诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案
诺如病毒感染的研究进展
诺如病毒感染的研究进展诺如病毒（Norovirus）是一种引起病毒性胃肠炎的病原体，属于杯状病毒科。
诺如病毒感染具有高度传染性，通常通过接触感染者的呕吐物、粪口途径传播。
全球范围内，诺如病毒感染的流行情况较为严重，每年导致数百万人患病，且在各种年龄段均可感染。
近年来，随着分子生物学和基因组学技术的快速发展，对诺如病毒的研究取得了显著进展。
研究人员已成功鉴定出多种诺如病毒血清型，并深入探讨了其遗传多样性和演化关系。
针对诺如病毒的预防与控制措施也取得了一定进展，例如通过改进饮食卫生、加强个人卫生习惯等手段有效降低感染风险。
尽管对诺如病毒的研究取得了一定成果，但在治疗方面仍存在许多问题。
目前尚无特效药物，主要以支持治疗为主，如补充水分和电解质等。
针对诺如病毒的疫苗研发也面临诸多挑战，如病毒变异快、免疫保护效果不持久等。
为应对诺如病毒感染存在的问题，未来的研究将更加注重以下几个方面：疫苗研发：通过深入研究诺如病毒的免疫机制，发掘有效的抗原靶点，研制出更加高效、持久的疫苗。
核酸检测：发展敏感、特异的核酸检测技术，以便更早地确诊感染，为临床治疗提供指导。
治疗策略：加强抗病毒药物的研究，发掘新型治疗策略，以提高治疗效果和降低并发症的发生。
流行病学研究：进一步了解全球不同地区诺如病毒的流行病学特征，为防控工作提供科学依据。
宣传教育与公众参与：加强公众对诺如病毒的认知教育，提高个人卫生意识，落实预防措施。
针对诺如病毒感染的研究仍需不断深入，未来将会有更多科研工作者致力于解决现存问题，共同应对这一全球性的公共卫生挑战。
单纯疱疹病毒（HSV）是一种常见的病毒感染，具有高度的传染性和致病性。
HSV可引起皮肤、黏膜和神经系统的炎症和感染，给患者带来极大的痛苦和不便。
因此，对HSV感染的研究具有重要意义，为预防、诊断和治疗该病毒感染提供了理论基础。
近年来，HSV感染的研究取得了显著的进展。
研究者们深入探讨了HSV的传播方式、发病机理、诊断方法以及治疗手段。
广东省诺如病毒感染性腹泻样品检测工作指引
附件9广东省诺如病毒感染性腹泻样品检测工作指引诺如病毒的实验室检测方法主要包括核酸检测和抗原检测，核酸检测是目前国际上最常用的检测方法。
这些方法各有优缺点，在操作时可根据技术水平、经济条件和使用目的进行选择，对于检测结果应参照临床症状和流行病学特征进行分析。
一、标本处理（一）粪便将1ml PBS加入至1.5ml EP管或2ml 螺口管中，再加入0.1g 固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本，臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min离心30min，吸上清，制成10%的便悬液，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
注意便悬液如果过浓，可能导致提取的核酸中抑制物过多，影响核酸检测结果。
（二）肛拭子旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
（三）呕吐物臵于漩涡震荡器充分混匀，≥5000r/min离心5min，或≥3000r/min 离心30min，吸上清，立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
（四）环境涂抹标本经旋涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或臵-20℃冰箱保存备用。
二、标本检测（一）核酸检测- 38 -1.核酸提取目前有多种商业试剂可用于粪便等标本的核酸提取，可用病毒RNA提取试剂，也可用RNA&DNA总核酸提取试剂，具体提取方法按照试剂说明书。
采用总核酸提取试剂，在使用逆转录聚合酶链反应扩增核酸时容易受到来自人、细菌等非目标物种基因的影响，产生假阳性，因此以RNA提取试剂为佳。
核酸提取完成后，尽快放入冰箱保存，如果3天内开展核酸检测，10℃以下保存即可，超过这个时间需放入-70℃冰箱保存。
注意尽量不要让核酸被环境中、手套上的细菌、灰尘中含有的RNA酶降解，也不要反复冻融。
2．荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)本方法是诺如病毒核酸检测的首选方法，特异性和敏感性较高，出现假阳性的机率也远低于传统RT-PCR，但受病毒核酸变异影响较RT-PCR大。
诺如病毒研究进展及一起邮轮诺如病毒感染疫情的实验室检测PPT教案
测的阳性率只有20%左右。固相免疫电镜的方法是将特异性抗体直接包被载网，同时加入蛋
