病毒的细胞培养
第二章 病毒的培养
五、细胞培养 （一）细胞培养的条件要求 1、细胞密度 原代细胞：4~6×105个/ml 传代细胞：2~3×105个/ml 2、pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3、培养温度
（二）细胞培养的方法 1、单层细胞培养 2、悬浮细胞培养 3、微载体细胞培养
（三）原代细胞培养 基本步骤：
1、血清（serum） 1）血清的种类和来源
胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 新生牛血清(newborn calf serum, NCS) 成年牛血清(adult bovine serum) 马血清(horse serum) 鸡血清(chicken serum) 兔血清(rabbit serum) 羊血清(sheep or goat serum) 人血清(human serum)
７）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml） 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总
数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K
（稀释倍数）。
○表示可计数 ●表示不计数
血细胞计数板
体外细胞的染色检测方法： 原理：死活细胞对染料的不同反应而区分开两 种细胞。 常用染料：中性红（活细胞着色，死细胞不着色）
2、长途运送细胞培养物的保存。 取刚长成单层的细胞培养物，弃去营养
液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留 空气，随后用橡皮塞紧塞瓶口，并作适当的 包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右， 到达目的地后，置37℃培养1天，再行传代。
（六）细胞培养物的冻存与复苏 1、培养物的冻存与复苏原理
冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在 加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率 降至零下某一温度（一般低于-70℃的超低温条件）， 并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏(thawing)：以一定的温速率将冻存的培养物恢 复到常温的过程。
细菌与病毒的研究与诊断方法
细菌与病毒的研究与诊断方法细菌和病毒是人类生活中常见的微生物，它们既可以有益于人类的生活，如在食品发酵和药物制造中的应用，也可以给人类带来危害，如引发各种传染病和感染性疾病。
因此，对细菌和病毒的研究和诊断方法是非常重要的。
一、细菌研究与诊断方法1. 常规的细菌培养和鉴定方法常规的细菌培养是指将临床样本（如尿、血、各种分泌物等）涂在不同的寒暖培养基上，通过寒暖条件、营养物质、PH值等不同的条件，让细菌在试管中生长繁殖，然后利用生长繁殖具有鲜明的形态、色彩、光学性质等特征，进行定种和鉴定。
2. 分子生物学方法分子生物学是近年来发展迅速的一门交叉学科，利用PCR、基因芯片等技术，能够快速、灵敏地检测到微生物。
例如，在肺炎支原体感染诊断中，可以利用PCR检测患者痰样中的肺炎支原体DNA，以便迅速诊断并给予治疗。
3. 聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种基于DNA复制过程的反应，可在很短的时间内制备出特定DNA 序列的无数复制品，从而快速检测出目标DNA分子。
利用PCR技术可快速进行基因序列分析、基因型鉴定和突变检测等。
在临床上，PCR已被广泛用于各种微生物的检测，如结核分枝杆菌、肺炎支原体、病毒性肝炎等。
二、病毒研究与诊断方法1. 细胞培养法在有些病毒感染中，病毒会侵入到人体细胞内进行繁殖，这就为病毒的诊断提供了紧凑而可靠的材料。
细胞培养法是通过将感染过病毒的细胞悬浮或培养液样本接种到携带某些特定的生物学特征的细胞系上，观察细胞所产生的病毒病变和症状，确定病毒属于哪种类型。
2. 血清学检测法血清学检测法是通过检测人体血液中的病毒特异性抗体，来判断是否有病毒感染。
典型的血清学检测法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、放免检测法等。
这些方法简单，快速，灵敏，更加便于诊断，通常应用于对病毒的早期筛查和疫苗预防等方面。
3. 分子生物学方法分子生物学方法的快速发展为病毒的检测提供了更加准确、敏感、特异的手段。
例如，利用PCR技术可以扩增病毒基因组中的一部分特定序列，从而快速鉴定患者血样中是否出现病毒感染的迹象。
病毒分离培养的细胞培养法
第18章病毒分离培养的细胞培养法一、细胞培养用于病毒研究的优点：细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛，除用作病毒的病原分离外，还可研究病毒的繁殖过程及其细胞的敏感性和传染性（细胞的病理变化及包涵体的形成）。
观察病毒传染时细胞新陈代谢的改变，探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制，以及研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性，可用于病毒的分离鉴定，抗原的制备及疫苗，干扰素的生产、病毒性疾病诊断和流行病学调查等。
近年来，可用于繁殖病毒载体以用于基因治疗。
应用细胞培养来研究病毒有下列优点：1、没有隐性感染：动物可能带有某些病毒的隐性感染，往往有干扰作用和假阳性出现。
