高效液相色谱分析
高效液相色谱分析
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、 计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装 置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数 据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从 控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色 谱图。
纯 水 制 备 仪
超 纯 水 制 备 仪
乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的 只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光 和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是 水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问 题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等 氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提 高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分 的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。 国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂， 但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不 含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其 他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色 谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生 的问题。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。
高效液相色谱的工作原理及操作注意事项
高效液相色谱的工作原理及操作注意事项高效液相色谱的工作原理及操作注意事项一、高效液相色谱的工作原理高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，主要应用于化学、生物、医药等领域。
其工作原理是利用不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡，实现对待测组分的高效分离。
以下是高效液相色谱的工作原理：1.流动相：高效液相色谱中的流动相也称为溶剂或载体，是携带待测组分通过色谱柱的介质。
流动相的选择应根据样品的性质、检测器的类型以及分离效果等因素进行选择。
2.固定相：高效液相色谱中的固定相是色谱柱中的填料，通常是涂布在硅胶或氧化铝等载体上的高分子聚合物。
不同物质根据其在固定相和流动相之间的分配系数进行分离。
3.洗脱过程：在高效液相色谱中，待测组分随流动相通过色谱柱，经过固定相和流动相之间的分配平衡实现分离。
分离后的组分会按照其在固定相和流动相之间的分配系数依次流出色谱柱，进入检测器进行检测。
4.检测器：高效液相色谱中使用的检测器根据待测组分的性质和检测要求进行选择，常见的有紫外-可见光检测器、荧光检测器、电导检测器等。
检测器的作用是将组分的浓度转化为可测量的电信号，以便进行记录和分析。
二、高效液相色谱的操作注意事项在使用高效液相色谱进行实验操作时，需要注意以下事项：1.样品准备：在进行高效液相色谱分析前，需要对样品进行必要的处理和制备。
应尽可能避免样品中的杂质和干扰物质对分离和分析的影响。
同时，样品的浓度应适中，以避免色谱柱过载或检测器过载。
2.流动相选择：流动相的选择对高效液相色谱的分离效果和分析结果至关重要。
应根据样品的性质、实验要求以及分离效果等因素选择合适的流动相。
同时，应注意流动相的纯度和稳定性，以保证实验结果的可靠性。
3.色谱柱选择：高效液相色谱中使用的色谱柱是分离和分析的关键元件。
应根据样品的性质、待测组分的类型以及分离要求等因素选择合适的色谱柱。
同时，应注意色谱柱的粒径、孔径和填料性质等参数，以确保达到最佳的分离效果。
高效液相色谱
高效液相色谱高效液相色谱，又称高压液相色谱（HPLC，High Performance Liquid Chromatography），是一种重要的色谱技术，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
相较于传统液相色谱，高效液相色谱具有分离效果好、分析速度快、灵敏度高等优势，因此成为现代分析实验的核心技术之一。
高效液相色谱的原理基于物质在不同相互作用力下的差异，通过样品在固定相上的分配行为，实现对不同成分的分离和分析。
其核心部分是色谱柱，包括固定相、流动相和样品分子。
其中，固定相是一种特定的固体或液体材料，具有一定的孔隙结构和表面特性，用于捕获和分离样品成分。
流动相则由溶剂组成，可以通过与固定相的相互作用调节分离效果。
而样品分子则根据其在固定相上的亲疏性，相继被吸附、扩散和解吸，最终实现分离。
高效液相色谱的分离过程包括样品进样、柱温控制、流速调节等步骤，每个步骤都需要严格控制，以保证分离效果和结果准确性。
在样品进样之前，通常需要采用样品前处理方法，如固相萃取、溶剂萃取等，以去除杂质和提高分析物的浓度。
然后，样品通过进样器进入色谱柱，通过控制流速和柱温，使样品成分在固定相上发生分配行为，从而实现分离。
最后，通过采集柱洗脱出来的物质，并通过检测器检测其浓度变化，得到分析结果。
高效液相色谱的关键是选择适当的固定相和流动相。
不同的样品性质和分析要求需要选择不同的固定相。
常见的固定相包括疏水相、离子交换相、亲水相等。
此外，流动相的选择也非常重要，常见的流动相溶剂有水、有机溶剂（如甲醇、乙腈）等。
合理选择固定相和流动相能提高分离效果，提高检测灵敏度。
高效液相色谱有多种检测器可供选择，常用的有紫外-可见光谱检测器（UV-Vis）、荧光检测器、质谱检测器等。
通过检测器的信号，可以得到样品的浓度信息，从而进行定量分析。
高效液相色谱在药物分析中的应用广泛。
例如，针对不同药物的检测需求，可以选择不同的色谱柱和流动相，在合适的检测器下进行分析。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过高效液相色谱技术，对给定的混合物进行分离和分析，掌握高效液相色谱仪的操作方法，以及对不同成分的定量分析。
二、实验原理。
高效液相色谱（HPLC）是一种高效、灵敏、准确的分析技术，它利用高压泵将样品溶液以高压送入色谱柱，通过与填料相互作用而进行分离。
在色谱柱中，不同成分将因其在填料中的亲和力不同而被分离开来。
通过检测器检测各个组分的峰面积或峰高，从而进行定量分析。
三、实验步骤。
