饮用水中微生物检测方法(粪链球菌铜绿假单胞菌产气荚膜梭菌)
饮用水微生物检测
阴性
大肠埃希氏菌
• 检测方法
• 多管发酵法 • 滤膜法 • 酶底物法
多管发酵法
• 定义：
指多管发酵法总大肠菌群阳性，在EC-MUG培养基上 44.5℃培养24±2h产生β-葡萄糖醛酸酶（βglucuronidase），分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-βD-glucuronide）并产生荧光产物，使培养基在波长 366nm紫外光下产生蓝色荧光的细菌。
•
是指水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养
48h后，所得1mL水样所含菌落的总数 。
• 培养基： • 营养琼脂
• 设备： • 放大镜/菌落计数器
菌落总数平板计数法
1m L 饮 用 水 水 样
平行样 空白样
平皿
1m L 水 源 水 水 样
10倍 系列稀释
50℃ 营养琼脂
3 6 ±1 ℃ 培 养 48h
大肠菌群革兰氏染色显微 镜下的形态
分离 培养
24h
15管 法 检 测 步 骤
10m L
二倍 乳糖 蛋白 胨培 养液
×5 管
水样
10倍 稀 释
1m L
1m L
乳糖 蛋白 胨培 养液
×5 管
乳糖 蛋白 胨培 养液
×5 管
报告 阴性
报告 阴性
EM B 3 6 ±1 ℃ 培 养 24h
无
典 菌
型 落
阳性
3 6 ±1 ℃ 培 养 24h
• 常用的荧光物有：4-甲基伞形酮（4MU）， 7氨基4甲基伞形酮香豆素 如MUG(四甲基伞形酮-B-D-葡萄糖苷 )
总大肠菌群酶底物法
• 定义：
在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶（β-Dgalactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenylβ-D-galactopyranoside）使培养基呈黄色的细菌 群组 。
矿泉水卫生微生物检验记录
矿泉水卫生微生物检验记录样品编号：检验开始时间：年月日样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：检测依据：GB 8538-2016一、大肠菌群测定（多管发酵法）：1.吸取10ml水样接种到盛有10ml双料乳糖胆盐发酵培养液的试管中，共接种5管；2.吸取1ml水样接种到盛有10ml单料乳糖胆盐发酵培养液的试管中，共接种5管；3.吸取1ml水样接种到9ml灭菌生理盐水的试管中，混匀，用5ml灭菌吸管吸取5ml稀释液分别加到5支盛有10ml单料乳糖胆盐发酵培养液的试管中，每管1ml（即0.1ml水样）；轻摇试管，使液体充分混合，置36±1℃培养箱内培养25h，观察每管是否产气，若产气该管则为阳性，如不产气则为大肠菌群阴性。
自检测阳性管中取一环培养液，接种到亮绿乳糖胆盐培养液（BGLB）管中，置36±1℃培养箱内培养48h；观察BGLB管中的产气情况，如有产气，则可确定为“大肠菌群阳性”，如不产气则为“大肠菌群阴性”。
记下BGLB管里产气的阳性试管数。
注：○+产酸产气；+产酸不产气或有可疑菌落；-不产酸不产气或无可疑菌落；G兰氏阳性杆菌；G+c革兰氏阳性球菌。
结果：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，得：电子天平编号:使用状况试验前：试验后：培养箱编号：使用状况试验前：试验后：检测人：校核人：审核人：二、粪链球菌测定（滤膜法）：根据水质污染情况确定稀释倍数，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴在滤床上，固定好滤器，过滤。
每张滤膜过滤250mL水样或稀释液。
将过滤后的滤膜直接转移至KF链球菌琼脂培养基上，同时避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。
将平皿倒扣，放置在（）℃的恒温培养箱，培养（）h后，取出挑去可疑菌落进行镜检，并且计数。
从滤膜上挑取典型菌落，接种到脑-心浸淬琼脂培养基斜面上，在（）℃培养（）h，做证实性试验，如有菌落生长，则作过氧化氢酶实验、脑—心浸淬琼脂复培养和胆汁肉汤食盐证实是否存在粪链球菌。
不同品牌的瓶装饮用天然矿泉水开封后水中微生物的变化研究
分析检测不同品牌的瓶装饮用天然矿泉水开封后水中微生物的变化研究苏子行，马国阳，肖传志，苏兆霖（广东省江门市质量计量监督检测所，广东江门 529000）摘 要：目的：探究不同品牌的瓶装饮用天然矿泉水开封后水中微生物的变化情况。
方法：于夏季将不同品牌开封后的瓶装饮用天然矿泉水放置于室内，分别在第1 d、第3 d、第7 d测定水中微生物（菌落总数、大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌）的含量。
检验标准参考《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）和《生活饮用水标准检验方法微生物指标》（GB/T 5750.12—2006）。
结果：不同品牌开封后的瓶装饮用天然矿泉水在存放不同时间后，水中大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌含量与本底值没有显著性差异，但菌落总数的变化值与本底值含量成正比。
