病毒分子生物学鉴定常用技术
(整理)分子生物学检测技术简介
分子生物学检测技术简介分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。
近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。
1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。
一、核酸分子杂交（一）概述：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。
应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。
到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。
核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA探针。
探针标记的好坏决定检测的敏感性。
1、Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法。
根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。
2、Northern 印迹杂交基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。
由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。
3、斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。
该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。
分子生物学技术在病毒诊断中的应用
分子生物学技术在病毒诊断中的应用随着科技的发展，分子生物学技术已经逐渐成为了病毒诊断的重要手段之一。
这种技术基于病毒的基因信息，可以对病毒进行高度敏感和特异性的检测和鉴定。
本文将深入探讨分子生物学技术在病毒诊断中的应用。
一、病毒的基因组定位和扩增分子生物学技术的核心就是利用已知的基因序列作为模板来扩增出目标序列。
对于病毒，一般需要先对它的基因组进行定位，找出其中的关键基因和区域。
这些区域可能会在不同的病毒中有所不同，因此需要针对具体的病毒选择适当的定位位点。
目前比较常用的病毒检测方法是聚合酶链式反应（PCR），这种方法可以选择性地扩增出某一段特定的DNA序列。
在病毒检测中，PCR方法可以通过选择病毒的关键基因或者一些特征序列来扩增出病毒的DNA。
通常情况下，PCR方法需要先将样本中的病毒RNA转录成相应的cDNA，再进行PCR反应。
除了PCR方法外，还有很多其他的扩增方法，比如引物介导的异构扩增（LAMP）、转录介导扩增（TMA）等。
这些方法都要根据不同病毒的特征和样品类型进行选择。
二、病毒的诊断和鉴定通过上述的扩增方法，就可以得到病毒的DNA序列，但这并不足以进行病毒的诊断和鉴定。
在此基础上，需要进一步对扩增产物进行分析，确定其是否来自于目标病毒。
病毒的诊断和鉴定方法主要有两种，一种是结构方法，即通过对扩增产物的序列进行比对和分析，确定其是否与已知的病毒序列相似，进而确认病毒类型和亚型。
这种方法可以使用一些在线的数据库和软件，比如BLAST、CLUSTAL等，进行序列比对和进化树分析。
另一种方法则是功能方法，即通过检测扩增产物所编码的蛋白质的表达情况来确定目标病毒的存在。
常用的是酶联免疫吸附测定（ELISA），这种方法利用抗体对特定的病毒蛋白进行检测。
也有一些新的方法正在研究，比如利用质谱的方法检测病毒蛋白的组成和结构。
三、病毒监测和流行病学研究分子生物学技术不仅可以用于病毒的诊断和鉴定，还可以用于病毒的监测和流行病学研究。
临床分子生物学检验技术
04
优势：快速、准确、灵敏度高
05
局限性：成本高、技术要求高、需要专业人员操作
遗传病诊断
基因检测：通过基因测序技术， 检测遗传病相关基因突变
产前诊断：通过基因检测，评估 胎儿遗传病风险，指导优生优育
遗传咨询：根据基因检测结果， 提供遗传病风险评估和预防建议
药物治疗：根据基因检测结果， 制定个性化的药物治疗方案
04 跨界合作：与其他领域的技 术相结合，如人工智能、大 数据等，为分子生物学检验 技术带来更多的市场机遇。
汇报人：xxx
液体活检技术的发展： 通过血液样本检测肿瘤 细胞，提高了肿瘤检测
的准确性和便捷性
生物芯片技术的应用： 用于基因表达分析、 基因分型等，提高了 检测效率和准确性
单细胞测序技术的发展： 实现了对单个细胞的基 因表达分析，提高了检
测的灵敏度和分辨率
基因编辑技术的发展： CRISPR/Cas9等基因 编辑技术的出现，为基 因治疗提供了新的可能
市场前景与机遇
01 市场需求：随着人们对健康 重视程度的提高，分子生物 学检验技术在医疗领域的应 用将越来越广泛。
02 技术进步：随着分子生物学 技术的不断发展，检验技术 将更加精准、高效，为市场 带来更多机遇。
03 政策支持：政府对医疗领域 的投入加大，为分子生物学 检验技术的发展提供了有利 的政策环境。
生物学与工程学的融合：分子 生物学检验技术需要利用工程 学原理和方法，如微流控芯片、 纳米材料等，进行生物大分子 的检测和分析。
技术瓶颈与难题
技术难度：分子生物学检验技术涉及 多个学科，技术难度较大
成本问题：分子生物学检验技术成本 较高，难以普及
检测准确性：分子生物学检验技术检 测准确性有待提高
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2021-04-23 11:01:29)转载▼标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术根本实验室技术生物学实验教育常用的分子生物学根本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的根本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。