1. 样品制备，将待分析的混合物溶解于适当的溶剂中，并进行过滤处理。
2. 色谱柱准备，连接色谱柱，并进行平衡处理。
3. 仪器调试，将色谱仪的流动相、检测器等参数进行调试。
4. 样品进样，将处理好的样品通过自动进样器送入色谱柱。
5. 数据采集，通过色谱仪软件进行数据采集和记录。
6. 数据分析，根据色谱图进行各组分的峰识别和定量分析。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功地对给定的混合物进行了分离和定量分析。
得到了混合物中各组分的峰面积和峰高，并通过标准曲线进行了定量分析。
实验结果表明，本实验的色谱分离效果良好，各组分分离度高，定量分析结果准确可靠。
五、实验总结。
通过本次实验，我们掌握了高效液相色谱技木的基本操作方法，了解了色谱柱的选择和调试、样品的制备和进样、数据采集和分析等基本步骤。
同时，我们也认识到了高效液相色谱技术在化学分析中的重要性和广泛应用性。
希望通过今后的实验操作，能够进一步提高我们的操作技术和分析能力。
六、参考文献。
1. Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principles of instrumental analysis. Cengage Learning.2. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Glajch, J. L. (2011). Practical HPLC method development. John Wiley & Sons.以上就是本次高效液相色谱实验的全部内容，希望对大家有所帮助。
高效液相色谱分析HPLC
高效液相色谱
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第7讲
高效液相色谱
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§3-4 液相色谱法固定相
色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键。 一、液-液色谱法及离子对色谱法固定相 1.全多孔型担体：直径小于10µm（75/-4） 2.表面多孔型担体，目前不用。 3.化学键合固定相（P76及P69） a.成相：用化学的方法通过化学键把有机分子结合 到担体表面。常用18碳柱 b.特点76/-5：4点. 4.分离机制77/2：既不是全部吸附过程，亦不是典型 的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是 按键合量的多少而各有侧重.
第7讲
高效液相色谱
第16页
离子对色谱分离过程示意图
第7讲
高效液相色谱
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五、离子色谱法 1.固定相:离子交换树脂 流动相:电解质溶液 检测器:电导检测器 主配件：抑制柱 2. 流程图：fig3-2 3.分离机制 （阴离子为例） a.双柱型：化学抑制型离子色谱法； b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液； 4.应用：从无机和有机阴离子到金属阳离子，从 有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析.
高效液相色谱
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第三章
高效液相色谱分析（HPLC）
§3-1高效液相色谱的特点 一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱 技术。 二、特点 1.高压: 可达150～350×105 Pa 2.高速: 例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20 多小时，用HPLC只需1小时。 3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米） 4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g 荧光检测器10-11g
高效液相色谱
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第7讲
高效液相色谱
第7页
高效液相色谱在药物分析中的应用
高效液相色谱在药物分析中的应用一、引言药物分析是指对药物化学和药物控制的分析研究，其目的是确定药物的成分、结构、性质，以及在制剂中的含量、纯度和稳定性等指标。
高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析技术，凭借其高分离效率、高灵敏度和宽泛的应用范围，被广泛应用于药物分析领域。
二、HPLC的原理与优势HPLC是在高压下进行的液相色谱技术，其原理是通过将样品在高压下推动通过色谱柱，利用不同成分在固定相上的相互作用力差异，实现样品组分的分离。
HPLC相比传统的液相色谱技术有许多优势，包括分离效率高、分析时间短、样品消耗少、操作简便快捷等。
三、药物分析中的HPLC应用1. 药物成分分析药物成分分析是药物分析的核心内容之一，HPLC在药物成分分析中具有广泛的应用。
通过HPLC技术，可以准确测定药物中各种成分的含量及相对含量，为药物的质量评价提供客观依据。
此外，HPLC还能有效地分析药物中的杂质，保证药物的质量和安全性。
2. 药物代谢产物分析药物在人体内经过代谢作用形成代谢产物，其研究对评价药物的药效和副作用至关重要。
HPLC作为一种灵敏的定性和定量分析方法，被广泛应用于药物代谢产物分析。
通过HPLC技术，可以对代谢产物进行定性的鉴定，并确定其在体内的生成和消除动力学过程，进一步探索药物的药效和副作用。
3. 药物制剂质量控制药物制剂质量控制是指对药物制剂中有效成分的含量、纯度和稳定性等指标进行分析研究。
HPLC作为一种高分辨率、高效率的分离技术，可用于测定药物制剂中的有效成分含量。
通过HPLC 技术，可以准确测定药物制剂中各种成分的含量，确保药物制剂的质量符合规定标准。
4. 药物毒物分析药物毒物分析是指对药物中的毒性物质进行鉴定和测定，以评估其对人体的安全性。
HPLC作为一种高度灵敏和选择性的分析技术，在药物毒物分析中具有重要的地位。
通过HPLC技术，可以对药物中的毒性物质进行准确的分离和定量，为评价药物的安全性提供重要依据。
高效液相色谱结果分析
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收 试验法”和“加样回收试验法”。
(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定， 测定值为 M
回收率
M - 空白
R=
X 100%
A
(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
回收率 R = M - P X 100% A
数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如 高、中、低三个不同浓度样品各测三次.