细胞培养一方面是来源于动物部分组织，减少了隐性感染的机会，另一方面组织培养细胞可进行预先检查而加以克服。
2、没有免疫力：动物经隐性感染获得免疫力，对接种病毒会发生抵抗，但由于后天免疫一般不表现在细胞抵抗力的增加，因此离体细胞无免疫力，利于病毒生长。
3、容易选择易感细胞：细胞来源方便，可供作病毒敏感性的筛选，可以从中选择最敏感的细胞以满足实验要求，同时还利于从单一细胞水平上研究病毒的繁殖过程和病毒一细胞的相互关系。
4、接种量大：动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制，细胞不仅可以大量生产，而且还可较久地持续培养，便于病毒生长，特别是对那些生长缓慢或需在新环境中逐渐适应的病毒更为有利。
5、培养条件易于控制：由于细胞培养可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分，因此可采用大规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。
6、提高了疫苗的产量和质量：细胞的大量生产可满足疫苗产量的需求，而且异性蛋白少，引起变态反应机会少。
疫苗中污染菌少或无，可随制随用，成本低，来源方便，便于贮存，且效力均匀，易标准化。
7、加速病毒分离过程：病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速早出结果，但应用对该病毒敏感的细胞。
二、用细胞培养分离病毒(一)接种标本的处理：1、粪便标本：用于分离肠道病毒之粪便标本放入装玻璃珠40ml沉淀管内，大约每2克粪便用15ml Hanks液稀释(其余粪便于-20℃保存备用)，用橡皮塞紧后剧烈振摇，使粪便乳化，经2500r/min沉淀15分钟后，按将上清用无菌八层纱布过滤，于4℃以10000r/min沉淀1小时再取其上清，1.8ml加入0.2ml抗菌素液进行处理(浓度为25000u/ml的双抗及250mg/L二性霉素B)剩下的悬液保存于-20℃备用。
病毒培养方法
病毒培养方法
病毒培养是一种重要的实验技术，它在病毒学研究、疫苗生产和药物筛选等领域都有着广泛的应用。
正确的病毒培养方法可以保证病毒的纯度和活性，为后续的实验研究提供可靠的基础。
下面将介绍一种常用的病毒培养方法，供大家参考。
首先，准备培养基和细胞。
常用的培养基有DMEM、MEM等，细胞可以选择HEK293、Vero等。
将培养基加热至37摄氏度，使其保持体温。
其次，接种病毒。
将培养基加热后，将其放置在无菌工作台上。
然后，将需要接种的病毒加入培养基中，轻轻摇匀。
接着，将接种好病毒的培养基加入到细胞培养皿中。
将培养皿放置在37摄氏度的恒温培养箱中，培养一定时间。
在培养的过程中，需要定期观察细胞的情况。
通常情况下，细胞会出现明显的变化，比如颜色的改变、细胞的增殖等。
这些都是培养是否成功的重要指标。
最后，收获病毒。
当细胞出现明显的病毒感染迹象时，可以收获病毒。
首先，将细胞培养液离心，离心后的上清液中含有病毒。
然后，将上清液收集起来，经过一系列的离心、过滤等步骤，最终得到纯净的病毒溶液。
总的来说，病毒培养是一项复杂的实验技术，需要严格的操作流程和高超的实验技巧。
只有掌握了正确的病毒培养方法，才能够保证病毒的纯度和活性，为后续的实验研究提供可靠的基础。
希望以上介绍的病毒培养方法对大家有所帮助，谢谢阅读！。
病毒的细胞培养
病毒的细胞培养病毒严格细胞内寄生，培养病毒必须使用细胞。
实验动物、鸡胚都拥有大量活的细胞，可用于病毒的培养。
SPF动物及SPF鸡胚是目前常用的培养载体。
一．细胞培养的特点20世纪50年代采用了将组织细胞分散的技术，使组织培养变为细胞培养，得以应用于病毒学研究、诊断及疫苗制备等方面。
细胞培养中的每个细胞的生理特性基本一致，对病毒的易感性也相等，没有实验动物的个体差异，而且可以用于实验的数量远远超过动物或鸡胚，并且可以在无菌的条件下进行标准化的实验，可重复性良好。
感染病毒的细胞可以通过观察细胞产生的变化如细胞病变等来判定结果，也可以结合免疫学技术检测细胞内是否有所培养的病毒。
细胞培养的重要用途之一就是从感染的动物体内分离病毒以及病毒克隆。
从样本分离的病毒可能不是单一的毒株，需要克隆以求纯化。
通过细胞培养挑选产生的空斑可达到克隆的目的。
二．细胞培养的类型1.原代细胞：动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个的细胞，再生长于培养器皿中。
大多数组织均可制备原代细胞，但生长的速度及难易程度不等。
肾和睾丸最为常用，甲状腺细胞生长缓慢，只用于某些特定的病毒如猪传染性胃肠炎病毒的培养。
原代细胞一般对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。
最好用SPF动物的组织，以免携带潜伏的病毒，会影响所需病毒的生长，甚至造成灾难性的后果。
2.二倍体细胞株：将长成的原代细胞分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。
此种细胞数量可以扩大，对病毒的易感性则基本无变化。
从样本中分离培养病毒，一般多采用此种细胞。
但巨噬细胞、神经细胞等体外培养一般不分裂，很难获得二倍体细胞株。
3.传代细胞系：与上述两类细胞不同，这类细胞可在体外无限制的分裂，亦可无限制的传代。
有的来源于肿瘤组织或转化的细胞，染色体数目不正常，为异倍体。
传代及培养方便是其优点，因此使用广泛。
缺点是有的对分离野毒（即样本中的病毒）不敏感。
因在实验室传代时间长，有的可能污染霉形体或者隐形感染的病毒，应予注意。
动物病毒细胞增殖的研究进展
动物病毒细胞增殖的研究进展目前，细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛。