结论：开封后的瓶装饮用天然矿泉水在室内存放一段时间后，其菌落总数有升高趋势，且不同品牌的瓶装饮用矿泉水出现差异，本底值含量低的矿泉水存放后其菌落总数变化值不大，本底值含量高的矿泉水存放后其菌落总数变化值大。
关键词：瓶装饮用矿泉水；开封；菌落总数Study on the Change of Microorganism in Water of Different Brands Bottled Mineral Water after UnsealingSU Zihang, MA Guoyang, XIAO Chuanzhi, SU Zhaolin(Guangdong Jiangmen Supervision Testing Institute of Quality & Metrology, Jiangmen 529000, China) Abstract: Objective: To study the changes of microorganisms in different brands of bottled drinking mineral water after unsealing. Method: Bottled drinking mineral water of different brands was placed indoors in summer, and the contents of microorganisms (total bacterial count, Coliform group, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa and Clostridium perfringens) in the water were determined on the 1st, 3rd and 7th days respectively. The inspection standards refer to GB 8538—2016 and GB/T 5750.12—2006. Result: The contents of Coliform group, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa and Clostridium perfringens in bottled mineral water of different brands after opening had no significant difference with background value after storage for different time. However, bacterial count changed more with the increase of background value. Conclusion: Total bacterial bount of unsealed bottled mineral water has an increasing trend after being stored indoors for a period of time, and there are differences among different brands of bottled mineral water. The total number of colonies of mineral water with low background value has little change value, while that of mineral water with high background value has a large change value.Keywords: bottled drinking mineral water; unsealing; total bacterial count随着人们生活水平的不断提高和生活方式的转变，瓶装饮用天然矿泉水因其易获得性及便携性受到人们的青睐，特别是在夏天，已经成为人们日常重要的饮水渠道，瓶装矿泉水的卫生质量和安全问题也因此受到广泛关注。
饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进
饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进潘宝怡，吴清平，彭飞艇，周锦祯，郭伟鹏(广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东省华南应用微生物重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地，广东省微生物研究所,广东广州 510070) 摘要：针对饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）检测国家标准方法中,滤膜上的菌落在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂经24 h厌氧环境培养后黑色产生不明显的问题，对检验方法进行改进。
国标改进方法一：按GB/T 8538.4.55-2008进行过滤后增加一步骤,即用SPS培养基（约10 mL）倾注于培养皿的膜上,然后放置厌氧培养；国标改进方法二：按GB/T 8538.4.55-2008进行过滤后将滤膜反贴于SPS培养基上，然后放置厌氧培养。
对方法进行改进后，国标改进方法一和国标改进方法二滤膜上的菌落经24 h厌氧环境培养后均有明显的黑色产生。
