第11章 基因组学与比较基因组学

dNTP （其中一种为 α-32P 标记），将此反应物分
为 4 等份，每份内加入一定比例的一种 ddNTP ， 如此形成 A、 T、 C 、 G四个反应体系，最后在各 反应体系中加入DNA聚合酶催化DNA片段合成。 这样各反应体系中即可形成以一种 ddNTP残基为
3’端结尾的一系列长短不一片段。
Template
dATP
dNTP
Primer
Polymerase
Terminator
A
G
C
T
PE Applied Biosystems
THE PROCESS
A C T G G C C TAAT C G A G T C A G T TGACCGGA T
C
T C C A A C
G
G T G G T
A T
G
C
A
G
T
A
C
人类基因组计划的科学意义

（1）确定人类基因组中约数万个编码基因的序列 及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及 其功能。 （2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从 整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转 录后调节。 （3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序 列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解 各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基 因转录及表达调控中的影响与作用。
以荧光化合物标记双脱氧核苷酸的自动测序
（二）鸟枪法测序技术及其改良

基因组的每条染色体长度可达数百万碱基对以上，
将链终止法测定的小片段 DNA组装成真实的排列
顺序是一项浩繁而精细的工作。

DNA顺序的组装主要方法： 全基因组鸟枪法测序 改良鸟枪法：大片段克隆法、靶标鸟枪法
1、全基因组鸟枪法测序
DNA序列 分析技术
鸟枪法测 序技术及 其改良
（一）DNA序列分析技术

DNA序列测定： 是指 DNA 一级结构的测定，是在核酸酶学和 生物化学的基础上，创立并发展起来的一门重 要的DNA技术学。
DNA序列测定的技术
经典方法:
双脱氧链末端终止法(Sanger,1977) DNA化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)
DNA测序自动化步骤：
4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPs Sanger测序反应 反应产物电泳分离 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出
四种不同波长的荧光
荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序
Template
dNTP
Polymerase
Primer
Terminator
A C G T
新技术方法:
杂交测序法
质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法
DNA芯片法
1、双脱氧链末端终止法
•是 由 英 国 剑 桥 分 子 生物学实验室的生物 化学家F. Sanger等人 于1977年发明的。
•利 用 双 脱 氧 核 苷 酸 作为链终止物测定 DNA 核 苷 酸 顺 序 的 方法。
PE Applied Biosystems
THE PROCESS
A C T G G C C TAAT C G A G T C A G T TGACCGGA T
G C
T T G T G G C C T T
C C A A
A
C
A
G
A
C
G
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
特 性 ， 在 DNA 合 成 反 应 中 ， 加 入 ddNTP ，
ddNTP不存在 3′-OH末端，故不能与下一个核 苷酸的 5′-P 端形成 3′ 、 5′- 磷酸二酯键，导致 DNA新链的延伸提前终止于ddNTP 。
ATP、dATP和ddATP的结构
ATP dATP
ddATP

这样以待测序列的 DNA 为模板，加入引物和 4 种
第11章
基因组与比较基因组学
什么是基因组，基因组学？

基因组（Genome）：是指生物体的单倍体细胞
中所有的 DNA ，包括细胞核内的 DNA 和各种细 胞器中的DNA，是生物体内遗传信息的集合。

基因组学（genomics）：是研究并解析生物体整 个基因组所有遗传信息的一门学科。
基因组学的发展：从序列到功能
基因组计划的主要任务是获得全基因组序 列； 现在的测序方法每次只能测800-1000bp， 大量的测序片段要拼接； 要知道序列在染色体上的位置才能正确拼 接，因此需构建基因组图谱。
教学内容


一、高通量DNA序列分析技术
二、人类基因组计划 三、比较基因组学
一、高通量DNA序列分析技术 DNA 序列分析
即人类 3号染色体短臂上
约30Mb的测序任务。
（一）人类基因组计划概述
1986 年 诺 贝 尔 奖 获 得 者
R.Dulbecco （ 杜 尔 贝 科 ） 提
出人类基因组计划——
测出人类全套基因组的 DNA
碱基序列（ 3 X 109 bp ）
•
1988 年美国能源部和国家卫生研究院率先在美国 开展人类基因组计划，并经国会批准由政府给予 资助。此后，成立了一个国际间的合作机构 —— 人类基因组织 (Human Genome Organization)，由 多个国家筹集资金和科研力量，积极参加这一国 际性研究计划。
根据染色体上已知基因或遗传标签的位置来确定
部分DNA片段的排列顺序，再逐步确定各片段在
染色体上的相对位置，是建立在基因组图谱基础
上的”鸟枪法” 。
教学内容


