血吸虫现场调查实验报告 岳阳钉螺调查
血吸虫病防治项目查螺、灭螺、查病、化疗技术方案
血吸虫病防治项目查螺、灭螺、查病、化疗技术方案（试行）为了科学、规范地开展血吸虫病防治工作，促进实现《全国预防控制血吸虫病中长期规划纲要（2004-2015年）》和《血吸虫病综合治理重点项目规划纲要（2004-2008年）》阶段性防治目标，依据血吸虫病流行区的疫情分类，特制定查灭螺、查治病工作的技术方案。
各地应根据本方案，制定实施细则，核定年度防治计划任务，将查灭螺计划具体落实到环境，查治病计划具体落实到村或村民组，并组织实施。
一、流行村分类(一)分类标准以行政村为单位，以居民粪检阳性率为依据，将流行村分为5类：1、一类村：居民粪检阳性率≥10%；2、二类村：居民粪检阳性率≥5%、＜10%；3、三类村：居民粪检阳性率≥1%、＜5%；4、四类村：居民粪检阳性率＜1%；5、五类村：连续5年无当地新感染的病人、病畜、无感染性钉螺。
（二）类别调整根据疫情及调查结果每2年对疫情变化大的一、二、三类村进行类别调整。
以村民组为单位，采用随机整群抽样的方法，抽取一定数量的村民组，用血清学方法查病，血清学检查最少受检人数不得低于《血吸虫病流行村类别调整血清学检查最小样本量计算表》（见附表），受检率达到90%以上。
对血清学阳性者进行粪检，受检率达到90％以上。
以此计算粪检阳性率（计算公式附后），作为调整类别的依据。
二、钉螺调查（一）调查范围和频次1、现有钉螺环境（1）近2年查获感染性钉螺、发生急性感染病例和人畜常到的生产生活区等易感环境，每年查螺1次；（2）其他有螺环境，每年调查1/3面积。
2、可疑环境与有螺水系相连或与现有钉螺环境毗邻、引进有螺区植物、水生物的环境以及洪水淹没区等可疑环境，每年查螺1次。
（二）调查方法选择春季或秋季适宜时期开展查螺。
1、现有钉螺环境（1）易感环境：采用系统抽样方法查螺（江湖洲滩环境框线距20－50m，其他环境框线距5－10m）。
检获框内全部钉螺，并解剖观察，鉴别死活和感染情况。
（2）其他有螺环境：采用环境抽样方法（根据植被、低洼地等环境特点及钉螺栖息习性，设框调查）查螺。
血吸虫病防治控制钉螺孳生繁殖和扩散蔓延查螺工作方案
血吸虫病防治控制钉螺孳生繁殖和扩散蔓延查螺工作方案血吸虫病是一种由寄生虫感染引起的传染病，螺螨（主要是钉螺）是该病的中间宿主。
为了控制和预防血吸虫病的传播，需要制定一项针对钉螺孳生繁殖和扩散蔓延的查螺工作方案。
下面是一个简要的方案：1. 建立钉螺监测体系：建立和完善钉螺监测体系，包括定期对可能滋生钉螺的水源进行调查和检测。
通过这种方式，可以及时发现和控制钉螺的孳生繁殖。
2. 加强并普及钉螺防治知识：通过宣传教育、健康教育等渠道，向公众普及钉螺的防治知识。
提高公众的自我防护意识，避免接触感染水源。
3. 加强钉螺综合治理：通过物理、化学、生物等多种手段进行钉螺综合治理。
采用物理方法，如清理和疏通水道、修复水源，以减少钉螺滋生的环境。
采用化学方法，如使用杀螺剂对疫区水源进行治理，以降低钉螺的密度。
采用生物方法，如引入天敌鱼类、桡足类动物等，对钉螺进行控制。
4. 定期监测治理效果：建立针对钉螺繁殖和扩散的定期监测机制，评估和监测治理效果。
定期对疫区进行检测，在发现钉螺密度上升或者治理效果不佳的情况下，及时调整和改进措施。
5. 国际合作与信息共享：加强与其他国家和地区的合作，共同开展钉螺的防治工作。
建立信息共享机制，交流经验和技术，加强对钉螺孳生繁殖和扩散控制的研究。
最后，需要强调的是，血吸虫病的防治工作需要多部门的合作和协调，同时也需要广大公众的参与和支持。
只有大家共同努力，才能有效预防和控制血吸虫病的传播。
血吸虫病是一种严重威胁人类健康的传染病，是由血吸虫寄生虫引起的，而中间宿主之一就是钉螺。
钉螺孳生繁殖和扩散蔓延是血吸虫病传播的重要途径之一，因此必须针对钉螺进行查螺工作，以防止血吸虫病的进一步扩散。
首先，钉螺孳生的环境调查和监测工作是防治控制血吸虫病的基础。
定期对潜在的钉螺滋生水源，如湖泊、河流、池塘等进行调查和监测，掌握钉螺的分布范围和密度。
这些监测工作可以通过人工采集钉螺样本，或者使用现代科技手段，如卫星遥感等，进行远程监测。
血吸虫病疫情监测报告
血吸虫病疫情监测报告第一篇：血吸虫病疫情监测报告血吸虫病疫情监测报告及时了解血吸虫病流行动态变化、影响因素及防治工作现状，预测流行趋势，为制定血吸虫病防治提供科学依据。
方法按照《全国血吸虫病监测方案》要求及标准进行疫情监测。
结果全村人群平均血吸虫感染率0.20%。
全村家畜平均感染率2.22%。
全村有螺面积6 460m2，活螺平均密度0.13只/框（每框=0.11m2），未发现感染性钉螺。
结论绵阳市涪城区螺情、病情指标已经达到并控制在国家血吸虫病传播控制标准内，但应加强综合治理，防止血吸虫病疫情回升。
绵阳市涪城区磨家镇双凤坪村为国家血吸虫病流行病学监测点，按《全国血吸虫病监测方案》和《四川省血吸虫病监测实施方案》的要求，为及时了解血吸虫病流行动态及疫情变化，预测流行趋势，科学制定血吸虫病防治措施，评价防治效果，现将2009年血吸虫病监测结果报告如下。
监测内容与方法1.1 螺情监测2009-05上旬对该村历史有螺环境及所有可疑环境进行系统抽样（框距10m）和环境抽样调查。
捕获框内全部钉螺（每框=0.11m2），并解剖观察，鉴别死活，计算活螺平均密度和感染情况。