白A增加抗体与标本中抗原结合的机会，从而提高检测的灵敏度。上述三种方法都要求观察
者具有丰富的经验，同时，精密的检测仪器、较大的劳动强度，都制约了该方法在NVs检
测中的应用。
免疫学检测（EIA）主要通过检测标本中的抗原来确认诺如病毒。该方法操作简
病毒：诺如，轮状，星状，腺病毒
细菌： 蜡样芽孢杆菌 ，产气荚膜梭菌，金黄色葡萄球菌 ，产肠毒素
型大肠杆菌
✓ 侵袭性病原体（Invasive microbes) :脓血便
细菌：大肠杆菌（侵袭性、致病性、出血性），沙门氏菌，空肠弯曲
杆菌，志贺氏菌，艰难梭菌
原虫：贾第鞭毛虫，溶组织内阿米巴
✓ 渗透性病原体（Penetrating microbes): 系统感染
Clusters differ by ≥ 20% amino
GI.7_Winchester
acid pairwise distance
GI.8_Boxer
GIII.1_Jena
Genogroups differ by 44-55%
GIII.2_CH126
GII.1_Hawaii
amino acid pairwise distance
单，实用性较强，便于推广。然而同样由于NVs型别的多样性，对该方法的应用产
察来寻找病毒。由于NVs病毒颗粒并不具备典型的杯状病毒特征，且粪便中病毒滴度通常
较低，给直接电镜观察带来了很大困难，通常要求病毒的滴度达到106/g才能达到检测要求。
免疫电镜的方法是将重悬离心分离得到的病毒颗粒与标准血清共孵育后再经负染后在镜下
观察来检测病毒。尽管这种方法可以较好地浓缩病毒颗粒，但灵敏度仍然较低，对NVs检
诺如病毒实验室技术培训
去除重复、无效和不完 整数据，确保数据准确 性和一致性。
数据格式化
统一数据格式和单位， 便于后续数据处理和分 析。
数据归类
按照实验目的和要求， 对数据进行合理分类和 归档。
数据统计分析和可视化展示技巧分享
描述性统计
计算数据的均值、标准差、最大值和最小值等指标，了解数据分布 情况。
相关性分析
个人防护装备
实验人员应佩戴合适的防 护装备，如实验服、手套 、口罩和护目镜等，确保 个人安全。
安全设施配备
实验室内应配备生物安全 柜、通风橱、洗眼器等设 施，降低安全风险。
实验室安全操作规程
实验前准备
实验人员应了解实验原理、目的 和操作步骤，做好实验前准备工
作，确保实验顺利进行。
实验操作规范
实验人员应按照规定的操作步骤进 行实验，避免误操作导致安全事故 发生。
和腹痛等。
感染者还可能出现发热、头痛、 乏力等全身症状，严重时可能导 致脱水、电解质紊乱等并发症。
诺如病毒感染在幼儿、老年人和 免疫力较低的人群中危害更为严
重，可引起重症甚至死亡。
02
实验室安全规范
实验室安全防护措施
实验室分区管理
明确实验室各区域功能， 设立清洁区、半污染区和 污染区，并标识清晰。
RT-PCR操作步骤
包括RNA提取、逆转录、PCR扩增、产物检测等 步骤。
3
RT-PCR操作注意事项
确保RNA质量、逆转录效率和PCR扩增的特异性 等。
结果判读标准与报告出具流程
结果判读标准
根据RT-PCR产物检测结果，制定相 应的判读标准，如CT值、扩增曲线 等。
报告出具流程
包括结果整理、报告撰写、审核签发 等环节，确保报告的准确性和规范性 。
诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)
• 制定《指南》是2015年中国疾控中心传防处重点工作之一
• 2015年11月16日中国疾控中心下发通知正式印发《指南》 • 2015年12月初河南省疾控中心转发“通知”和《指南》
《指南》参考文献和编写人员
• 参考了美国、英国、香港等国家和地区的指南 • 大量国内国际诺如病毒研究和监测的文献 • 中国疾控中心传防处、病毒病所 • 省市区县疾控中心
卡普兰标准识别诺如病毒暴发 灵敏度 68% 特异度 99%
《指南》主要内容3——疫情调查
• 疫情发现、核实与报告
①集体单位、场所或医疗机构报告 ②属地疾控中心调查核实 ③根据《国家突发公共卫生事件相关信息管理规范》标准报告
• 疫情调查 – 基本情况
①发生机构基本信息 ②人员分布情况 ③发生机构内部 平面图 ④供餐和饮用水信息 ⑤其他相关信息
《指南》主要内容4——实验室检测
• 标本采集
– 标本采集类型 – 标本采集对象 1. 病例 粪便或带便肛拭子、呕吐物、水、食品、环境涂抹样
①采集病例发病2-5天内的粪便、带便肛拭子或呕吐物标本。 ②若病例在10例以下，全部采集；病例在10例以上，至少采集10例病例的
标本。
③尽量采集重点病例标本 如首发病例、指示病例、住院病例、发病的食
附件
1. 诺如病毒感染聚集性和暴发疫情病例访谈提纲 2. 诺如病毒感染聚集性和暴发疫情调查病例一览表 3. 诺如病毒感染聚集性和暴发疫情个案调查表 4. 诺如病毒感染聚集性和暴发疫情标本采集登记表 5. 诺如病毒标本处理及实验室检测技术方案 6. 诺如病毒消毒方法