国标方法黑色菌落不明显，国标改进方法一和国标改进方法二产生的黑色菌落数与国标方法相比，具有显著性差异（P<0.01）。
国标改进方法一不但有利于产气荚膜梭菌黑色的产生，而且容易挑取菌落做进一步试验。
关键词：饮用矿泉水；产气荚膜梭菌；方法；改进文章篇号：1673-9078(2012)9-1236-1238Improvement of Detection Method for Clostridium Perfringens in Drinking Natural Mineral Water of the National StandardsPAN Bao-Yi, WU Qing-Ping, PENG Fei-Ting,ZHOU Jin-Zhen, GUO Wei -Peng (Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base), South China, Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China) Abstract: The target colonies on the filtration membrane could not turn black obviously on sulfite - polymyxin - sulfadiazine agar after 24 h incubation in anaerobic conditions based on national standard method for the detection of Clostridium perfringens in drinking mineral water. To solve the above problem, the detection method was improved according to the methods of GB/T 8538.4.55-2008. After filteration, the S PS medium (10 mL) was poured on the membrane in the petri dish, and then placed in anaerobic conditions. Another improvement method was also based on the methods of GB/T 8538.4.55-2008. After filtration, the membrane was placed on the SPS culture medium at the reverse side, and then placed in anaerobic conditions. Using the two improved methods, the colonies of C. perfringens on the filtration membrane could turn black obviously after 24 h incubation in anaerobic conditions. Obvious difference was found in the number of black colonies using the two improved methods. The first improved method would make C.perfringens colonies turn black easily and obviously, and it also makes easy to pick colonies for further studies.Key words: drinking mineral water; Clostridium perfringens; methods; improvement产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎常见的病原菌。
饮用水水质微生物检测方法有哪些
饮用水水质微生物检测方法有哪些处于可持续发展战略时代背景下，社会各界人士都对自然环境水资源问题提出了极高重视，饮用水安全关系到群众生活质量与生命安全，这就凸显出饮用水水质微生物检测工作重要性以及紧迫性。
饮用水作为广大群众生活中不可缺少的部分，伴随着我国工业化进程的飞速发展，在提升居民物质生活水平的同时，一定程度上也对饮用水水源质量造成的了极大影响，鉴于演变为Ⅴ类的水质，更不能当作饮用水继续使用。
分析饮用水水质污染问题，主要就是水质中存在大量微生物造成的。
科学技术带动下行业内持续推出现代化饮用水水质微生物检测方法，对提高水源质量做出了重要贡献。
一、饮用水水质中主要存在的微生物类型分析为合理利用饮用水水质微生物检测方法，前提需要明确具体微生物类型，不同类型的病原微生物所应用的检测方法存在较大差异，接下来将对饮用水水质微生物类型加以分析。
1.细菌针对饮用水水质中常见病原微生物，其中主要以细菌最为严重。
通过行业人士多年以来的研究观察，军团菌是细菌病原微生物中出现频率最高的部分，鉴于自然条件下的军团菌，不仅表现出了自由选择环境的特点，而且也能够存活较长周期，像区域内有着丰富水资源的环境，都是军团菌优先考虑的生存地，在对群众健康构成巨大影响的基础上，着重集中在肺部位置。
居民大量饮用含有军团菌的饮用水，长此以往，会加剧肺炎病症出现几率与严重性；另外还有大肠杆菌。
