植物的病毒检测技术
植物病毒鉴定方法有
植物病毒鉴定方法有
植物病毒鉴定是一种诊断学技术，用于识别植物病毒，鉴定植物病毒是防治植物病害的关键。
目前，植物病毒鉴定在植物病理研究、病原鉴定和其他生物技术领域都得到了很高的应用价值。
植物病毒鉴定可分为微生物学分析、化学分析、生物学分析和分子生物学分析4个方面，以尽可能准确地评估病毒引起的病害发生可能性。
1. 微生物学分析：主要检测病原体的传播性的分布特征，以及病原物的特异性和症状，如植物病理学、扫描电镜网织菌病毒鉴定等。
2. 化学分析：检测病原体的化学物质，如叶绿窿面农物质、唾液核酸酶鉴定等。
3. 生物学分析：采用分子大小分离技术，如集群分析、放射致性等，检测病原体的细胞结构特征。
4. 分子生物学分析：采用分子分析来识别和鉴定不同种类的病毒，如质粒克隆鉴定（PCR）、单克隆抗体试验、DNA杂交等。
植物病毒鉴定可以有效地准确定位病原，及早识别病原体，起到重要的防治作用。
因此，正确无误地使用植物病毒鉴定技术对植物病害的防治至关重要。
植物病毒的鉴别和检测方法研究
植物病毒的鉴别和检测方法研究植物病毒是影响植物健康和产量的主要因素之一。
对于农业和园艺领域，发现和鉴别植物病毒是至关重要的。
然而，由于病毒的微小尺寸、繁殖速度快且具有高度变异性和适应性等特性，在不加以特殊处理的情况下很难鉴别和检测。
因此，开发高效的植物病毒鉴别和检测方法已成为当前研究热点之一。
一、植物病毒的鉴别方法1. 细菌性斑点病法（Bacterial Spot Test）该方法通过施加细菌性斑点病感染物质，并观察植物叶片上斑点的形成来确定是否感染病毒。
该方法操作简单、直观易懂，但只能用于一些植物病毒的初步鉴定，无法确定所感染的具体类型和种类。
2. 酶联免疫吸附检测法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）该方法通过利用特定的抗体与病毒抗原反应，形成免疫复合物，再用酶作为信号反应物进行检测。
该方法的优点在于检测灵敏度高、精准度高、直观易懂，同时适用于多种植物病毒的鉴别。
但是，该方法对于一些种类不太熟悉的病毒，需要提前准备特定的抗体和病毒抗原，且操作过程比较繁琐。
3. 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）该方法通过利用特定引物和酶，扩增目标病毒基因序列，并通过凝胶电泳等方式进行验证和鉴别。
该方法优点在于操作快速、准确度高、适用范围广，可以扩增低浓度的病毒Ap发现，同时还可以检测多个病毒基因序列，具有一定的实用性。
但是该方法的缺点在于设备成本高，且无法确定扩增物中病毒成分的比例。
二、植物病毒的检测方法1. 病毒杂交法（Virus Hybridization）该方法通过利用核酸探针与目标病毒中特定序列的杂交，形成稳定的杂交产物，并通过凝胶电泳等方式进行检测。
该方法优点在于具有较高的检测敏感性和特异性，同时可以定量分析病毒的含量，而且不受病毒变异性的影响。
该方法的局限性在于需要提前准备特定的核酸探针，对于多个病毒的检测需要分别合成多个核酸探针，操作较为繁琐。
植物病毒病检测方法
植物病毒病检测方法植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。
植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。
常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。
1.4.1侵染力测定法侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。
它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。
设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。
侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。
侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。
局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。
这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。
所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。
一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。
淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。
Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。
将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。
当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。