1.2 人群病情监测2009-11 对监测点6岁以上的全部常住居民采用间接血凝试验（IHA）进行筛查，血清阳性者采用改良加藤厚涂片法（Kato-Katz法），一粪三片进行病原学检查。
对当年该村晚期血吸虫病（下称晚血）患者进行个案调查，对检测点内急性血吸虫病（急血）患者进行个案调查。
1.3 家畜病情监测调查全部在有螺地带敞放的家畜，采用顶管孵化法进行检查（一粪一检）。
家畜监测与人群病情监测同步进行。
1.4 相关因素调查1.4.1自然与社会因素包括雨量、气温、自然灾害、人口流动、居民生产生活方式等。
1.4.2防治措施实施情况包括药物灭螺和环境改造、查病、治病（化疗）、健康教育、个人防护、改水改厕等。
1.5质量控制1.5.1 技术培训对调查螺情、病情专业技术人员按照《全国血吸虫病监测方案》进行培训。
药物灭螺应用于大面积江滩控制血吸虫病意义分析
药物灭螺应用于大面积江滩控制血吸虫病意义分析发表时间：2018-11-20T11:48:48.087Z 来源：《中国蒙医药》2018年第9期作者：李霞光[导读] 对于大面积江滩钉螺采取药物灭螺控制血吸虫病的研究讨论，分析其临床意义。
岳阳县血防医院湖南岳阳 414100【摘要】目的对于大面积江滩钉螺采取药物灭螺控制血吸虫病的研究讨论，分析其临床意义。
方法采用血吸虫病防治中心研发出来的药物应用于试区江滩钉螺，分别对试区、对照区试点周边8岁以上人群行血吸虫病血清检查，统计患者血吸虫病病例情况，观察灭螺相应指标及相应螺情。
结果对于大面积的江滩螺情，灭螺病情有所降低，居民血吸虫病感染率降低，小白鼠感染率降低，且钉螺密度下降，P ＜0.05。
结论药物灭螺应用于大面积江滩控制血吸虫病，减少了江滩大面积钉螺的密度，有效控制了螺情及居民的血吸虫疾病，但不能解决大面积江滩螺情及疫情，灭螺后一年，江滩钉螺仍在影响当地地区的环境。
【关键词】药物灭螺；大面积江滩；血吸虫病；意义分析血吸虫病是动物、人均能被感染的寄生虫病，属于感染病，并且伴随急性弥漫性腹膜炎[1]。
其具有极高的传染性，但治愈性较高，能够引发患者发热、胸痛及咳嗽、包括胃肠道等症状。
近年来，对于江滩灭螺问题不能得到有效的解决处理；直接导致了江滩钉螺面积扩大、阳性螺面积扩大、血吸虫病感染恶劣等一系列问题[2]。
我国钉螺疫情严峻，属于血吸虫病重灾区。
对于长江中下游钉螺问题，应当引起人们的重视。
研究发现，药物灭螺可以缓解螺情，降低大面积钉螺的密度，有效控制血吸虫病的发生，对人类健康及生活环境具有一定的积极意义。
江滩螺情采用药物灭螺的方式，研究药物灭螺应用于大面积江滩控制血吸虫病的意义并分析，试点为本地区4个大面积钉螺观测点，分为试区、对照区。
以下为详细报道。
1资料与方法1.1一般资料本次调查地属于血吸虫病较为严重的地区，累计情况为：钉螺面积180000m2。
且研究对象均是2015年4月～2018年4月在我辖区内的4个监测点，每年对检测点的钉螺数量进行统计学分析，对周边社区中8周岁以上的居民进行血吸虫病调查，以居委会为单位进行抽样调查[3]。
血吸虫病监测报告
血吸虫病监测报告调查前进渠灌区钉螺的分布情况及影响因素，为血吸虫病防治工作提供科学依据。
方法选择性的对前进渠德昌段的螺情分布进行调查，并根据调查情况对当地流动人口、常住人口及耕牛感染血吸虫情况进行检查。
结果穿过血吸虫病疫区(有螺、有病)的中型灌溉渠道前进渠德昌段有钉螺分布，杂草和农作物、秸杆、树枝等漂浮物顺水流入米易县境内，但未监测到钉螺，人群监测未发现病人。
结论钉螺生长繁殖的条件依然存在，邻县钉螺经水体输入的可能性极大，水体被病原体污染的机会很多，存在血吸虫病流行的潜在危险。
前进渠是米易县的一条中型灌溉渠道，起源于德昌县的永郎镇，渠道穿过血吸虫病疫区永跃村，距米易县第一个钉螺监测点仅15．8km，沟渠水面宽畅，水流平缓流速0．1 m／s。
洪水季节漂浮物较多，钉螺有可能随漂浮物迁栖至米易县而引起血吸虫病流行的可能性极大[1]。
米易县于1987年达到消灭血吸虫病标准后，仅于2008年发现过一处钉螺。
通过对前进渠水系钉螺分布情况进行分析，找出血吸虫病传入米易县的关键点，为制定有效的防控血吸虫病措施提供科学依据。
1 材料与方法1.1 调查点的选择：选择性的对前进渠德昌段的螺情分布和病情进行调查。
1.2 钉螺输入因素的调查：2000年-2004年前进渠监测点的调查。
1.3 输入传染源的调查：流动人口和常住人口的调查：对外来务工探亲访友及外出打工返乡人员，采用循环抗原法和粪便孵化法进行重点监测；耕牛的调查。
2 结果2.1 前进渠德昌段的螺情分布调查显示，德昌段仍为血吸虫病疫区，2003年还有一例急性感染性病人发生[2]。
对前进渠直接影响的永跃、永进两个村现仍有螺点8处，面积5455平方米，该螺点到目前为止未进行任何处理。
在渠道上面70米处查到一个螺点，面积约100平方米，最高密度1 5～20只／0.1m2，并且螺点与前进渠有小水渠直通。
2.2 钉螺输入性因素的调查根据米易县血吸虫病防治站2000-2004年对前进渠监测点的水上漂浮物、水生植物和灌溉面积进行了监测（表1）。
钉螺调查方法及要求
四、施药方法
（二）铲草皮沿边药浸 适用于积水多的河、沟、渠、塘等环境，不强
调保持水位。使用时将一定量药物沿水线上30～70cm撒布 于河岸，再将河岸滋生钉螺的草皮与药物一起铲入河边水 中，使土表、土内、水上、水下的钉螺同时受到药物的浸 杀作用，灭螺效果良好。铲草皮时先铲近水线处30cm，再 铲水线上较高处，铲的厚度一般在6～10cm,随铲随扫，将 草皮推到水线下，不使其露出水面，以免钉螺上爬。水利 防汛的堤岸不可采用本法。使用药物剂量为2g／㎡。
