工作 。 关键词 ： 哺乳动物细胞； 培养制备 ； 充足蛋 白质药物 ； 进展分析
１前 言 重复序列。 近年来新发现 的强启动子如人编在蛋 ￣ ｔ （ ｕ ｂ ｉ ｑ ｕ ｉ ｔ ｉ ｎ ） Ｃ基 因 在 近 年生 物 制药 发 展 中 ， 利 用 哺乳 动 物 细 胞 培养 制 备 充 足蛋 白 启动子 以及一些新构建的杂合启动子不仅具有更高 的活性 ， 而且具 质 已经 成 为 了重 要 的发 展 方 向。研 究 表 明 ， 哺 乳 动物 细 胞 培养 制备 有 更广 阔的 宿主 细胞 范 围 。 的 蛋 白质 ， 无 论是 在 制 备质 量 上 ， 还 是 在 蛋 白质 含 量 上 ， 都 达 到 了药 上述研究表 明， 不断地筛选改造载体上的表达结构元件是优化 用标 准 ， 并 且 在性 能 上 也 与 天然 蛋 白质较 为接 近 。基 于这 一 优 势和 表达载体 、提高蛋 白质药物在哺乳动物细胞中表 达量 的不变 的方 特点， 关于哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药物的研究得到 了有效开 向 。 展， 并 取得 了积极 的研 究效 果 。结 合 目前 关 于 哺 乳 动物 细 胞 培 养制 ４ 哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药物在生物制备过程 中取得 备充足蛋 白质药物的现状 ， 该 研究 在重组细胞系 、 重组表达载体和 的进 展 生 物 制备 过 程 中取 得 了积 极 进 展 。 哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程绝大多数是在 生 ２哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药物在重组细胞系 中取得的 物反应器中进行的单细胞悬浮式培养 ， 反应罐的体积可达 ２ Ｏ 吨。 为 进 展 了节 约成本 ， 减少动物血清对产 品的污染 ， 现在主要采用无血清培 Ｃ Ｏ Ｓ 细 胞 曾是 进行 外 源 基 因表 达研 究 中用 途 最广 的宿 主 ， 但由 养基 ， 目前有多家商业公司提供适用不同细胞株和不同生产工艺的 于 其 严重 的贴 壁作 用 ， 限制 了大 规模 悬 浮 培 养 的实 际应 用 。 目前 哺 无血清培养基 ， 如Ｕ ｌ ｔ ｒ ａ Ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ， Ｐ ｍＣ Ｈ Ｏ， Ｐ ｒ ｏ ２ ９ ３ 等。 乳 动 物 细 胞生 产 重 组 蛋 白中 ，常 用 的 细胞 系有 Ｃ Ｈ Ｏ和 Ｈ Ｅ Ｋ ２ ９ ３两 考虑到制药过程的现实需要 ， 提高生物制备能力是保证蛋 白质 大类细胞 。 Ｃ Ｈ Ｏ是 目前生物工程上广泛使用的细胞 。 该细胞属于成 药物制备取得实效的关键 。从 目前的研究过程来看 ， 提高生物制备 纤维细胞 ， 本 身 很 少 分 泌 内源 蛋 白 ， 因此 对 目标 蛋 白分 离 纯 化 工 作 能 力 的研 究 成果 主要 表 现在 以下 几个 方 面 ： 十分 有利 ， 是 表 达 复 杂生 物 大 分 子 的理 想 宿 主 。工 业 生 产 上应 用 较 ４ ． １培养方式可以为单细胞悬浮式培养 。 这样可以减少培养基， 多 的是 Ｃ ＨＯ — Ｋ１ 细胞 及 Ｃ Ｈ Ｏ ／ ｄ ｈ ｆ ｒ 一 细胞 ， 被 广 泛 地用 于 重 组 Ｄ Ｎ Ａ蛋 提高培养效果， 降低培养过程成本。 白的稳定表达生产。 Ｈ Ｅ Ｋ ２ ９ ３细胞是转染腺病毒 Ｅ １ Ａ基因的人肾上 ４ ． ２反应罐的体积可以达到 ２ ０ 吨以上。 现有的培养实验将反应 皮 细胞 系 ， 它易于转染 ， 是 一 个 很 常 用 的 表 达研 究 外 源基 因 的 细 胞 罐的体积设定在 ２ Ｏ 吨， 并取得 了良好的培养效果。因此在蛋 白质制 株。利用瞬时基因表达方法 ， 采用悬浮培养系统 ， 可以快速 、 方便地 备过程 中， 可以根据实际需要扩大反应罐 的体积 ， 满足蛋白质制备 获 得 ｍｇ 级蛋 白。 需要 。 目前 还 有 一 些 哺 乳 动 物 细胞 株 正 在进 行 大 规模 培 养 生 产 的 研 ４ ＿ ３培养中使用无血清培养基 。 既降低培养基成本 ， 又减少了血 发中 ， 如来源于 Ｍａ ｄ Ｉ ｉ ｎ — Ｄ ａ ｒ ｂ ｙ 犬 肾的高分化 内皮 细胞株（ Ｍ Ｄ Ｃ Ｋ １ 、 红 清中动物成分的污染可能。 系细胞株 、 以及人的胚胎干细胞等 。由于不同重组细胞系表达 的重 ５ 结束 语 组蛋白其稳定性和糖基化类型不同 ， 需要根据 目的蛋 白选择最佳的 通过本文的分析可知 ， 结合生物制药 的研究与发展形势 ， 哺乳 重 组 细胞 系 。 动物细胞培养制备充足蛋白质药物已经成为了可能 ， 从目 前 的研究 从上述研究成果来看 ， 哺乳动物细胞制备充足蛋 白质药 物在重 来看 ， 哺乳动物细胞培养制备充足蛋 白质药物取得了积极进展 ， 在 组细胞 系中取得了积极进展 ，其产生的影 响主要表现在两个方面 ： 重组细胞系、 重组表达载体和生物制备过程中都取得了进展和突 哺乳动物细胞系 的分类越来越清晰 ， 主要分为 Ｃ Ｈ Ｏ和 Ｉ － Ｉ Ｅ Ｋ ２ ９ ３ 破 。为此 ， 我们应积极推动哺乳动物细胞培养制备充足蛋白质药物
第十一章 动物细胞培养与表达制备药用蛋白(1)
细胞质 细胞壁
代表生物
除核糖体外，无其它的细胞器。 有各种细胞器。 有。主要是肽聚糖。
放线菌、细菌、蓝藻、衣原体
植物细胞、真菌有，动 物细胞无。
真菌、植物、动物