这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。
植物检疫一些重要检验方法的原理和优缺点
植物检疫一些重要检验方法的原理和优缺点植物检疫是农业生产中非常重要的一个环节，它可以有效地防止病虫害的传播，保障农作物的健康成长。
而在植物检疫过程中，一些重要的检验方法也是必不可少的。
那么，这些检验方法到底是怎样工作的呢？它们各自又有哪些优缺点呢？下面就让我们一起来了解一下吧！我们来了解一下植物病原菌检测的方法。
这种方法主要是通过观察植物的生长状况、叶片颜色、茎干硬度等特征来判断是否感染了病原菌。
这种方法的优点是操作简单、成本低廉，而且可以在现场进行快速检测。
但是，它的缺点也比较明显，那就是只能对表面症状进行初步判断，无法深入了解病原菌的内部情况，因此可能会漏检或误判。
接下来，我们再来了解一下植物真菌毒素检测的方法。
这种方法主要是通过采集植物样品后进行实验室分析，从而判断是否含有真菌毒素。
这种方法的优点是可以准确地检测出真菌毒素的存在与否，对于保护消费者健康具有重要意义。
但是，它的缺点也比较明显，那就是需要较长时间的实验室处理过程，且成本较高。
我们再来了解一下植物疫病病毒检测的方法。
这种方法主要是通过观察植物的生长状况、叶片颜色、茎干硬度等特征以及对植物组织进行切片染色等方式来判断是否感染了疫病病毒。
这种方法的优点是可以深入了解病原体的内部情况，对于诊断和治疗具有重要意义。
但是，它的缺点也比较明显，那就是操作复杂、成本较高，且需要较长时间的实验室处理过程。
不同的植物检疫检验方法各有优缺点。
在实际应用中，我们需要根据具体情况选择合适的方法进行检测，以确保植物检疫工作的顺利进行。
我们也需要不断地探索和创新新的检验方法和技术，以提高植物检疫的效率和准确性。
只有这样，我们才能够更好地保障农作物的健康成长和人们的食品安全。
植物病害的快速检测
植物病害的快速检测植物是人类生活中不可或缺的一部分，它们不仅是我们的食物来源，更是环境中的重要组成部分。
然而，植物在生长过程中也会遭受各种病害的威胁。
植物病害不仅使得产量降低，还可能对环境造成危害。
因此，快速检测并及时识别植物病害变得尤为重要。
目前，植物病害的快速检测技术已经有了很大的发展。
以下会根据不同的检测方法进行分章介绍。
一、生物学检测方法生物学检测方法是利用生物学技术的手段，通过对植物病原菌的生理生化特性、形态学特征等进行研究，以达到快速检测的目的。
其中，酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的生物学检测方法。
ELISA技术可以在病原菌分泌的外膜蛋白、产生的抗原等生物学产物中迅速检测出相应的抗体。
该方法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点。
因此，ELISA技术已经成为工业化生产中检测病原菌的常用技术。
二、分子生物学检测方法分子生物学检测方法主要是利用分子生物学技术手段，对植物病原菌的基因组进行检测。
其中，聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR技术是常用的分子生物学检测方法。
PCR技术是一种利用酶扩增DNA的产物的方法，它可以在一个反应体系中扩增大量的DNA。
PCR技术的快速检测特点是适用于少量DNA标本，而且检测速度快，灵敏度高，可以检测到微量量的目标序列。
PCR技术在生物检测和医学检测等领域得到了广泛应用。
实时荧光定量PCR技术是一种利用荧光探针来检测PCR反应产物的方法。
该技术通过对PCR反应体系中的荧光信号进行实时监测，可以快速、准确地检测植物病原菌。
实时荧光定量PCR技术具有检测速度快、灵敏度高、准确度高等优点，因此在疫情监测、病原检测等领域得到了广泛应用。
三、纳米技术检测方法纳米技术检测方法是指利用纳米技术通过制备纳米结构来检测植物病原菌，其中，纳米结构材料可以是纳米粒子、纳米管和纳米线等。
纳米技术检测方法具有高效、快速、便携等优点，已经成为植物病原菌检测领域的重要技术。
植物病毒检测技术研究进展详解
植物病毒检测技术研究进展刘茂炎摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。
以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。
不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。
在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。
本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。
关键词：植物病毒；检测技术；PCR病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。
常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。
生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。