《指南》主要内容3——疫情调查
• 疫情调查 – 卫生学调查
1.方法：访谈、查阅记录、现场勘查、样本检测等 2.内容：食品或水的污染源 、污染环节、导致疫情传播的危险因素
诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测
二、采集要求
粪便、带便肛拭子和呕吐物 粪便可用便盒采集 肛拭子用采样棉签蘸生理盐水或病毒保存液、或PBS液
后，插入肛门4-5cm（幼儿2-3cm）处，轻轻旋转擦取 直肠表面带便粘液，置于含病毒保存液的采样管中。 呕吐物可注入灭菌容器内 采集的最优时间在发病后48-72小时内 采集量3g/3ml左右 采样时，如发现手套被污染应及时更换，采样容器外部 被污染时需独立包装，以避免样品间的交叉污染。 样本采集后，立即冷藏保存。
年龄，发病时间、采集时间等 附件8和附表8-1
二、厨工
食源性暴发溯源可采集厨工的粪便（最好） 或带便肛拭子标本
涉疫单位的厨工人数在30人以下，全部采样； 30人及以上，尽量采集接触直接入口食品岗位 的厨工：如参与蛤、牡蛎、贻贝等贝壳类海产 品加工，从事沙拉、凉菜、面包/糕点制作， 从事餐具清洗消毒及食品分发的厨工以及近期 出现过胃肠不适症状的厨工，至少采集30人。
诺如病毒感染性腹泻 样品采集与检测
广东省疾病预防控制中心 （2015年11月25日）
主要内容
■不同类型标本的采集要求 ■样品采集、运输和保藏 ■诺如病毒检测方法及结果分析
原则 不同类型标本的采样原则
一、病例
根据初步流行病学调查的结果，尽量采集重点 病例：如首发病例/指示病例、住院病例、发病 厨工、重点岗位的病例等的标本；
呕吐物 置于漩涡震荡器充分混匀，4 ℃,≥5000r/min 离心5min，或≥3000r/min离心30min，吸上清 ，立即检测或置-20℃冰箱保存备用。
标本检测——核酸检测
核酸提取（多种商业试剂，如Qiagen、罗氏等） 病毒RNA提取试剂（推荐） 病毒总核酸提取试剂
诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015 版)附件1
③不清楚
①是 ②否 ③不清楚
月 日时
月 日时 月 日时
消失时间 月日时 月日时 月日时 月日时 月日时 月日时 月日时 月日时 月日时
3、临床检验结果：
（1）首次血常规： 采血时间: 月 日, 结果: WBC （109/L）血小板
（109/L）
（2）第二次血常规：采血时间: 月 日, 结果: WBC （109/L）血小板
食物名称
发病前 1 天 月日
发病前 2 天 月日
发病前 3 天 月日
早餐 中餐 晚餐 早餐 中餐 晚餐 早餐 中餐 晚餐
共同餐者人 同餐者
数
发病人数
4. 发病前 72 小时内饮水史
4.1 是否喝生水：（1）是 （2）否
4.2 生活用水来源：(1)自来水 (2)井水 (3)河水 (4)泉水 (5)开水
3.病例发病前 3 天的生活用水、饮用水源（桶装水和瓶装水应了解品牌）、饮生水的习惯，特别关注 与类似症状者共同暴露的生活饮用水。近期是否有引起水源污染的可疑事情发生，如停水、水质混 浊异味、水管维修等。
4.发病前 3 天有无医疗机构暴露史？暴露的医疗机构名称、暴露次数，暴露科室及原因。
5.病例认为自己发病的原因
1.1 类似症状者的发病时间、病例与类似症状者的关系、病例与类似症状者的接触方式等；收集类 似症状者的名单和联系方式，这些病例是否集中在某一些局限区域。
1.2 是否打扫或清理过他人的呕吐物或腹泻病人的粪便？（如果是，处置吐泻物的时间？ 是否有带 手套、口罩？事后是否洗手？ 如何洗手？）
2.详细了解发病前 3 天病例就餐的地点和摄入的食物，关注高风险食品（蛤、牡蛎、贻贝等贝类、 沙拉、凉菜等）。
的进食史，并在“□”中划“√”
诺如病毒实验室检测
诺如病毒实验室检测诺瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒（Norovirus,NV）属的原型代表株。
NV是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。
诺瓦克病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原。
2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒（Norovirus,NV）。
诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名称为札如病毒(Sapovirus,SV)，合称为人类杯状病毒。
诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。
诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。
诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。
诺如病毒有许多共同特征：直径约为26～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离，不能在细胞或组织中培养，也没有合适的动物模型；基因组为单股正链RNA；在氯化铯密度梯度中的浮力密度为1.36～1.41g/cm3；电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，NV是具有典型的羽状外缘，表面有凹痕的小圆状结构病毒。
诺如病毒根据遗传性分为5个基因组，至少有29个基因群，其中基因组I （GGI）有8个基因群，基因组II（GGII）有17个基因群，基因组III（GGIII）有2个基因群，基因组IV（GGIV）和基因组V（GGV）各有1个基因群。
与人类有关的主要是GGI、GGII和GGIV。
一、标本采集注意事项：粪便标本应在发病首日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量最多。
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1 标本前处理
离心5 分钟，使得固体沉淀。澄清上清液可以直 接用于病毒核酸提取或贮存于-70℃。 • （3）取澄清的上清液200ul 进行RNA 提取。
1 标本前处理
• 1.2 水
DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压 灭菌的MiliQ纯水，无色液体。经检测不含杂质RNA、DNA和蛋白质。
1 标本前处理
• （2）将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上 边。
• （3）使用不锈钢滤器夹进行水的密封。 • （4）真空泵连接1000ml 的锥形瓶。 • 注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中
过滤，在生物安全柜进行操作。 • （5）向滤器中倒入20ml 无菌水（DEPC 水）检
查滤膜的密封情况。 • （6）打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。
1 标本前处理
氯仿、丁醇。 • 1.2.2 操作方法 • 1.2.2.1 过滤装置准备 • （1）使用无菌的镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有
三层，型号分别为Millipore HA filter、AP15 和AP20， 放置顺序为Millipore HA filter→AP15 →AP20。 • 注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤 膜光滑表面的那边向下。所有的玻璃器皿应干净无 菌。每批水样使用不同的漏斗。
• 通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含 0.05M 甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使 用Microsep 100TM 或CentriconTM columns 离心管进一 步浓缩洗脱液。
• 1.2.1 设备和材料
• DEPC 水、新配制次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、 MilliporeHA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空 泵、计时器、PH 值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰 箱（-20℃、-70℃）、Microsep 100K columns（PALL 公司）、Centriprep YM-50（Millipore 公司）、洗脱液 （BE-0.05Gly pH7.0）、PBS (pH7.2)、离心机、
1 标本前处理
注意：如果沉淀物没有溶解，可用缓冲液反复 的轻轻吹打沉淀物。吹打过力会产生气泡。 • （4）向悬液中加入等体积的氯仿/丁醇（1:1 vol/vol）混合。去除病毒悬液中的抑制剂。 • （5）4℃，10000rpm，离心20 分钟。 • （6）分离出水相（上清液），-80℃储藏。 • （7）取200μl 上清液进行核酸提取。