第二节 动物细胞的形态与生理特性
1. 贴壁细胞的生长特征
成纤维细胞
人胃腺癌细胞
2. 悬浮细胞的生长特征
白细胞细胞：K562
腹水瘤细胞：Ehrlich腹水瘤细胞EAC
一、培养基的基本要求
1. 营养成分
维生素：
主要是辅酶、辅基，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、 吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12 都是培养基常有的成分。
无机离子与微量元素
细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素，还需要微
量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
一、培养基的基本要求
2. 促生长因子及激素
3. 兼性贴壁细胞
CHO-K1
CHO－K1
动物细胞的化学组成与代谢
大分子： 蛋白质 核酸 糖 脂质
大分子代谢的三个阶段
1.三大营养素水解为单体 2.中间产物的生成 3.三羧酸循环
产能代谢：三羧酸循环
葡萄糖产能对比
供氧不足：糖酵解途径 2 ATP; 供氧充分：三羧酸循环 36～38 ATP； 动物细胞大规模培养：供氧成为生物反应器设 计的最重要的因素之一！
1. 营养成分
氨基酸
氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸： 缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。
此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是
核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所 需要的基本物质。
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗
哺乳动物细胞培养生产流感疫苗摘要动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。
动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。
对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。
传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。
本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。
研究背景动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。
1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。
法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。
流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄层。
由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。
20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，1918－1919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。
进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。
2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
•
思考：
在动物细胞生产药用蛋白中， 哪些 类型的细胞更有前景？
在动物细胞生产药用蛋白中， 哪些
类型的细胞更有前景？ 更有前景的是融合细胞及采用基因
工程构建的各种工程细胞。
NO.3
基因工程细胞构建和筛选
真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： 1） 病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒 2） 质粒载体
1） 病毒载体
牛痘病毒：用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。 杆状病毒：用于外源基因表达。
2）质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分： ①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
谷氨酰胺合成酶（GS）系统
•
谷氨酰胺合成酶在 ATP 水解提供能量时 ,利用细胞内的氨和谷 氨酸合成谷氨酰胺 ,在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养条件下 ,加 入谷氨酰胺合成酶的抑制物甲硫氨酸亚砜(methionine sulphoximine ,MSX) ,可使GS基因及与之相连的目的基因扩增 ,达到提高目的基因表达水平的目的。 由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程中不 必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常MSX浓度下就能筛选到 含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-MTX 系统优越之处。主要哺乳细胞株为NS0细胞及CHOK1细胞。