4.精密度(precision)
（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!
3.准确度(accuracy)
准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近 的程度，用百分回收率表示。
相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度,应 控制在100%左右(95%～105%)。
Unacceptable t=2
Awful t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线波 动.
基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变化.
分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同 的实验者对同一样品的分别测试而获得的。(获得的这 种再与正常检定下的精密度进行比较,从而确定该法的 耐用性,或称粗放度).
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析方法，它基于样品在液相中的分配
行为以及在固定相上的吸附和解吸行为。
它能够对样品中的物质进行分离、定量和定性分析。
高效液相色谱的原理如下：
1. 选择性分离：高效液相色谱中，样品混合物被注入装有固定相（柱填充物）的色谱柱中。
不同物质在柱填充物上的吸附和解吸速度不同，因此可以通过调整流动相的组成、温度和流速等参数来实现对样品中物质的选择性分离。
2. 吸附-解吸过程：在高效液相色谱中，样品溶解于流动相中，与固定相表面发生相互作用。
这个过程涉及吸附和解吸，吸附过程发生在固定相表面，解吸过程发生在固定相表面和流动相中物质的分配行为。
通过控制流动相的性质和柱填充物的特性，可以实现对不同物质的选择性吸附和解吸。
3. 柱填充物：高效液相色谱柱的填充物通常是多孔性固体颗粒，如硅胶或石英。
填充物的选择与样品的性质和分离的目的有关。
柱填充物的粒径、孔径和表面性质将影响色谱分离的效果。
4. 检测器：高效液相色谱的结果通过检测器进行检测和记录。
常见的检测器包括紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器等，根据待分析物的性质和浓度选择适当的检测器。
总之，高效液相色谱是利用样品在液相中的分配和在固定相上的吸附解吸过程进行分离和定量分析的方法。
通过调整柱填充物、流动相和检测器等参数，可以实现对样品中不同物质的选择性分离和定量测定。
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R=1.5
完全分离
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高效液相色谱系统
（一） 高效液相色谱仪结构流程
进样器 高压泵 色谱柱 检测器 储液瓶 废液 高压输液泵、高效分离柱、高灵敏度检测器
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（二） 高压输液系统（高压泵）
高压输液泵是核心部件，要求：密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。 高压泵主要有恒流泵（往复泵）和恒压泵（气动泵）两种。 恒流泵特点 输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无 关。分为机械注射泵和机械往复泵(常用)两种。
（三）分离度R
分离度的表达式：
R
2(t R (2) t R (1) ) Wb (2) Wb (1) 2(t R (2) t R (1) ) 1.699(Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) )
tR(2), tR(1): 组分2和组分1的保留时间 Wb(2), Wb(1): 组分2和组分1的峰底宽度
基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间
的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓
度成正比。 生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，
一般要用示差折光检测器。
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缺点：
灵敏度低； 对温度敏感； 不能用于梯度洗脱。
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（三）、荧光检测器—专用型检测器
基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动相中 的组分的浓度成之比。
凝胶过滤色谱
（二）定性与定量 参阅气相色谱的定性与定量方法。
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气相色谱与高效液相色谱的比较
气相色谱
1.只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物 2.不能用于热不稳定物质的分析 3.用毛细管色谱可得到很高的柱效 4.有很灵敏的检测器如ECD和较灵 敏的通用检测器（FID和TCD） 5.流动相为气体，无毒，易于处理 6.运行和操作容易 7.仪器制造难度较小
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色谱图及相关名词
（一）色谱流出曲线—色谱图
色谱图是色谱柱流出物通过检测器所产生的响应信号对时间 或液体流出体积的曲线 。 色谱流出曲线是色谱基本参数的源流，而色谱基本参数又是 用来观察色谱行为和研究色谱理论的重要指标。另外，还可 以直接利用色谱图峰位置点（特征保留值）进行定性，根据 曲线上测得的峰高或峰面积进行定量。
固定相极性<流动相极性
反相液相色谱 （反相柱）
组分极性越小，保留 时间越长；适用非极 性化合物的分离。
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选择流动相时应注意的问题
1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质
长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
2、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或
损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏
恒压泵特点 能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统 阻力而变化，故保留时间的重视性差。
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柱 球 形 单 向 阀 电动机 偏心轮 柱塞 溶 剂
图10-7 柱塞往复泵示意图