体现出病原特性的大肠杆菌水中致病菌，会造成饮用者不同程度腹泻现象，更会造成少量群众死亡。
目前来看，行业人士在开展饮用水水质微生物检测时，主要以容易检测的大肠杆菌为主，也是评价水质是否安全的重点指标之一；在饮用水水质中还存在着鸟分枝杆菌，依托于复合群存在的细菌会严重影响个体肺部健康，如果不能及时处理还会造成其他身体部位遭受感染。
与此同时，还会出现在管道壁上的鸟分枝杆菌群落，构成一层生物膜的基础上，会对饮用水管道构成反复污染的现象。
2.病毒涵盖肠道病毒、肠炎病毒等在内的病毒微生物，其中分析常见的肠道病素，通常以自然水源作为居住场所，虽然当前社会上推出了一系列现代化水处理设备，但是不可避免的还会出现很多肠道细菌；面对干净卫生的饮用水水源，当受到生物粪便污染后就会形成肠炎病毒，特别是处于妊娠期的女性群体，极易受到其威胁；作为有着较大分布范围的轮状病毒，针对身体抵抗能力较差的婴幼儿群体会严重影响其身体健康，甚至也是构成死亡危险的根本原因。
饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测遇到的问题及解决办法
054产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性杆菌，产芽孢，多以芽胞形式分布于土壤等自然界中，也存在于人、动物及其肠道中，是肠道的正常菌群之一，同时也是一种条件致病菌，能够引起人类食物中毒和动物坏死性肠炎的食源性疾病。
《饮用天然矿泉水》（GB 8537－2018）标准对产气夹膜梭菌的要求是，从一批样品中采集5件样品，每件样品的采样量是50mL，均不得检出。
《饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538－2016）规定，饮用天然矿泉水需检测产气荚膜梭菌，将其在亚硫酸盐－多粘菌素－磺胺嘧啶琼脂（简称SPS）培养基上经24h、36℃厌氧环境培养，计数滤膜上的黑色菌落，并取黑色可疑菌落做进一步的验证试验。
但在这一环节会遇到一些不确定性因素，如目标菌在特定的时间内未生长、菌落颜色为灰色等，从而影响检测结果，不能真实反映样品中产气荚膜梭菌的存在情况。
经试验证实，延长培养时间，增加活化的步骤，关注试验细节，可以解决试验中遇到的类似问题。
一、存在的问题1.在实际检验过程中发现，完全按照GB 8538－2016的方法进行检验，滤膜上截留的产气荚膜梭菌在SPS培养基上经36℃厌氧培养24h，并无明显的黑色菌落，这就容易误认为被检样品中不含产气荚膜梭菌，而导致漏检。
2.对确定含有产气荚膜梭菌的样品进行检测后发现滤膜无黑色菌落产生，只有少量灰色的菌落，再对其进行确证试验，但生化现象不明显，最终给出错误的实验结果。
二、解决的方法将产气荚膜梭菌标准菌株CICC22949接种于血平板上，经36℃厌氧培养，待长出明显菌落，挑取单菌落于液体硫乙醇酸盐培养基（简称FT），经36℃厌氧培养24h，用于后续试验。
1.延长培养的时间。
根据GB 8538－2016中的方法对产气荚膜梭菌进行检测试验，将上述的FT培养液用0.85％的无菌生理盐水连续梯度稀释，配制成浓度分别为10CFU/mL、饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测遇到的问题及解决办法102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL的菌悬液，分别吸取1mL稀释后的菌悬液，加入到50mL的无菌天然饮用矿泉水中作为人工污染样品。
饮用天然矿泉水中粪链球菌检测的能力验证
饮用天然矿泉水中糞链球菌检测的能力验证□李娟张诗惫陈科苏嘉妮广东省食品检验所摘要：本文主要考查本实验室检测人员对矿泉水中粪链球菌的检测能力。
方法：用本实验室标准工作菌株粪链球菌 制成合适麦氏浊度的菌悬液，污染待检包装矿泉水，后续按照国标GB 8538-2016 56部分进行检测和鉴定，检测过程设 置阴性对照大肠埃希氏菌。
结果：两名检测人员检测结果分别为33CFU/250mL、21CFU/250mL,其对数值之差的绝 对值为0.20，小于0.45。
结论：本次人员比对考核结果为满意。
关键词：矿泉水；能力验证；人员比对；粪链球菌检测人员能力验证是实验室微生物检测质量控制的关键环节，其结果 直接关系到检验报告的准确性和可靠 性。
通过能力验证，可以综合判断检测 人员的检测水平，进而体现该实验室 的检测水平。
能力验证作为评价实验 室能力的一个重要手段，一直以来受 到国内外实验室管理者的广泛重视[1]。
它对于实验室而言是重要的外部质量 保证手段，能增加客户及相关方对实 验室出具可靠数据的信心。
(/S tre p to c o c c u s f aecalis),又名类肠球菌（£nterococcu^eca&)，在水、土壤和人畜的体内及粪便中广 泛存在[2]，属于条件致病菌，当机体 抵抗力下降或有其他因素影响时，进 入人体血液或其他部位，可引起尿路 感染、败血症、脑膜炎、化脓性腹部 感染、心内膜炎和腹泻发烧等[3]。
该 菌耐热、耐盐，对不利环境的适应性强、抵抗力强，甚至可以抵抗多种抗生素，因此存活力持久、感染性强[4]，与大 肠菌群相比，该菌更适合作为水质粪 便污染情况的指标菌，更能客观地反 映水质的卫生状况[5]。
本文就包装矿 泉水中粪链球菌的定量检测对本实验 室两名检测人员进行能力验证。