（2）二倍体细胞系
原代细胞经过传代筛选克隆，挑选并纯化出某种具有一定特征的细 胞株。 二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。
（3）转化细胞系
常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而 获得无限增殖能力。 自发 人工诱变
基因载体的导入和高效表达 工程细胞株的筛选
1） 基因载体的导入 基因载体导入动物细胞最常用方法是：
磷酸钙沉淀法 电穿孔法
磷酸钙沉淀法： 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷 酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则 通过细胞吞噬作用而将DNA导入。
2）高效表达工程细胞株的筛选
主要采用DHFR系统和GS 系统 二氢叶酸还原酶系统DHFR 由于CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶 （dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了 次黄嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine） 和甘氨酸的培养液中才能得以存活。二氢叶酸还原酶能 够被叶酸类似物氨甲喋呤(methotrexate ,MTX)所抑制 ,用含有目的基因及与之相连的DHFR基因的重组质粒转 化CHO dhfr细胞 ,利用浓度不断提高的 MTX选择抗MTX 的细胞系 ,其中 DHFR基因及与之相连的目的基因一起 扩增 ,从而使目的基因高水平表达。
动物细胞表达 制 备 药 用 蛋 白
思 考
要制备出我们想要的蛋白，需要 了解些什么，做些什么？
生产用动物细胞的要求和获得 常用生产用动物细胞的特性 基因工程细胞构建和筛选
NO.1
生产用动物细胞的要求和获得
（1） 原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过消化分离而获得。
用量大，浪费时间。
常用的有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞等。
NO.2
常用生产用动物细胞的特性
W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。 核型为2n=46。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME （Eagle’ Basal medium）。10%小牛血清，pH7.2, 倍增时间为24h，有限寿命50代。 安全，用于制备疫苗。
MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。 属成纤维细胞。 有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较 W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。
BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细 胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫 苗，现已用于工程细胞构建。
Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤 维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基，加5%胎牛血清； 用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。
电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场， 使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞。转 化率较高，拷贝数低。
真核生物细胞生产药用蛋白优点： ①具有准确的转录后修饰功能，分子； ②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； ③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养， 表达水平较高； ⑤CHO（注射用重组人促红素 ）细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白， 利于外源蛋白的分离。 因此，可以针对性的筛选细胞株
DHFR扩增仅仅发生在二个等位基因中的一个。在稳定系中扩增的基因得以保持，因为 它们位于染色体上DHFR基因座上（均匀染色区），而其等位基仍保持正常的单拷 贝。而在不稳定系中当选择压力消除时，扩增的基因至少会部分丢失，但未丢失 的是以染色体外的方式（双微体）存在。
每个双微体带有2-4 DHFR基因，双微体可以复制，但它们没有着丝粒，结果它们 不能附着在有丝分裂的纺锤丝上，因此不能均等分离进入子细胞，是染色体外的 微小染色体。