季。 5、钉螺的寿命一般为1年左右。 6、钉螺是水陆两栖，多孳生在土壤潮湿、杂草从生的河、
沟、渠、塘、田、滩等自然环境中。
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五、钉螺的知识
一、钉螺的分布： 1、钉螺沿河、沟渠岸的水线上下1米范围内分布，主要分布
在水线上33cm范围内。 2、宏观上随水系交错蔓延而呈网状分布。 3、沿河道和灌溉水系呈线状分布，但不均一。 4、水流缓慢的河道斜坡、沟渠及浅滩、稻田进出口、涵洞、
五钉螺的知识10五钉螺的知识水网型血吸虫病流水网型血吸虫病流行区钉螺孳生环境行区钉螺孳生环境11五钉螺的知识湖沼型血吸虫病流湖沼型血吸虫病流行区钉螺孳生环境行区钉螺孳生环境12五钉螺的知识山丘型血吸虫病流山丘型血吸虫病流行区钉螺孳生环境行区钉螺孳生环境13常见的易与钉螺混淆的相似螺类主要有
钉螺调查方法及要求
3、大面积洲滩灭螺可采用出水量大、功效高的灭螺机。大 面积滩地喷洒灭螺时须增加人员移动输水管。因此，一个 灭螺机组通常需6～12人。内陆、山区小面积复杂环境可采 用出水量较小，但机动灵活，移动方便的灭螺机。使用药 物剂量为2g／㎡- 。
四、施药方法
（四）喷粉法 1、喷粉灭螺法是使用动力喷粉机械实施药物灭螺的一种方
框数。
三峡工程运行后长江中游君山段江滩钉螺监测结果分析
三峡工程运行后长江中游君山段江滩钉螺监测结果分析徐润尧;曹剑;胡本骄;李以义;任光辉【摘要】目的：观察长江中游湖南君山段江滩钉螺分布的变化，分析三峡工程运行后钉螺分布的影响因素。
方法选择具有代表性的4块江滩作为监测点，开展钉螺纵向监测，并收集三峡工程运行前后的水情、泥沙等资料信息。
结果2003~2015年，江滩钉螺分布范围缩小了74.77%，面积减少了72.56%，活螺平均密度下降了97.20%，感染螺平均密度下降至0。
结论三峡工程运行后长江中游湖南君山段江滩钉螺分布范围、分布区域面积、活螺平均密度和感染螺平均密度均呈整体下降趋势。
%Objective To investigate the changes of Oncomelania hupensis snails in the marshlands at the middle reaches of Yangtze River along Junshan area, Hunan Province, after the Three Gorges Project being completed and fully functional. Methods Longitudinal monitoring on the snail prevalence was performed in the four distinctive marshlands, and corresponding data were collected on the changes of water levels and silt contents at the middle and lower reaches of Yangtze River before and fully functional Three Gorges Project. Results The marshlands with snail distribution and areas of marshlands were reduced by 74.77%and 72.56%, respectively, from 2003 to 2015. The density of live snails was decreased by 97.20%and infected snails were not found in 2015. Conclusion The areas with snail prevalence and snail distribution as well as average density of living snails and infected snails tend to decline in general at the middle reaches along Junshan area of Hunan Province after the Three Gorges project becoming fully functional.