病毒和宿主细胞共同决定病毒适应细胞生长并增殖。
病毒首先通过特定的受体吸附于宿主细胞膜上，与受体结合后，进入宿主细胞内进行基因组的复制。
期间，病毒成功感染细胞除了需要病毒与受体结合，还依赖于膜融合、内吞、囊泡运输及核定位信号介导入核等多个过程。
细胞通过特异的病毒一受体相互作用来识别病毒，这些受体决定了细胞对病毒的敏感性。
尽管流感病毒、狂犬病毒、口蹄疫病毒等能够成功的使用细胞培养，但是很多病毒的宿主范围很窄，病毒甚至无法进行细胞培养。
本文通过以下方法：宿主细胞的选择、细胞连续传代、改变细胞培养条件、添加病毒保护剂、改变细胞结构，对动物病毒适应细胞培养增殖研究进行概述。
1 合适的宿主细胞病毒适应细胞的能力与病毒自然宿主、病毒原发器官和细胞类型有关。
例如，鸭肝炎病毒不能感染哺乳动物单层细胞；水貂流行性腹泻冠状病毒仅在貂肺细胞培养繁殖；马传染性贫血病毒常用马胚肾细胞系培养。
SARS病毒注射到鸡、火鸡、鹅、鸭和鹌鹑胚的尿囊腔中病毒不复制，不引起病变。
猪伪狂犬病毒虽然具有广泛的嗜性，能在多种细胞内繁殖，但敏感度不同，其中以兔肾细胞和猪肾细胞(原代和传代细胞系)最适于病毒的增殖，在PK15(猪源)、Vem(猴源)、BHK(鼠源)、CEF(鸡源)细胞中，该病毒在PK15上增殖速度最快。
Coria等用鸡传染性支气管炎病毒Beaudene株接种猫、狗、绵羊、鹅等14种非宿主动物肾细胞发现，培养的病毒滴度要远远低于接种鸡胚肾细胞的病毒滴度。
其中，在猫、狗、猪的肾细胞内采用直接荧光抗体方法检测不到病毒。
Lukert等通过比较在鸡胚、原代鸡胚肾细胞、肝细胞上感染鸡传染性支气管炎病毒的增殖情况发现，病毒在鸡胚上的敏感度最高，是肾细胞的12～40倍，肝细胞的500～1000倍。
鸡气管环上皮细胞对该病毒更敏感、更容易适应，鸡传染性支气管炎病毒肾变型分离株能够较容易的适应鸡胚肾细胞。
实验十病毒的细胞培养
实验十病毒的细胞培养
一、目的：掌握传代细胞的传代和培养方法，认识BVDV在MCBK细胞上产生的CPE
特征。
二、实验步骤
1、细胞分散液的配制：取10倍浓缩的EDTA、胰蛋白酶细胞分散液1mL，加入9mL双
重去离子灭菌蒸馏水混合即成。
2、细胞生长液：含8%FCS、1%谷氨酰胺、2%双抗的MEM以7.5%碳酸氢钠矫正pH值
为7.2（粉红色，MEM内含有中性红指示剂）。
3、细胞传代与培养：取长满单层的MCBK细胞，弃去细胞培养液，加入细胞培养瓶体
积0.5%的细胞分散液，冲洗整个瓶体，再以细胞分散液摇动消化细胞2次，最后加入少许分散液，于37℃温箱内消化，待细胞变成云雾状（细胞间质已分开），轻轻振克数次，使细胞从瓶壁脱落后，迅速加入细胞生长液，大口吸管吹打数次，分装到2各细胞培养瓶内，37℃温箱静止培养。
4、病毒接种与收获：单层接种（吸附与不吸附）法接毒后，加入细胞维持液。
同步接种
法接毒后，加入细胞生长液，次日换成细胞维持液。
每日观察CPE，当CPE达到75%时置于冰箱内冻结收获。
5、病毒的鉴定：进行形态学（电镜负染、超薄切片观察）、理化学（耐酸、耐乙醚和氯
仿、耐热试验等）、生物学（动物感染、血凝、细胞感染谱试验等）、免疫学（中和试验、荧光抗体试验等）和分子生物学（病毒蛋白分析、PCR、核酸探针试验等）等鉴定。
三、实验报告内容
1、单层细胞传代和培养的注意事项。
2、试述细胞培养的优点。
3、细胞接毒方法的种类及优缺点。
4、病毒鉴定的方法常用的有那些。
人工培养病毒的方法
人工培养病毒的方法
人工培养病毒是一项重要的实验技术，它在病毒学研究以及疫苗生产等领域具有重要意义。
下面将介绍人工培养病毒的方法。
首先，选择合适的宿主细胞是人工培养病毒的关键。
不同的病毒对宿主细胞有不同的选择性，因此需要根据病毒的特性选择合适的宿主细胞。
常用的宿主细胞包括Vero细胞、MDCK细胞、HEK293细胞等。
其次，培养基的选择也是至关重要的。
培养基中的营养物质和生长因子对病毒的生长和繁殖起着至关重要的作用。
一般来说，培养基中需要含有足够的营养物质和生长因子，以满足病毒的生长需求。
接着，病毒的接种和感染是人工培养病毒的关键步骤。
在选择好宿主细胞和培养基之后，需要将病毒接种到宿主细胞中，使其感染并开始复制。
这一步需要严格控制感染的条件，以确保病毒能够有效地感染宿主细胞。
随后，对感染后的细胞进行培养和观察。
在感染后，需要将细
胞继续培养，并观察病毒的生长情况。
这一步需要耐心和细心，以
确保病毒能够充分地复制和繁殖。
最后，收集和提取病毒。
当病毒充分复制后，需要进行病毒的
收集和提取。
这一步需要使用适当的方法，如离心、超声波破碎等，将病毒从细胞中提取出来，并进行纯化和浓缩。
总之，人工培养病毒是一项复杂而重要的实验技术，它需要在
选择宿主细胞、培养基、感染和观察等方面进行严格控制，以确保
病毒能够充分复制和繁殖。
只有这样，我们才能更好地理解病毒的
生物学特性，为疫苗研发和病毒学研究提供重要的支持。
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（1）取胚
• 选取9-11日龄SPF鸡胚，大头朝上直立于蛋 架上，用碘酒、酒精消毒气室外壳。用镊 子从气室端打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌 镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌平皿中。
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（2）组织处理
• 用PBS液冲洗胚体2-3次，再将鸡胚的头、 爪、内脏去除，剩下的胚体在用PBS液冲 洗胚体2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀 将鸡胚剪成碎块。
证组织细胞在无微生物的条件下生长。