1材料与方法1.1实验菌株类链球菌（SireptococcusATCC29212,购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心，工作菌株为 3代，大肠埃希氏菌C&cAertc/iia co/〇ATCC25922 购自 Microbiologies,工作 菌株为2代〇1.2主要试剂与仪器KF链球菌琼脂培养基(北京陆桥)、脑-心浸萃液态培养基（北京陆桥）、脑-心浸萃琼脂培养基（北京陆桥），抽滤设备（Millipore)、无菌滤膜(Millipore)、恒温培养箱（上海一恒）、旋涡混合器（IKA)。
饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测方法的改良 杨德富
饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测方法的改良杨德富摘要：产气英膜梭菌是一种革兰氏阳性杆菌，产芽孢，本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，广泛地存在于自然界的土壤、污水、粪便及人畜肠道中，是正常肠道菌群的成员之一，也是一种条件致病菌，通常被用作粪便污染的指标，可引起人创伤性气性坏疽和食物中毒、痢疾等各种疾病。
产气荚膜梭菌产芽孢，对污水净化处理的各种措施具有较强抵抗力，其数量与水污染程度有关，因此也被认为是水质的指标。
《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》规定，饮用天然矿泉水需检测产气荚膜梭菌。
关键词：饮用水；天然矿泉水；产气荚膜梭菌检测；改良方法引言：将饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法GB8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》作一些改良，以使检测结果更加准确可靠。
用产气荚膜梭菌CICC22949人工污染的水样通过孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，改良后的方法在滤膜上有黑色可疑菌落，而国标方法滤膜上的菌落无黑色。
TSC培养基上目标菌计数值显著高于SPS培养基计数值（P<0.05）。
用新鲜配制的TSC培养基经双层培养基覆盖改良后的方法检测产气荚膜梭菌，现象更明显，结果更可靠，更适合饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验。
产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）因能分解肌肉和结缔组织中的糖类产生大量气体并在体内形成荚膜而得名，该菌是后壁菌门梭状芽胞杆菌属的一种，呈粗短的大杆状，无鞭毛，专性厌氧的革兰氏阳性菌。
多以芽胞形式分布于土壤等自然界中，也存在于人、动物及其肠道中，是肠道的正常菌群之一，同时也是一种条件致病菌。
1.材料与方法1.1菌株产气荚膜梭菌（ＡＴＣＣ１３１２４），购自中国食品药品检定研究院1.2主要培养基和试剂亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶琼脂、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（tryptose-sulfite-cycloserineagar，TSC）、液体硫乙醇酸盐培养基（thioglycollatemedium，FTG）、动力-硝酸盐培养基、缓冲动力-硝酸盐培养基、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、血平板、革兰氏染色液：北京陆桥技术股份有限责任公司；孔径为0.22μm的无菌滤膜：广东环凯微生物科技有限公司；饮用矿泉水：坎儿井天然矿泉水。
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其他形态菌落 成非左述各种 反应结果
产氨试验（+）
产氨试验（+）、 氧化酶（+）、 荧光试验（+） 铜绿假单胞菌阳性 非铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌阳性
铜绿假单胞菌阳性
菌数计算、报告结果
过滤操作方式和滤膜放 推测性试验 置培养时注意事项
Ø 水样过滤 依照水质确定稀释倍数，用 0.45μm 的滤膜 过滤250ml水样。 Ø 培养： CN 培养基 36℃±1℃培养40h~48h。 Ø 计数 20h~24h和40h~48h观察菌落并计数； 蓝色 or 绿色判定为铜绿假单胞菌，非蓝绿 产荧光和红褐色菌落进一步确证性试验。
铜绿假单胞菌在CN板上
Ø 营养琼脂 Ø 氧化酶试验
确证性试验
在 CN 琼脂上培养 20~24h 的可疑菌落接种，在 36 ℃±1 ℃ 培养20h~24h，检查再次纯化的菌落。 选最初为红褐色菌落试验， 10s内成深蓝紫色为阳性反应， 注意反应操作方法。
Ø 金氏B培养基
红褐色、氧化酶阳性的接种 36℃±1℃ 24h~5d，每天紫 外灯检，5d内有荧光为阳性。
粪链球菌特性
• 粪链球菌菌形圆或椭圆，可顺链的方向延长,直径0.5 微米 ~1.0 微米 , 大多数成双或短链状排列 , 通常不运动。 在丰富培养基上菌落大而光滑，直径1毫米~2毫米， 全缘，罕见色素。其营养要求低，在普通营养琼脂上 也可生长。能在10℃~45℃ pH9.6或含6.5%NaCl肉汤 培养基中生长，并能耐65℃ 30分钟。它可利用精氨 酸为能源，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。在简单的 培养基上生长不需叶酸。