【期刊名称】《热带病与寄生虫学》【年(卷),期】2016(014)003【总页数】4页(P133-136)【关键词】三峡工程;江滩;钉螺;血吸虫病【作者】徐润尧;曹剑;胡本骄;李以义;任光辉【作者单位】414016岳阳市，岳阳市君山区广兴洲血吸虫病防治站;414016岳阳市，岳阳市君山区广兴洲血吸虫病防治站;湖南省血吸虫病防治所;湖南省血吸虫病防治所;湖南省血吸虫病防治所【正文语种】中文【Abstract】Objective To investigate the changes of Oncomelania hupensis snails in the marshlands at the middle reaches of Yangtze River along Junshan area,Hunan Province,after the Three Gorges Project being completed and fully functional.Methods Longitudinal monitoring on the snail prevalence was performed in the four distinctive marshlands,and corresponding data were collected on the changes of water levels and silt contents at the middle and lower reaches of Yangtze River before and fully functional Three Gorges Project. Results The marshlands with snail distribution and areas of marshlands were reduced by 74.77%and 72.56%, respectively,from 2003 to 2015.The density of live snails was decreased by 97.20%and infected snails were not found in 2015.Conclusion The areas with snail prevalence and snail distribution as well as average density ofliving snails and infected snails tend to decline in general at the middle reaches along Junshan area of Hunan Province after the Three Gorges project becoming fully functional.【Key words】Three Gorges Project,Marshlands,Oncomelania hupensis，Schitosomiasis三峡工程是一项举世瞩目的大型综合性水利工程，主要功能是防洪、发电、航运、供水。
基于重组酶聚合酶扩增技术的日本血吸虫感染性钉螺检测体系的建立与应用
第36卷第4期湖南理工学院学报(自然科学版)V ol. 36 No. 4 2023年12月 Journal of Hunan Institute of Science and Technology (Natural Sciences) Dec. 2023基于重组酶聚合酶扩增技术的日本血吸虫感染性钉螺检测体系的建立与应用冯惊涛1, 聂东宋2, 周松辉3, 柳勇波3, 李广平1(1. 湖南省血吸虫病防治所, 湖南岳阳 414000; 2. 湖南理工学院化学化工学院, 湖南岳阳 414006;3. 湖南康润药业股份有限公司, 湖南岳阳 414000)摘要:确定日本血吸虫感染性钉螺是进行日本血吸虫病疫情预警的重要依据. 现有日本血吸虫感染性钉螺的检测方法存在费时费力、设备昂贵、操作复杂等局限, 因此研发一种易于推广和使用的日本血吸虫感染性钉螺检测方法十分必要. 设计和开发一套基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的日本血吸虫感染性钉螺检测体系. 该检测体系可以在恒温(39 ℃)条件下、快速(20 min内)检测出浓度仅为103 copies/μL的目标基因; 结合简单的钉螺基因组DNA提取方法, 该体系可以方便、快捷地检测出1/20的日本血吸虫感染性钉螺(即20只阴性钉螺中混有1只日本血吸虫感染性钉螺).关键词:日本血吸虫; 钉螺; 重组酶聚合酶扩增中图分类号: R532.21 文献标识码: A 文章编号: 1672-5298(2023)04-0044-05Establishment and Application of Detection System forOncomelania Snails Infected by Schistosoma Japonicum Based on Recombinase Polymerase Amplification FENG Jingtao1, NIE Dongsong2, ZHOU Songhui3, LIU Yongbo3, LI Guangping1(1. Hunan Institute of Schistosomiasis Control, Yueyang 414000, China;2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Science and Technology, Yueyang 414006, China;3. Hunan Kangrun Pharmaceutical Co., Ltd., Yueyang 414000, China)Abstract: The determination of oncomelania snails infected by Schistosoma japonicum is an important basis for early warning of