其根本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下〔适宜的温室度及离子强度等〕可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针〔probe〕,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。
核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的DNA或RNA片段。
根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
固相杂交固相杂交〔solid-phase hybridization〕是将变性的DNA固定于固体基质〔硝酸纤维素膜或尼龙滤膜〕上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。
斑步杂交〔dot hybridization〕是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后参加过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。
该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永别离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。
该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。
印迹杂交〔blotting hybridization〕Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反响，用放射性自显影或酶反响显色，检测特定大小分子的含量。
分子生物学常用检测技术
平台期
指数增长期
循环数Cycle Number
CT = - k logN0 + b
PCR的临床应用
对病原微生物核酸进行快速检测 弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 用于药物疗效监测和评估 用于肿瘤基因表达方面的研究 用于遗传病的诊断
样本采集要求
项目
标本采集
HBV 无菌注射器抽取2毫升静脉血或其它体液注入无 HCV 菌试管或抗凝管。
• 第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还 大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，但 在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多 。
五、基因重组技术
• 基因重组是指一 个基因的DNA序列 是由两个或两个 以上的亲本DNA组 合起来的。
• 基因重组是遗传 的基本现象，病 毒、原核生物和 真核生物都存在 基因重组现象。
尿道分泌物：同上
二、核酸分子杂交
根据核酸变性和复性 的原理，不同来源的 变性单链核酸分子在 合适的条件下，通过 碱基互补形成双链杂 交体的过程称为核酸 分子杂交 （molecular hybridization）。
核酸分子杂交的临床应用
• 1、遗传病的诊断 • 2、病原体的鉴定 • 3、癌基因突变的检测 • 4、组织配型 • 5、亲子鉴定
和
Taq DNA 聚合 酶
或
和
模板 引物
PCR的种类
• 荧光定量PCR • 通用引物PCR • 多重PCR • 巢式PCR • RT-PCR • 原位PCR • 免疫PCR • ……
荧光定量PCR
TaqMan探针
forward primer
probe
R
Q
5'
3'
病毒感染的分子生物学检验
所得病毒信息量较少，不 提供病毒基因型或耐药性 方面的信息。
常用的技术：PCR技术、核酸杂交技术、基因芯片技术及 基因测序技术
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第二节 乙型肝炎病毒的分子生物学检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是引起 病毒性肝炎的主要病原体之一。 根据有关资料统计，全球约有3.5亿乙肝病毒携 带者，我国约50％~70％的人群感染过乙肝病毒， 其中乙肝病毒携带者已超过1.3亿，肝癌发病率也 在增加。
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HBcAg抗原性很强，能刺激机体产生抗HBc， 但无中和作用，如检出高效价抗HBc，特别是 抗HBc-IgM则表示HBV在肝内处于复制状态。 不同亚型的HBcAg长度不等，一般在183~214 个氨基酸。 HBcAg相对保守，不同亚型HBcAg的变异率< 6%。
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HBeAg蛋白由前-C基因开始编码（包括前C和C 基因），由212个氨基酸残基组成： HBeAg为可溶性蛋白质，游离于血中，可作为H BV复制及具有强感染性的一个指标。 抗 -HBe 能 与 受 染 的 肝 细 胞 表 面 HBeAg 结 合 ， 通 过补体介导破坏受染的肝细胞，有一定的保护作 用。抗-HBe的出现是预后良好的征象。
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前-C区是一个极易发生突变的区域。前-C基因 突变后，造成HBeAg的分泌水平下降或完全终 止，形成HBeAg阴性的前C区突变株，使受感 染的细胞不能被抗-HBe及相应的细胞免疫所识 别而清除，从而使变异株在抗-HBe阳性的情况 仍大量增殖。因此临床上将慢性乙型病毒感染 分为HBeAg 阳性和HBeAg阴性两类患者。对H BeAg阴性抗-HBe阳性的患者应注意监测血中 病毒DNA。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
微生物的鉴定与鉴别方法
微生物的鉴定与鉴别方法微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