1.生物学鉴定最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。
如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。
目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。
1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。
国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，玉米是灰飞虱的桥梁寄主而非最适寄主[2]，以玉米作为指示植物可以良好地鉴定RBSDV。
植物体内病原生物的检测技术
植物体内病原生物的检测技术随着农业发展的不断深入，植物病害的问题也日益突出。
病原菌、病毒、真菌等病原生物是导致植物病害的主要原因之一，如何及早发现和准确检测这些病原生物，对于及时防控植物病害、保障农业生产和粮食安全具有重要意义。
本文旨在介绍植物体内病原生物的检测技术。
一、PCR技术PCR技术作为一种高灵敏度、高特异性的检测技术，已经广泛应用于植物体内病原生物的检测中。
该技术通过特异引物与待检测的病原生物DNA结合，利用聚合酶链反应技术扩增出特异的DNA片段，从而判断待检测样品中是否存在病原生物。
PCR技术的优点是具有高灵敏度、高特异性、检测速度快等特点，缺点是需要经过特殊培养基种植样品，对于检测样品的纯度要求较高。
二、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种高通量的检测技术，可以用于同时检测多种植物体内病原生物。
该技术通过将大量的特异性蛋白质固定在芯片上，与待检测的样品中特异性结合的蛋白质相互作用，从而检测样品中是否存在病原生物。
蛋白质芯片技术的优点是具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点，缺点是价格昂贵，需要专业的设备和技术支持。
三、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术是一种直接检测待检测样品中未知细菌和真菌等病原生物存在性的方法。
该技术通过将特异性DNA探针标准荧光染料，与待检测样品中的细胞核酸结合，从而识别待检测的病原生物。
这种方法在细胞级别上确定病原生物的变化，可以快速、高效地检测特定病原体。
但是，由于该技术需要采集样品后，进行特殊的处理过程，操作较为复杂，需要一定的技术支持。
四、免疫学检测技术免疫学检测技术是一种检测植物体内病原生物的重要方法之一，基于病原生物和植物之间的免疫反应原理，通过对待检测样品中特定抗体或抗原的结合反应来检测植物体内病原生物的存在。
该技术具有操作方便、灵敏度高、检测速度快等优点，但是该方法容易出现交叉反应的情况。
结语对于检测植物体内病原生物，不同的技术具有各自特点，根据不同的需要选择不同的检测技术来进行检测。
植物病毒病检测及防治的研究进展
植物病毒病检测及防治的研究进展摘要：植物病毒病又称植物癌，给农作物及经济作物带来了严重危害，降低了农作物产量和质量，每年仅在我国因病毒感染农作物造成的损失就可达200亿美元，植物病毒病造成的损失是世界人口生存的威胁之一。
关键词：植物病毒病；检测；防治一、植物病毒病的检测技术病毒有两种，以DNA为遗传物质的病毒称为DNA病毒，以RNA为遗传物质的病毒称为RNA病毒，90%的植物病毒是RNA病毒。
早期RNA植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法(指示植物检测法)，即通过汁液摩擦接种或嫁接传染方式，将待测带毒植株汁液接种到一株或多株指示植物上，从而观察其在指示植物上的症状。
指示植物是对某一种或某几种病毒和类病毒敏感的植物，感染后可迅速出现明显症状。
传统生物学方法鉴定谱广，操作简单，但需培育大量指示植物，检测速度慢，易受外界环境影响。
随着电子显微镜的出现，病毒的真实形态才得以展现。
电子显微镜观察结果直观、准确，还能观察病毒引起的寄主细胞病变及内含体特征，是深入研究病毒病机理的重要手段之一。
但仪器设备昂贵，制片及操作技术复杂，难以掌握，对操作人员技术水平要求高。
由于每一种植物病毒产生的抗血清各有特性，人们研发一种利用抗原抗体外特异性免疫反应检测植物病毒的方法。
酶联免疫吸附法(ELISA)是通过酶催化颜色反应将抗原抗体结合起来的一种方法，其具有灵敏、快速、特异性强、分析率高、成本低等优点，可用于大规模样品检测，是血清学中应用最广泛的方法，已成为检测植物病毒的关键技术。
随着生物体遗传物质研究的逐步深入，人们发现通过核酸能准确、快速地鉴定植物、动物和微生物的物种和种群。
基于核酸检测的分子生物学方法比血清学方法具有更宽的检测范围、更高的灵敏度、更强的特异性，适用于大批量样本检测，在植物病毒检测中得到了迅速而广泛的应用。
包括核酸杂交技术(Nucleic acid hybridiza-tion)、反转录PCR技术(RT-PCR)、荧光定量PCR技术(real-timePCR)、DNA微阵列技术(DNA microarray)。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物的病毒检测技术植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。