一、高通量DNA序列分析技术
二、人类基因组计划 三、比较基因组学
二、人类基因组计划
人 类 基 因 组 计 划
（ Human genome project ） 于 1990 年 启 动 ， 我 国 于 1999 年 加 入 该 计 划，承担其中 1%的任务，
2、高等生物基因组中存在大量的基因间隔区， 遗传图中留下大片的无标记区段。 3. 只有部分基因其等位基因成员可以通过常规 实验予以区分，因而产生的遗传图是不完整的。
（2）限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphisms, RFLP）



（4）研究空间结构对基因调节的作用。 （5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。 （6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解 疾病的分子机制，为疾病的诊断、预防和治疗提供 理论依据。

（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒 残余序列，研究其周围序列的性质。
遗传图谱
转录图谱
遗传图谱的标记是什么呢？
标记1
标记2
染色体上的基因和DNA序列均 可作为路标, 他们由特定的DNA 顺序组成. 路标位于染色体上的位置是固 定的，不会更改的，从而而提 供了作图的依据。
标记3
遗传标记


最早的遗传标记——基因
第一代遗传标记——限制性片段长度多态性
第二代遗传标记——简单序列长度多态性


延伸-终止反应
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳


放射性自显影
阅读测序结果
双脱氧链末端终止法要求单链作为模板
如何得到单链DNA ？

将DNA克隆到质粒载体
将DNA克隆到M13噬菌体载体
将DNA克隆到酵母测序自动化

DNA 测序的自动化是在 Sanger 的双脱氧链末 端终止法的基础上在1987年由美国应用生物系 统公司进一步发展起来的激光测序法，其基本 原理与末端终止法一样，都是通过ddNTP竞争 性的终止新合成的DNA链。
人类和水稻的第一张基因组草图完成； 2001 人类基因组测序（精细图）完成； 水稻（籼稻和粳稻）基因组草图完成。 2003年4月，人类基因组序列图（完成图）完成。
二000年六月二十六日克林顿宣布 人类基因组草图绘制完成

2000年6月26日，美国总统克林顿(中)、塞莱拉公司 董事长兼首席科学家克雷格· 文特尔(左)和人类基因 组计划首席科学家弗胡西斯· 柯林斯(右)在华盛顿白 宫参加庆祝人类基因组草图绘制成功。
1980年诺贝尔奖金获得者F. Sanger
（1）Sanger 双脱氧链末端终止法测定DNA 序列的基本原理：

以DNA合成反应为基础，加入ddNTP生成特定
末端不同长短的DNA片段；

聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核
苷酸的DNA分子。
DNA合成反应
利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的
第三代遗传标记——单核苷酸多态性
（1）基因是首先被使用的标记
孟德尔 → 豌豆植株高矮、豌豆的形状等
摩尔根 — 显微镜、肉眼→ 果蝇躯体颜色、翅膀 形状等
生化表型→细菌、酵母遗传学研究；人类中如血 型系列（ABO）分析、血清蛋白和免疫蛋白
基因是非常有用的标记，但并不是理想的，基 因标记的缺点：
1、可用作标记的基因十分有限，许多性状都涉 及多基因。
鸟枪法的局限：
拼接组装困难：对于结构复杂的大基因组而言，
鸟枪法的序列组装的起始阶段工作量非常大。。 重复序列的存在：在序列组装时可能出现错误连 接，使某些片段从原位置跳到另一无关位置。因 此，对于缺少重复顺序的小基因组（ <5Mb ）而 言，鸟枪法仍为最佳的选择，但对于大基因组而 言，还需要更加有效的策略。
鸟枪法的顺序组装是直接从已测序的小片段中寻 找彼此重叠，然后依次向两侧邻接的序列延伸。
DNA的鸟枪法测序的主要步骤

第一，建立高度随机、的末端测序。