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（三）色谱柱
色谱柱是高效液相色谱分离过程的核心。一支稳定、高效的 色谱柱对建立适用性强、重现性好的分析方法是必不可少的。 1.担体 高效液相色谱的柱填料有离子交换树脂、凝胶，较多的使用 硅胶微粒作为担体。以下为几种常用的微粒类型： (1) 全多孔型担体：属于颗粒均匀的多孔球体，很好的兼顾 了效能、样品荷载量、耐久性等理想的性质，所以最为常用。 (2) 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）： 它是直径为 30 ～ 40 μm 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ，优点 是：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易 于填充均匀，柱效高。这种担体目前应用较为普遍。
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（二）柱效能
色谱柱在色谱分离中由动力学因素所决定的柱效能，通常 用塔板高度或塔板数表示。
塔板数：
2 t tR R n 5.54 16 Y1 W 2 2
涡流扩散相
塔板高度：
分子扩散相
B H A Cu u
流动相线速度 传质阻力相
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高效液相色谱
1.几乎可以分析各种物质
2.用于热不稳定物质的分析 3.色谱柱较短，柱效较低
4.没有较高灵敏通用检测器
5.流动相有毒，费用较高 6.运行和操作比GC难一些
7.仪器制造难度大
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作者：应姗姗
谢谢
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高效液相色谱分析
基本概念与特点
◆ 概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经 典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采 用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器， 从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术 的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分 离分析手段. ◆ 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
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4.流动相
液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。 流动相组成、极性改变，可显著改变组分分离状况， 改变流动相的组成和极性（组成比例）是提高分离
度的有效手段。
常用溶剂： 环己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸 乙酯、甲醇 、乙腈、水等。
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固定相极性>流动相极性 正相液相色谱 （正相柱） 组分极性越大，保留 时间越长；使用极性 化合物的分离。
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液相色谱流程与原理
◆ 基本原理：混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流 动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力 的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复 多次分配过程，使得原来分配系数具有微小区别的各组分 ，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在柱中的 移动速度不同，经过一定长度的色谱柱，彼此分离开来， 最后按一定顺序流出。
对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。
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特点：
高灵敏度； 高选择性；可用于梯度洗来自。23定性与定量
（一）样品预处理 1.固体样品 固体样品首先要进行均质化，然后再采用如蒸馏、超临 界萃取或超声波萃取等技术进行样品制备。 2.液体样品
液-液萃取 固相萃取
氧化铝固定相等。
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3 、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止 产生沉淀并在柱中沉积。
4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
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（四）检测器
（一）、紫外检测器—应用最广泛的检测器
基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择
性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系
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2.色谱柱
柱体为直型不锈钢管，标准内经为4.6或3.9 mm，柱长15～30 cm，填料 颗粒粒度5－10μm。发展趋势是减小填料粒度(3－5μm)和柱经以提高 柱效。
为保护色谱柱，
通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。
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3.固定相
选择固定相的一般标准还是以“相似相容”原理为基础。 如果溶质溶于烃类溶剂，表明是低极性化合物，这样就 可以选择非极性或亚极性固定相。 若样品溶于极性温和溶剂中，如醇类，则可选择极性固 定相，也可以选择非极性固定相。
符合郎伯-比耳定律。
优点：
灵敏度高，线形范围宽； 缺点： 死体积小； 无紫外-可见吸收组分不响应； 波长可选； 流动相选择受一定限制。 对流速和温度变化不 敏感； 可用于梯度洗脱。
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(a) 可变波长紫外检测器
(b) 二极管阵列检测器
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（二）、示差折光检测器—通用型检测器
每种物质具有不同的折光指数。