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4.细胞培养用液及培养基（液）:
（1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ，
可高压除菌。 （3）消化液 :
胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左 右。需过滤除菌。 EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、 Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。
中，每升培养液中加人0.5ml；链霉素为100万U／瓶，将
其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。
（7）冻存液：二甲基亚砜
（8）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。
其是配方：
基础培养基 80％－90％
血清 10%
双抗 100u/ml
（9）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不死的培养
液。
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合成培养基
• 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多 种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
• 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化 合物、无机盐和其它一些辅助物质。
• 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本 低
• 在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上， 置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变 （CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反 复冻融3次，置-70℃保存备用。
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3
细胞培养的基本概念
• 传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后， 被分开接种到新的培养器皿中。
• 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外 条件下生长的细胞在传代之前称为原代培 养。
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每代贴附生长细胞的生长过程
• 游离期
• 贴壁期
• 潜伏期
• 对数生长期
• 停止期（平台期）
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细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
贴附生长型细胞
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悬浮生长型细胞
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六 细胞培养的实验步骤
1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例 （1）取胚 （2）组织处理 （3）消化 （4）分装、培养
其是配方：
基础培养基 95％
血清 2％－5％
双抗 100u/ml
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五 培养细胞的生长方式及类型
• ㈠ 贴附生长型细胞
必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大 体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难 以确定其稳定形态的细胞。
• ㈡ 悬浮生长型细胞
不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。
• 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无 细菌、支原体、病毒污染。
• 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟
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（5）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细
胞生命的能量来源。
（6）抗生素：最终浓度为青霉素 100 U／ml，链霉素
100U／ml（青霉素为80万U／瓶，将其溶解于4ml三蒸水
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二 主要优点