Schistosoma japonicum epidemic. The current methods for determining oncomelania snails infected by Schistosoma japonicum have some certain limitations, such as time-consuming and laborious, requiring expensive equipment, being complicated to operate. This study designes and develops a detection system for oncomelania snails infected by Schistosoma japonicum based on Recombinase Polymerase Amplification (RPA). The detection system established in this study can quickly (within 20 minutes) detect the target gene of in 103 copies/μl under constant temperature (39 ℃). Combined with a simple DNA extraction method from oncomelania snail genome, this system can easily and quickly detect oncomelania snails infected by Schistosoma japonicum in 1/20 (i.e. 1 positive mixed in 20 oncomelania snails).Key words: Schistosoma japonicum; oncomelania snails; Recombinase Polymerase Amplification0 引言日本血吸虫病是我国长江流域严重危害人民身体健康、影响经济社会发展的重大传染病之一, 具有防控难度大、影响范围广等特点. 根据2022年全国血吸虫病疫情通报, 疫情呈现持续向低趋势[1]. 但是钉螺分布面积居高不下, 某些年份还出现反弹, 因此需继续完善血吸虫病监测预警体系建设, 加强钉螺监测与控制, 防止疫情反弹, 保障血吸虫病消除工作的顺利进行[1,2].钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主, 钉螺感染日本血吸虫毛蚴后, 会孵育出大量的尾蚴, 污染其所在水域, 感染人、畜等日本血吸虫终末宿主. 消灭日本血吸虫感染性钉螺, 即可阻断日本血吸虫病的传播途径. 因此, 检测钉螺是否感染日本血吸虫是钉螺调查的重要内容.收稿日期: 2022-12-06基金项目: 湖南省卫生健康委科研计划课题(202112071586)作者简介: 冯惊涛, 男, 硕士, 主治医师. 主要研究方向: 诊断试剂的开发与应用通信作者: 李广平, 男, 硕士, 主任技师. 主要研究方向: 血吸虫病流行病学第4期冯惊涛, 等: 基于重组酶聚合酶扩增技术的日本血吸虫感染性钉螺检测体系的建立与应用 45 现行检测日本血吸虫感染性钉螺的主要方法包括压碎镜检法、逸蚴法、荧光定量PCR法、环介导等温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)等[3]. 压碎镜检法、逸蚴法等病原学检测方法虽然准确性高, 但需要耗费大量的人力、物力, 且在操作过程中暴露风险大. 随着分子生物检测技术的发展,荧光定量PCR法、LAMP法等方法克服部分前述缺点, 逐渐应用于实践, 并且敏感性较高. 然而, 荧光定量PCR法操作复杂、仪器设备昂贵, 而现行LAMP法在结果判定方面存在一定问题, 容易出现假阳性[3,4].重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)技术是一种恒温核酸扩增技术, 具有反应速度快(反应时间约20 min)、检测敏感度高(接近PCR)、仪器设备要求简单(39 ℃恒温扩增, 不需要热循环仪)、实时监测结果(可以使用荧光探针)等诸多优点[5], 在食品安全管理[6]、动物病毒检测[7]、病原体检测[8]等方面获得广泛应用. 因此, 本文拟基于RPA技术建立一种方便快捷的日本血吸虫感染性钉螺检测体系, 为日本血吸虫感染性钉螺的确定提供一种方法选择.1 材料与方法1.1 标本、试剂与主要仪器1.1.1 钉螺选择6~7旋成年湖北钉螺(Onelania hupensis)为实验检测钉螺, 来自洞庭湖湖沼型流行区. 