种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。
因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。
最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。
目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。
1 血清学检测方法1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA)酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。
该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。
ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。
在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。
1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。
所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。
RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达5ng/ml～50ng/ml 。
1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say)免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。
其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。
胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。
通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。
金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。
随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。
自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。
20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。
在此基础上,又建立了更为简易快速的胶体金免疫层析试验( Gold immuno-chromatography assay) ,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔膜的毛细管作用,使滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗透移动,在移动的过程中,抗体抗原发生反应,并通过免疫金的颜色显示出来。
上述两种快速检测技术的优点是简便、快速、直接,不需要酶促反应底物,除试剂外不需任何特殊仪器设备,特别适于田间快速诊断和口岸检疫。
但不能准确定量,灵敏度与酶联相当。
魏梅生等[5～6]应用该技术成功地进行烟草环斑病毒的检测。
1．4 免疫毛细管区带电泳( Immuno-capillary zone electrophoresis , I-CZE) 毛细管区带电泳是在装有一种电解液的空毛细管两端加一个外加电压。
在外加电压作用下,通过电泳迁移和电渗流的作用,样品中的不同组分由于迁移率的不同而分开。
I-CZE将血清学反应专化性和毛细管区带电泳灵敏、快速、可自动检测的特点结合起来,实时检测抗原- 抗体复合体Eun[7 ]等应用I-CZE检测到10fg 建兰花叶病毒和齿兰环班病毒的提纯病毒。
I-CZE 灵敏度高,且可快速分析多个样品,因而在无病毒苗木检测、抗病品种选育、植物检疫、种质筛选等方面可发挥巨大作用,有广阔的应用前景。
1．5 免疫PCR近年来出现的免疫PCR 是一种将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高灵敏度有机结合的检测技术,与酶联检测技术相比,免疫PCR 是先用抗体来捕获抗原,提取核酸后,再用PCR 扩增DNA 片段,从而放大抗原抗体反应,大大提高了检测灵敏度。
Sharman[8]建立的复合免疫PCR ,可同时检测香蕉和车前草粗提液中的香蕉苞叶花叶病毒、黄瓜花叶病毒和香蕉束顶病毒。
1.6 沉淀法在电解质存在时，抗体与同源抗原相互结合形成沉淀，不同病毒类型形成沉淀也不同。
如杆状、线状病毒形成絮状沉淀，球形病毒多形成颗粒状沉淀，通过稀释终点法，就是利用稀释终点对于每种病毒来说是比较稳定的这一特点，来测定病毒溶度。