• ㈠ 研究的对象是活的细胞。 • ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 • ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 • ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 • ㈤ 研究的范围比较广泛。 • ㈥ 研究的费用相对较经济。
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三 分类
• 原代细胞培养 • 传代细胞培养
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(4) 培养基
• 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的 溶液，分天然培养基和合成培养基。
• 天然培养基： • 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡
胚和牛胚浸液）。
• 优点：营养成分丰富，培养效果好 • 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产
物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染
• 传代细胞可以直接从肿瘤组织获得，又可 以通过人工驯化获得。
• 常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、 Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等
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四 培养实验用品的前期处理
1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿
2.包装 3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保
病毒的细胞培养
赵健乔
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1
• 一 基本原理 • 二 细胞培养的基本概念 • 三 主要优点 • 四 培养实验用品的前期处理 • 五 培养细胞的生长方式及类型 • 六 细胞培养的实验步骤 • 七 病毒的细胞培养
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2
一 基本原理
• 通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体 取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。 模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增 值。
• 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生 长需要。
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• 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想 使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天 然培养基（如血清）。
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• 血清中含有：
• ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） • ②多种金属离子 • ③激素 • ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原
等。 • ⑤各种生长因子 • ⑥转移蛋白 • ⑦不明成分
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• 一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞 可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10 ％血清．
• 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明， 但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．
• 血清质量好坏是实验成败的关键。
• 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、 兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
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原代细胞培养
• 概念：从供体获取组织细胞后在体外进行 的首次培养。
• 优点：生物学特性未发生很大变化，细胞 染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长 特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒 学方面的实验
• 缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。
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传代细胞培养
• 概念：原代细胞经过一系列传代，产生变 异，转化为能够连续传代的细胞。