阴性钉螺:饲养1周后经逸蚴法确定为阴性钉螺; 阳性钉螺(日本血吸虫感染性钉螺): 实验室人工感染培养获得.1.1.2 实验试剂RPA扩增试剂(TwistAmp® exo Kit、TwistAmp® Basic Kit)购自英国TwistDX公司; Tris-base购自Sigma公司; 2×SanTaq PCR Mix预混液、DNA 分子量标准Marker B、5×TBE缓冲液、琼脂糖、引物及探针购自生工生物工程(上海)股份有限公司; 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司; GelStain购自北京全式金生物技术股份有限公司; 其他试剂均为国产分析纯.1.1.3 主要仪器设备BIO-RAD DNAEngine Peltier Thermal Cycler, 上海宏石SLAN-96P全自动医用PCR系统.1.2 钉螺基因组DNA的提取试剂盒法: 每10只钉螺为一组, 压碎去壳, 用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA, 然后将提取的基因组DNA混合为相应的分组(分别为10、20、50、100只钉螺组), 放入−20 ℃冰箱备用.NaOH裂解法: 每10只钉螺为一组, 压碎去壳, 放入2 mL离心管中(每个离心管预装有500 μL、50mM的NaOH), 用研磨棒研碎、混匀, 95 ℃水浴10~30 min, 充分颠倒混匀悬浊液2~5次. 水浴完毕, 冷却标本悬液, 掌上离心机离心数秒, 取上清30 μL, 加入等体积的1 M Tris-HCL (pH 8.0)混匀. 然后再次用掌上离心机离心十数秒, 取上清, 并混合为相应的分组(分别为10、20、50、100只钉螺组), 放入−20 ℃冰箱备用.1.3 构建日本血吸虫基因SJR2片段的T载体以RPA反应体系正向引物和反向引物为引物, 以提取的日本血吸虫的基因组DNA为模板进行PCR扩增. 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后与pMD18-T载体进行连接, 然后转染大肠埃希氏菌Top10, 并通过氨苄青霉素平板倒置培养、蓝白斑筛选、测序等, 得到含日本血吸虫基因SJR2片段的T质粒(pMD18-SJR2). 对含该质粒的菌株进行扩大培养, 并抽提质粒、测定浓度备用.1.4 基于RPA技术的日本血吸虫特异性基因检测体系1.4.1 引物和探针设计日本血吸虫非长末端重复反转录转座子基因SJR2(AY027869)的基于RPA技术的扩增引物和探针, 其序列正向引物为5'-CCC AAG TCT CAG TGA AGT TGT GAA GGC TAT, 反向引物为5'-GTT AGT46 湖南理工学院学报(自然科学版) 第36卷GTT CGA GAC CAG TCA GAT GGG ATT, 探针为5 -CTT AAA GCG AGG GAG AGC GGC AGG ACC AGA(dT-FAM)G(THF)A(dT-BHQ1) TGA CCC CTG AGA TAT, 交由上海生工合成, 然后将合成的引物和探针稀释成10 mM 的浓度备用.1.4.2 基于RPA 技术的日本血吸虫特异性基因检测体系的建立用TwistAmp®试剂盒中的再水化缓冲液再水化RPA 试剂冻干粉, 充分溶解, 然后配制检测体系. 每个体系包括再水化后的溶液11.8 μL 、双蒸水1.2 μL 、正反向引物各0.4 μL 、探针0.2 μL 、280 mM 醋酸镁1 μL(开始反应前加入)、待测基因溶液5 μL.1.4.3 基于RPA 技术的日本血吸虫特异性基因检测体系的反应条件将配置好的扩增检测体系充分混匀, 然后离心使反应液沉积在反应管底部, 放入核酸扩增检测仪, 39 ℃反应20 min, 同时监测荧光, 最后85 ℃灭活反应体系2 min, 使反应体系活性成分灭活.1.5基于RPA 技术的日本血吸虫特异性基因检测体系的敏感度分析对构建的T 质粒(pMD18-T-SJR2)提取质粒、测定浓度(μg/mL), 根据物质的量来计算其单位体积内的拷贝数 (碱基对的相对分子质量按650/对计算).然后用TE 缓冲液对pMD18-T-SJR2进行等比例序列稀释, 得到终浓度分别为100~106 copies/μL 的稀释液, 用来作为模板, 测定日本血吸虫特异性基因检测体系的敏感度.2 结果2.1日本血吸虫基因SJR2片段的T 载体构建以试剂盒法提取的日本血吸虫感染性钉螺的基因组DNA 为模板, 以本文设计的基于RPA 技术的正向引物和反向引物为引物进行PCR 扩增, 扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳, 结果如图1所示. 扩增的目标基因大小与理论值(186 bp)相符. 然后将扩增的目标基因克隆到pMD18-T 载体中, 并进行测序, 结果如图2所示. 不难看出, 其碱基序列与基因库中SJR2(AY027869)的序列基本一致. 图2 日本血吸虫基因SJR2片段的测序结果2.2 基于RPA 技术的日本血吸虫特异性基因检测体系的敏感度分析以浓度分别为100~106 copies/μL 的pMD18-SJR2稀释液为模板, 分析基于RPA技术的日本血吸虫特图1 PCR 扩增的日本血吸虫基因SJR2片段的琼脂糖凝胶电泳图第4期冯惊涛, 等: 基于重组酶聚合酶扩增技术的日本血吸虫感染性钉螺检测体系的建立与应用 47 异性基因检测体系的敏感度, 结果如图3所示. 当pMD18-SJR2浓度为103 copies/μL时, 检测体系能方便快捷地将其检测出; 但当pMD18-SJR2浓度进一步降低后(100~102 copies/μL), 检测结果变得不稳定, 但仍能检测到. 图3中100、101、102、103、104、105、106指模板pMD18-SJＲ2的质粒浓度(copies/μl).2.3 基于RPA技术的日本血吸虫特异性基因检测体系的应用用日本血吸虫特异性基因检测体系检测试剂盒法提取钉螺基因组DNA, 结果如图4所示. 