1 标本前处理
• 1.2.2.2 水样品的过滤 • （1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻
关闭真空泵。 • （2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度
漏斗。 • 1.2.2.3 用酸漂洗滤膜 • 将膜用无菌的镊子夹放在有200ml 0.05mM
H膜2去SO除4（Mgp2H+3。.0）的无菌500ml 烧杯中进行漂洗滤 • 1.2.2.4 洗脱 • （1）将膜夹出放在无菌的60mm 培养皿中，加
1 标本前处理
1.1 粪便、呕吐物 1.2 水
1.3 环境涂抹样 1.4 食品 1.4.1贝类
1.4.2三文鱼 1.4.3草莓、蓝莓 1.4.4生菜和苗芽菜
1 标本前处理
• 1.1 粪便、呕吐物 • 1.1.1 设备和材料
微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离 心机、1.5ml 无菌离心管、磷酸盐缓冲盐溶液 （PBS）10mM pH7.0-7.4。 • 1.1.2 操作方法 • （1）离心管每管分装0.5mlPBS。用一次性移液 管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 克），稀释成约10％至20％（重量/体积）的粪 便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS 中稀释，直接使用500ul 的样品。 • （2）漩涡振荡每个样品1 分钟。在5000 rpm 下
诺如病毒 标本处理和实验室检测
技术方案
2015年版
目录
0
前言
1
标本前处理
2
核酸提取
3
诺如病毒核酸检测方法
4ห้องสมุดไป่ตู้
诺如病毒ELISA 检测方法 （粪便、呕吐物）
前言
诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处 理、RNA 提取、Real-time RT-PCR 检测、传统 RT-PCR 检测、测序和基因分型6 个步骤。Realtime RT-PCR 方法灵敏度和准确度高，是检测诺 如病毒的金标准。用传统RT-PCR 可对Real-time RT-PCR 阳性标本的PCR 产物进行测序，通过 序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发 生聚集或暴发时，ELISA 方法可作为辅助的手段 快速检测诺如病毒抗原。食品、水、环境涂抹样 检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。
5ml 洗脱液。盖上铝箔。
1 标本前处理
注意：要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形 瓶里。 • （2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速45rpm，室 温（23℃± 3℃），15min。 • （3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管 子里。 • 1.2.2.5 中和洗脱液 • 用1N HCl 或1N NaOH 调整洗脱液的pH 到7.07.4。检测前，洗脱液在-70℃储藏。 • 1.2.2.6 二次浓缩
1 标本前处理
• 方法二：PEG 沉淀 • （1）向标本洗脱液中加入NaCl 终浓度是0.3mol/L
（若洗脱液为5ml 加0.08775g 的NaCl）, 有助于病 毒的沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为12.5％ （w/v）（若洗脱液为5ml，加0.0625g 的PEG-6000。 4℃过夜。 • （2）4℃，10000rpm 离心30 分钟，收集沉淀。 • （3）Millipore HA filter，倾倒并弃掉上清液。每个 离心管添加150-500μl pH7.2（±0.2）PBS 重悬沉 淀物。将离心管放置在离心管架上，为更好的让缓冲 液与沉淀物接触，将离心管架成一定角度放置。室温 放置30min。
1 标本前处理
• 方法一：用Microsep 100 K columns 或 Centriprep YM-50 浓缩病毒
• （1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱 液浸湿过滤器。
• （2）将水标本滤膜洗脱液（大约5ml）加入到浓 缩柱中，5000rpm离心5min。
• （3）吸取浓缩液（约150μl），转移至1.5ml 离 心管中。