1.7 补体结合测定法血清中有一种对热不稳定的成分，它能在抗体存在的条件下，溶解红血球或破坏革兰氏阴性菌，这种成分称为补体。
它的一个重要特性是一旦抗体与抗原结合，则补体也与之结合，通过补体的酶作用可以溶解红细胞。
2 以病毒核酸为基础的检测方法2．1 多聚酶链式反应(PCR)PCR 是Mullis 等在1985 年发明的一种特异性DNA 体外扩增技术。
其基本原理是:以待扩增的DNA 样品为模板,两个分别与待扩增DNA 片断正链和负链互补的DNA 片断为引物,在DNA 聚合酶的催化下,快速体外扩增特异DNA 序列。
在反应过程中,前一轮扩增得到的DNA 又作为后一轮反应的模板,因此DNA 的量迅速增加,一般经过大约30次循环反应,DNA 的量可扩增100 万倍以上。
对于DNA 病毒可以直接进行扩增,而对于大多数的RNA 病毒,则需先将RNA反转录成cDNA 再进行PCR 扩增, 此方法称RT2PCR(Reverse transcription-PCR) 。
用PCR 检测植物病毒所需时间短,灵敏度特别高。
用RT2PCR 检测苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的灵敏度可达5pg[10]。
近年来,在此基础上又发展了多种方法用于植物病毒检测。
如复合PT2PCR 是在同一RT-PCR 反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段;PCR-ELISA 是用ELISA代替琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,灵敏度高。
Olmos 等[12]用PCR2ELISA 方法检测李痘病毒的灵敏度比免疫PCR 高100 倍。
2．2 分子信标(Molecular beacon)分子信标[13 ] 是具有茎环结构的一段单链核酸分子,5′- 端和3′- 端序列互补形成“茎”,与目标序列互补的探针序列为“环”,在5′- 端连接荧光组分,3′- 端连接猝灭组分。
反应开始时先将反应液加热到80 ℃,这时分子信标变性,无茎环结构,不管有无目标序列均有荧光。
当温度逐渐降到20 ℃时,连续检测其荧光强度。
如果反应中产生与分子信标互补的目标序列,当温度降到解链温度时,分子信标和目标序列杂交,荧光部分从猝灭部分移开,从而发出荧光。
如果反应中没有目标序列,分子信标的两臂相遇形成茎环结构,不会产生荧光。
由于只有与互补序列杂交后分子信标才发出荧光,未杂交的信标不发荧光,因此不需要从反应混合物中除去未杂交的分子信标,可实时定量检测,灵敏度高。
2．3 TaqMan实时定量PCR ( Real-time RT-PCR)TaqMan实时定量PCR 是将RT-PCR和荧光检测相结合,利用Taq DNA 聚合酶的5′-端核酸酶活性来切割在扩增过程中与目标序列退火的荧光探针。
探针5′- 端连接荧光组分,3′- 端连接猝灭组分,当探针完整时,无荧光出现。
在PCR 过程中,荧光探针(也称TaqMan探针) 专化性地与两引物扩增产物间的一段序列退火后被Taq DNA 聚合酶切割,荧光组分与猝灭组分分开,产生荧光信号,荧光信号的强度与目标序列浓度或拷贝数成比例。
在每一循环中,都会有更多的分子被切割下来,荧光强度呈指数增长。
TaqMan实时RT-PCR不仅可避免假阳性的出现、提高检测灵敏度、实时定量检测,并且可在一个反应管内完成,减少了污染,反应自动完成, 易定量。
应用该技术, Roberts等[14]成功检测少至500fg 的番茄斑萎病毒,Eun 等[15]同时检测少至5fg 的建兰花叶病毒和齿兰环班病毒。
2．4 核酸杂交技术(Nucleic acid hybridization)核酸杂交是两段具有一定的同源性、来源不同的核酸分子在去掉变性条件后,互补的区段退火形成异质双链分子的过程。
核酸杂交是先将待测核酸固定在膜上,然后用核酸探针与其进行杂交,使杂交体带上标记而被显示出来。
一般采用核酸点杂交法来检测植物病毒,直接把病毒核酸点到NC 膜上再使之与探针杂交;也有的直接把病毒样品点到NC膜上。
检测的专化性程度取决于探针与病毒核酸序列的互补程度。
核酸杂交技术适用于DNA 病毒、RNA 病毒及类病毒的检测,灵敏度高、特异性强,可检测到1pg 的DNA。
朱水芳等[16]、李尉民等[17]分别应用核酸杂交成功检测了番茄环斑病毒和南方菜豆花叶病毒。
核酸杂交还可和RT-PCR 结合使用,Bertolini 等[18] 采用复合RT-PCR 同时检测侵染橄揽树的6 种RNA 病毒,随后用这6 种病毒的特异Dig(地高辛) 标记的探针对PCR 产物进行检测。
Dig 标记的cRNA 探针检测马铃薯卷叶病毒的灵敏度可达1pg/ml 。
2．5 双链RNA分析(Double-stranded RNA ,dsRNA)RNA 病毒、类病毒以及卫星RNA 在基因组复制过程中要形成双链的复制型或复制中间体,因此寄主植物体内存在其dsRNA ,且每一种RNA 病毒、类病毒、卫星RNA 形成的dsRNA 都是特异的,有各自的迁移率、分子量、片段数。
但正常的植物组织中无大分子的dsRNA ,因而可以利用dsRNA进行RNA 病毒、类病毒和卫星RNA 的诊断与检测。
dsRNA分析不需要贵重的仪器设备,在一般实验室即可进行。