每50只钉螺中只要含有1只日本血吸虫感染性钉螺, 就可以被准确检测出, 最低可以检测出100只阴性钉螺中混有1只感染性钉螺的情况. 为了进一步简化实验操作流程, 设计NaOH裂解法提取钉螺基因组DNA用作模板, 结果如图4所示. 只要20只阴性钉螺中混有1只感染性钉螺, 即可被本文检测体系准确检测出来, 最低可以检测出50只阴性钉螺中混有1只感染性钉螺的情况. 图4中106指模板pMD18-SJＲ2的质粒浓度(copies/μL), 样本1和样本3分别为50只和100只钉螺中含1只日本血吸虫感染性钉螺的试剂盒法提取样本, 样本2和样本4分别为20只和50只钉螺中含1只日本血吸虫感染性钉螺的NaOH裂解法提取样本.图3 基于RPA技术的日本血吸虫特异性基因检测体系的敏感度分析图4 RPA法日本血吸虫核酸扩增检测体系在样本检测中的应用为了进一步研究基于RPA技术的日本血吸虫特异性基因检测体系的使用价值, 再使用该体系对湖南省内11个监测点采集的钉螺样本进行检测(试剂盒法提取钉螺基因组DNA, 混合为50只/检测体系备用),结果均为阴性, 与本实验室疫情监测结果一致.3 讨论经过多年积极努力, 我国血吸虫病防治工作取得了巨大成就, 目前正朝着消除血吸虫病的伟大目标稳步前进. 但是, 当前消除血吸虫病工作面临着传染源管理难、钉螺控制难等诸多挑战[9]. 钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主, 查螺、灭螺是阻断日本血吸虫病传播的重要防控措施. 而钉螺作为一种生物, 本身就难以被彻底消灭. 因此, 通过检测日本血吸虫感染性钉螺进行疫情预警, 消灭重点地区的感染性钉螺,是控制日本血吸虫病传播的重要手段. 目前, 检测日本血吸虫感染性钉螺的方法有多种, 包括肉眼观察法、压碎镜检法、逸蚴法、荧光定量PCR法、LAMP法等[3], 但是每种方法都有各自的局限性, 因此开发出方便快捷、结果准确的检测日本血吸虫感染性钉螺的方法具有重要的现实意义.RPA技术是一种恒温核酸扩增技术, 与PCR相似, 它不但可以使用正、反向引物对目标基因进行扩增, 而且可以使用荧光探针对基因扩增情况进行实时监测, 从而达到快速检测靶基因目标[5,10]. 同时, 因为RPA技术是一种恒温扩增技术, 不需要热循环, 所以反应速度非常快(20 min内就可以出结果). 另外,RPA反应体系的核酸扩增温度一般在25~42 ℃之间, 不需要很大的电能, 便携性容易实现. 因此, 本文采用RPA技术研发确定日本血吸虫感染性钉螺的检测体系.除了RPA技术, 恒温核酸扩增技术还包括LAMP、转录介导的扩增(TMA)/核酸序列依赖的扩增(NASBA)、交叉引物扩增(CPA)、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖的扩增(HDA)、信号介导的扩增RNA(SMART)、链替代扩增(SDA)、单引物恒温扩增(SPIA)等一系列技术[11]. 而且, 某些恒温核酸扩增技48 湖南理工学院学报(自然科学版) 第36卷术还可以与规则成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白系统(CRISPR/Cas)相结合, 从而改善其非特异性扩增, 并实现对扩增产物的实时监测[12,13]. 但是, 只有RPA技术既具有类似PCR技术的扩增与检测原理, 又具有较低温度(25~42 ℃)恒温扩增的优势.基于RPA技术的日本血吸虫感染性钉螺检测体系的建立, 引物、探针的设计与筛选至关重要. 通过实验测试, 本文设计的引物和探针敏感度和特异性均较好[14]. 钉螺基因组DNA提取和纯化是影响整个检测体系的一个重要部分. 一般情况下, 钉螺基因组DNA的提取需要蛋白酶K消化(试剂盒法), 用时较长(3 h甚至需要过夜), 并且需要使用台式高速离心机, 这使得RPA技术反应速度快、仪器设备要求简单等的优势几乎荡然无存. 因此, 本文采用NaOH裂解法提取钉螺基因组DNA, 该方法提取速度快(0.5 h左右), 仪器设备要求简单(掌上离心机即可). 经过优化, NaOH裂解法提取的钉螺基因组DNA可以用于基于RPA技术的日本血吸虫特异性基因检测体系. 使用该方法提取钉螺基因组DNA作为模板, 虽然敏感度有所降低, 但是简化了提取步骤, 降低了对仪器设备的要求, 实用性更强, 即使在条件简陋的基层实验室也可推广使用.4 结束语本文根据日本血吸虫感染性钉螺的特点, 设计了操作简便、反应快速、结果准确的恒温核酸扩增检测体系, 为日本血吸虫感染性钉螺的检测提供了一种有价值的方法选择.参考文献:[1]张利娟, 何君逸, 杨帆, 等. 2022年全国血吸虫病防治进展[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2023, 35(3): 217−224+250.[2]张利娟, 徐志敏, 杨帆, 等. 2021年全国血吸虫病防治进展[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2022, 34(4): 329−336.[3]国家卫生计生委. 