它们在自然界中广泛存在，对人类的生活和健康有着重要的影响。
鉴定和鉴别微生物是微生物学研究的基础，也是保障食品安全和公共卫生的重要手段。
本文将介绍一些常用的微生物鉴定和鉴别方法。
一、形态学鉴定法形态学鉴定法是通过观察微生物的形态特征来进行鉴定和鉴别的方法。
在细菌的鉴定中，常用的方法包括显微镜观察细菌形态、染色和培养基特性等。
例如，革兰氏染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，进一步缩小了鉴定范围。
二、生理生化鉴定法生理生化鉴定法是通过检测微生物的生理和生化特性来进行鉴定和鉴别的方法。
这些特性包括生长要求、代谢产物和酶活性等。
比如，葡萄糖发酵试验可以区分肠道埃希菌和沙门菌，鉴定其是否具有肠道致病性。
三、分子生物学鉴定法分子生物学鉴定法是通过检测微生物的基因组DNA或RNA序列来进行鉴定和鉴别的方法。
这些方法包括PCR、序列分析和基因芯片等。
PCR技术可以扩增微生物的特定基因片段，通过比对序列来确定微生物的种属和亚种。
这些方法具有高度的准确性和灵敏度，已经成为微生物鉴定的重要手段。
四、免疫学鉴定法免疫学鉴定法是通过检测微生物与宿主之间的免疫反应来进行鉴定和鉴别的方法。
这些方法包括免疫荧光、酶联免疫吸附试验和免疫印迹等。
免疫荧光技术可以通过标记抗体来检测微生物的特定抗原，从而确定微生物的种类和数量。
五、质谱鉴定法质谱鉴定法是通过检测微生物样品中的分子质量来进行鉴定和鉴别的方法。
质谱仪可以将样品分子离子化，并根据其质量-电荷比进行分析和鉴定。
质谱鉴定法具有高度的准确性和灵敏度，已经成为微生物鉴定的重要手段。
总结起来，微生物的鉴定和鉴别方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，常常需要结合多种方法进行综合分析，以提高鉴定的准确性和可靠性。
微生物的鉴定和鉴别工作对于食品安全、疾病预防和环境保护等方面都具有重要意义，值得我们继续深入研究和应用。
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实验二十三病毒核酸检测常用技术（Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses inCommon Use ）近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。
由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。
在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。
实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸【目的要求】通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。
但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。
常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。
本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
图23-1PCR基本原理示意图本实验是将被检样品中ILTV 颗粒经裂解、变性后，分离ILTV—DNA。
选择鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因保守序列设计引物，由于引物与鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因存在着特异的互补性，当加入DNA聚合酶后，就会在引物的引导下合成该段基因，该基因片段通过人工扩增后，经含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可显示橙红色ILTV—DNA 条带，根据片段大小来判定标本中鸡传染性喉气管炎病毒的存在。
【器材准备】1．病毒裂解液：醋酸钠1.7g，EDTA钠盐4.65g，20mg/ml蛋白酶K 2.5ml，100g/L SDS 10ml，DEPC三重蒸馏水加至50ml。
2.3mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.2) ，酚/氯仿/异戊醇混合液(25：24：1) ，无水乙醇及70％乙醇。
3.2.5mmol dNTPs：含dA TP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM。
4.10×PCR Buffer，Taq DNA聚合酶。
5.DNA分子量标准。
6.上样缓冲液：2.5g/L溴酚蓝、400g/L蔗糖水溶液。
10mg/ml溴乙锭(EB)(具致癌性，操作时应戴手套)，琼脂糖。
7.50×TAE缓冲液：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。
使用液为1×。
8.ILTV北京E2 株、ILTV-DNA可疑组织样品、ILTV-DNA阴性组织样品等。
9.引物序列: 参考已发表的ILTV的TK基因序列,设计并合成了一对引物,其序列如下：引物P1：5’-TTCGAGAACGATGACTCCG-3’；引物P2：5’-ATAGTCA TCTGAACTTCCGC-3’。
10.仪器：台式高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、水平式电泳槽、紫外透射反射分析仪、微量加样器、Eppendorf管与吸头等。
【实验步骤】1.病毒核酸的分离（1）取ILTV-DNA可疑组织样品上清液200μL、病毒裂解液20μL于Eppendorf管中，60℃水浴1h，同时设ILTV北京E2 株、ILTV-DNA阴性组织样品对照。
（2）加酚/氯仿/异戊醇混合液200μL，上下颠倒混匀，14000rpm离心5min，吸上清液于另一新的Eppendorf管中。