Ø根据蓝色和绿色菌落的计数和确证性试验的结果 ，计算每 250ml水样中铜绿假单胞菌的数量，结果以CFU/250ml计。
第三部分 产气荚膜梭菌的检测
产气荚膜梭菌生物系特性
Ø 菌体较大，大小为(0.9～1.3)×(3.0～9.0)微米,无鞭毛，有荚膜。 芽孢椭圆形,位于偏端。专性厌氧。菌落直径2～5毫米，血琼脂 革兰氏染色阳性 平板上有溶血圈。糖发酵能力强，产酸产气。本菌的特征之一 是在牛乳培养基中呈暴烈发酵现象。 Ø 为革兰阳菌粗短大杆菌。两端钝圆，单个或成双排列，偶见链 状。芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌 体，在一 般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有利于形成 芽胞。在机体内可产 • • 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂平板 金氏B培养基斜面 乙酰胺肉汤 营养琼脂 氧化酶试剂 钠氏试剂
铜绿假单胞菌检测程序
水样 取250ml水样过滤 将滤膜移放在CN琼脂培养基上 36℃± 1℃ 24h～48h 可疑菌落分别计数
蓝/绿色菌落
产荧光（非蓝/绿色）菌落
红褐色菌落
报告
Ø 依据典型菌落的计数和确证性试验为阳性 的结果，计算250ml水样中粪链球菌数量， 结果以CFU/250mL计。
第二部分 铜绿假单胞菌的检测
铜绿假单胞菌特性
Ø 一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。菌体细 长且长短不一， 铜绿假单胞菌有时呈球杆状或线状，成对或短 链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微 镜下观察可见细菌运动活泼。 Ø 本菌为专性需氧菌，生长温度范围 25~42℃，最适生长温度为 25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可 用以鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素， 如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin） 等。在血平板上会有透明溶血环。
GB/T 8538-2008铜绿假单胞菌检测
Ø 适用于饮用天然矿泉水的检测 Ø 原理
滤膜法：250ml 水样用0.45μm的滤膜过滤，滤膜 在 CN 琼脂上于 36 ℃±1 ℃中培养 48h ，能生长并 产生绿脓菌素，或者生长且氧化酶阳性、紫外 360±20nm产生荧光、能利用乙酰胺产氨的革兰 氏阴性菌无芽孢杆菌，则存在绿脓杆菌，结果阳 性。
N P F (C F / nF ) R(C R / nR ) 式中： P 呈蓝 / 绿的菌落数（所有证实 为铜绿假单胞菌的菌落 ）； F 显荧光的菌落数； R 呈红褐色的菌落数； nF 进行产氨测试的显荧光 菌落数； C F 产氨阳性的显荧光菌落 数； nR 进行产氨、氧化酶、金 氏B培养基上显荧光测试的 红褐色菌落数； C R 产氨、氧化酶、金氏 B培养基上显荧光测试均 呈阳性的红褐色菌落数
培养基
• KF链球菌琼脂平板 • 脑-心浸萃琼脂液体培养基 • 脑-心浸萃琼脂斜面
粪链球菌检测程序
水样 取250ml水样过滤 将滤膜移放在KF琼脂培养基上 36℃±1℃、48h，红色或粉红色菌落计数、镜检形态 挑取典型菌落3～5，分别接种脑-心浸萃琼脂培养基 45℃ 过氧化氢酶试验 48h 36℃± 1℃ 3d
GB/T 8538-2008粪链球菌检测
Ø 适用于饮用天然矿泉水的检测 Ø 原理
滤膜法：250ml 水样用0.45μm的滤膜过滤，滤膜 在KF链球菌琼脂上于36℃±1℃中培养48h，选择 红色或者粉红色菌落在脑-心浸萃琼脂上进行确证 实验，过氧化氢酶反应阴性，并能在脑-心浸萃液 体培养基上于 45 ℃培养后浑浊生长，则存在，结 果阳性。
Ø 乙酰胺肉汤试管
接种营养琼脂纯化的菌落36℃±1℃ 20~24h，加钠氏试 剂，色泽深黄到砖红，产氨阳性。
金氏B培养基产生荧光
阴性 阳性 阳性
乙酰胺肉汤培养液
砖红色
深黄色
阳性
阴性
计数结果及报告
Ø滤膜上特征菌落证实为铜绿假单胞菌的菌落，计算菌落时应考 虑到验证试验的比例及特定的水量，如矿泉水、泉水和其他瓶 装水，水样的体积应为250ml。菌落数按下述式子计算。
45℃生长试验
胆汁肉汤试验
菌数计算、报告结果
推测性试验
过滤操作方式和滤膜放 置培养时注意事项
Ø 水样过滤 依照水质确定稀释倍数，使得过滤 250ml 水样滤膜上菌落数20个~100个。 Ø 培养：36℃±1℃培养48h。 Ø 计数 对滤膜上红色或者粉红色菌落进行革兰氏 染色、显微镜镜检， G+ ，计数 250ml 水样 中粪链球菌数。
KF链球菌琼脂上菌落
确证性试验
Ø 滤膜上的典型菌落在脑 - 心浸萃琼脂斜面培养， 36℃±1℃ 24h~48h，有菌落继续。 Ø 过氧化氢酶反应 取培养物在洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢。有 气泡阳性，不是粪链球菌；无为阴性，继续。 Ø 继续培养 转移到脑-心浸萃液态培养基和胆汁液态培养基分 别于45℃ 48h和36℃±1℃ 3d。 Ø 判定：若生长，为阳性。