国家卫生计生委关于印发血吸虫病消除工作规范的通知[EB/OL]. (2018-02-28)[2018-03-05]. /jkj/s5873/201803/ce9e1b1c398f4ead9914f3005fea0b4e.shtml[4]石磊, 王曼, 时国强, 等. 环介导等温扩增技术研究进展[J]. 河北大学学报(自然科学版), 2021, 41(5): 565−571.[5]Tan M, Liao C, Liang L, et al. Recent advances in recombinase polymerase amplification: Principle, advantages, disadvantages and applications[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2022, 12: 1019071.[6]王帅, 杨艳歌, 吴占文, 等. 重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展[J]. 食品科学, 2023, 44(9): 297−305.[7]秦立得, 南文龙, 陈义平. 重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病毒病检测中的应用[J]. 中国动物检疫, 2017, 34(5): 81−85.[8]王贝贝, 马爱敏, 孙肖红. 重组酶聚合酶扩增技术在病原体快速检测中的应用[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2021, 44(1): 73−76.[9]汪伟, 杨坤. 开展精准防控, 推动我国消除血吸虫病进程[J]. 中国热带医学, 2020, 20(7): 595−598.[10]Piepenburg O, Williams C H, Stemple D L, et al. DNA detection using recombination proteins[J]. PLoS Biology, 2006, 4(7): 1115−1121.[11]Srivastava P, Prasad D. Isothermal nucleic acid amplification and its uses in modern diagnostic technologies[J]. 3 Biotech, 2023 13: 200.[12]李梦茹, 秦志强, 殷堃, 等. 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岳阳鹿角地区钉1. 岳阳市鹿角地区血吸虫病的流行现状
岳阳市临湘地区滨江临湖，水系复杂，地理位置特殊，洲滩面积大，一直是全国血
吸虫病重度流行区之一。全市除平江县外，其他 11 个县（市）区、开发区、管理区和
岳阳监狱都是血吸虫病流行区域。截至 2012 年底，全市 130 个疫区乡镇有 81 个乡镇、
血吸虫病现场调查实验
一、实验目的： 了解病原生物流行病学调查的一般方法。
二、查螺方法 三、数据统计分析
1. 钉螺分布密度 钉螺密度 = 框平均螺数 x 9 = 钉螺密度（个/M2）
2. 钉螺死活鉴别及活螺率 肉眼法 培养法 钉螺死活率(%) = 活螺数 / 检获钉螺总数 x 100%
3. 钉螺阳性率 阳性钉螺鉴别：肉眼法、指管法、压碎法 阳性率(%) = 阳性钉螺数 / 检查钉螺数 x 100 (%)
检获钉螺 总数
钉螺密度 （个/M2）
1
2
3
4
56
5
17
10
60
90
6 11 7
15170
24
267
216
75
9
26
25
99
225
87
1
7
合计
/
/
4
25
36
a) 钉螺死活率
分组 1 2 3 4 5 6 7 8
合计
岳阳临湘地区钉螺活螺率调查表
检查钉螺数
活螺数
活螺率（%）
60
52
87
267
222
83
99
86
86
25
12
48
b) 钉螺感染血吸虫阳性率 岳阳临湘地区钉螺阳性率调查表
分组 检查钉螺数
阳性钉螺数
阳性率（%）
1
2
3
4
5
52
8
15
6
222
16
7.2
7
86
6
6.98
8
12
合计
5
41.67
4． 讨论/结语
本次调查阳性螺检出率为 7%。究其原因，可能为：一是由于药物灭螺或环境改造均很难消 灭临湘外洲钉螺，药物灭螺仅能降低水体感染性；二是临湘泥沙淤积导致有螺面积增加，有 螺洲滩增多；三是由于临湘洲滩牧草丰富，传统的养殖观念短时间内难以改变，牛羊等血吸 虫病传染源难以控制；四是由于有螺水系为渔业及交通的黄金水道，渔船民及流动人口众多， 难以管理；五是由于距大堤 1 000 m 以内的血吸虫病流行村达 1500 多个，加之涵闸引水时 会导致垸外钉螺不同程度地随水流进入垸内孳生、扩散，当垸外存在尾蚴时，尾蚴可随水流 进入垸内沟渠、农田等引起垸内感染。因此，距大堤 1 000 m 以内有螺环境治理的意义重大。 本次调查虽未发现感染性钉螺，但当地居民有新感染发生，提示有感染性钉螺存在，故难以 定性为非易感环境。
947 个村通过市级验收，达到血吸虫病传播控制标准，占达标乡镇总任务的 61.5%和达
标村总任务的 71.9%。其中有 32 个乡镇、280 个村达到血吸虫病传播阻断标准。
2． 调查方法
环境落框法
3． 结果
3.1 钉螺分布密度
岳阳临湘地区钉螺分布密度调查表
分组
查螺 框数
检获钉螺数（个/框）
最少
最多
平均