（3）加1/10体积的3 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.2)及2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜。
14000rpm离心15min，弃上清液。
（4）加70％乙醇至Eppendorf管2/3处，混匀，洗涤沉淀。
14000rpm离心15min，弃上清液，室温中使乙醇挥发。
2.加样及PCR扩增（1）按以下次序将各成分加入0.5ml 灭菌Eppendorf管中。
10×PCR buffer 5 μl2.5mM dNTPs 4 μl引物P1（25pmol/μL） 2 μl引物P2（25pmol/μL） 2 μlTaq DNA聚合酶（5U/μl）0.5 μl模板液（病毒核酸的分离液） 1 μl加ddH2O至50 μl（2）将上述混合液稍加离心，调整好反应程序，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般在94℃预变性3min，进入循环扩增阶段：94℃60s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。
3.电泳检测（1）将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上，放好梳板，使梳板齿下沿距倒胶槽板1mm。
（2）配制合适浓度的琼脂糖凝胶，如配制1.2％的凝胶，则称取琼脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至100ml，迅速混匀，待冷至60℃左右时，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混匀。
倒胶至倒胶槽内，使厚度为3～5mm，排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。
（3）将倒胶槽置电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液使其没过胶面2～3mm，轻轻拔出梳板。
（4）加样：取2μL上样缓冲液于Parafilm膜上，加入PCR产物5μL，混匀后，加入点样孔中，不要溢出孔外。
同时设DNA分子量标准。
（5）电泳：样品在负极端，接通电源，5V/cm恒压电泳30～60min即可。
（6）检测：电泳结束，关闭电泳仪电源，取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫外灯300nm下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。
4.结果判定在阳性对照孔出现相应扩增带、阴性对照孔无此扩增带时判定结果。
若样品扩增带与阳性对照扩增带（约265bp）处于同一位置，则判定为ILTV-DNA阳性，否则判定为阴性。
【注意事项】1.所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。
PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。
（1）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因有Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。
为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。
同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。
尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。
保证引物的3’端与靶基因的互补。
PCR反应的各温度点的设置要合理。
（2）假阳性：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，所以污染是PCR假阳性的主要根源。
污染的原因可能有：①样品间交叉污染。
样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样品而造成相互间交叉污染；样品核酸模板在提取过程中，由于移液器污染导致样品间污染；有些微生物样品尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
②PCR试剂的污染。
主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于移液器、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
③PCR扩增产物污染。
这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性。
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染移液器的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
④实验室中克隆质粒的污染。
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时采取如下措施：①合理分隔实验室。
将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开，最好能划分①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区；④PCR产物鉴定区。
②移液器：移液器污染是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入移液器内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
③预混和分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。
另外，PCR 试剂与反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。