定点突变
定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变是指在基因组中特定的位置发生的变异事件。
这些定点
突变可以是单个碱基的替代、插入或删除，也可以是染色体片段的重排和
结构变化。
基因定点突变是遗传学和分子生物学研究中的重要技术，具有
广泛的应用前景。
在基因定点突变的研究中，常用的方法包括基于随机突变和基于定点
突变的方法。
一、基于随机突变的方法：
1.化学诱变：通过化学物质如亚硫酸乙基甲酯(EMS)或N-亚硝基-N-
乙基脲(ENU)等诱导基因组范围内的突变。
这些突变通过对群体进行筛选
和筛选，从而找到目标基因的突变。
2.辐射突变：用射线如X射线、γ射线，或放射性物质如乙烯基腈，等辐射处理生物体，以诱导其基因组上的随机突变。
基于随机突变的方法广泛应用于物种、疾病、发育和进化等研究中。
它们可以帮助揭示基因功能的重要性和与特定物种和表型相关的基因。
二、基于定点突变的方法：
1.基因敲除/敲入：通过合成受损的DNA片段或外源DNA片段，将其
导入到目标基因中，从而造成其功能异常或置换为新的基因序列。
这种方
法可用于明确或验证基因的功能，并探索特定突变的表型影响。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
基因定点突变技术
寡核苷酸介导的定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 的生物化学家 ( michael smith )发明 的.
寡核苷酸定点突变基本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因 完全互补。
• 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型
子代链。 • 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中
基因已被定向修改
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代 野生型基因中的相应序列。
• 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如 果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入 限制位点。
• 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互 作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改 造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白 的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提 高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出 现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变 适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的 性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这 个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
点突变PCR
基因定点突变一,定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基.二,定点突变的原理通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了.三,引物设计原则引物设计的一般原则不再重复.突变引物设计的特殊原则:(1)通常引物长度为25~45 bp,我们建议引物长度为30~35 bp.一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12 bp.若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补的引物.(2)如果设定的引物长度为30 bp,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78℃(GC含量应大于40%).(3)如果Tm值低于78℃,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%).(4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置.(5)最好使用经过纯化的引物.Tm值计算公式:Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注:L:引物碱基数;% of GC:引物GC含量.四,引物设计实例以GCG→ACG为例:5'-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3'(1)首先设计30 bp长的上下游引物,并将A (T)设计在引物的中央位置.Primer #1: 5'-CCTTCAGTA TGTAGACGACTTACTTATTGC-3'Primer #2: 5'-GCAA TAAGTAAGTCGTCTACA TACTGAAGG-3'(2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.41×40-675/30+81.5).通过计算可以看出其Tm低于78℃,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度.(3)重新调整引物长度.Primer #1: 5'-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3'Primer #2: 5'-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3'在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm为80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了.五,突变所用聚合酶及Buffer引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变.除了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵.可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金牌快速taq酶,Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase.六,如何去掉PCR产物最简单的方法就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的,所以DpnI酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株.DpnI处理的时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败.七,如何拿到质粒直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果.八,图示九,定点突变操作步骤[A] 诱导突变基因(PCR反应)以待突变的质粒为模板,用设计的引物及Muta-direct 酶进行PCR扩增反应,诱导目的基因突变.1. 设计点突变引物.[注]参考引物设计指导2. 准备模板质粒DN A[注]用dam+型菌株(例如DH5α菌株)作为宿主菌.在end+型菌株中常有克隆数低的现象,但是对突变效率没有影响.提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒.3. [选项]对照反应体系(50μl反应体系)10×Reaction Buffer5μlpUC18 control plasmid(10ng/μl,total 20ng)2μlControl primer mix(20pmol/μl)2μldNTP mixture(each 2.5mM)2μldH2O38μlMuta-direct Enzyme1μl4. 样品反应体系(50μl反应体系)10×Reaction Buffer5μlSample plasmid(10ng/μl,total 20ng)2μlSample primer (F)(10pmol/μl)1μlSample primer (R)(10pmol/μl)1μldNTP mixture(each 2.5mM)2μldH2O38μlMuta-direct Enzyme1μl5. PCR反应条件[注]按如下参数设置PCR扩增条件.CyclesTemperatureReaction Time1cycle95℃30sec15cycle95℃30sec55℃1min72℃1min per plasmid Kb6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟,然后置于室温(避免反复冻融).[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增,控制PCR循环数.注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象.MutationCycles1~2Nucleotide15cycles3Nucleotides18cycles[B] 突变质粒选择PCR反应结束后使用Mutazyme 酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA.1. 准备PCR反应产物2. 加入1μl(10U/μl)Mutazyme 酶37℃温育1小时.[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme 酶可能发生与样品反应不完全的现象.因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作.如果突变率低,可以适当延长反应时间或增加Mutazyme 酶用量.[C]转化反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口,当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株,例如DH5α.1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里,然后放置在冰上30分钟.2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行.序列分析通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变.为了证实这一结果,我们建议对白色单菌落进行测序分析.。
定点突变的方法
定点突变的方法
定点突变的方法指的是在染色体上的某一特定位点进行突变以达到要求的一种方法，是一种基因改造的技术。
它是基因工程中用来避免基因全替代（非常昂贵）的最有效的方法。
它有三种基本方法：重组、修饰和基因敲除。
重组技术是在基因中插入、移出或更改某些基因。
修饰技术是在基因中添加或删除特定的DNA序列，从而改变基因的表达。
基因敲除则是将基因表达降低或关闭，从而减少基因的作用。
定点突变的方法可以用来做一些生物学实验，以及改变和修复基因突变导致的疾病。
此外，它还可以用来增强生物的抗性力，提高其产量和质量，以及改善耐逆性等特性，是最近生物科学研究领域的非常重要的技术。
基因的定点突变的原理
基因的定点突变的原理基因的定点突变是指在DNA序列中的特定位置发生的突变，即碱基序列的改变。
这种突变发生在特定的位置，通常是基因编码区域，会引起氨基酸序列的改变，从而对蛋白质的功能产生影响。
定点突变的原理主要涉及以下几个方面：1. 突变的起源：定点突变可以是自发发生的，也可以是由外部因素引起的。
自发突变通常是由DNA复制过程中的错误引起的，包括碱基替换、插入或缺失等变异。
而外部因素如辐射、化学物质等也可能引起DNA损伤并导致定点突变。
2. 碱基替代：定点突变最常见的形式是碱基替代，即一个碱基被另一个碱基替代。
这种替代可能是同义突变，即替代后的密码子依然编码相同的氨基酸。
也可能是错义突变，即替代后的密码子编码不同的氨基酸，从而改变蛋白质的结构和功能。
3. 密码子的改变：在定点突变时，被替代的碱基往往位于密码子序列中的特定位置。
这种替代可能导致密码子的改变，从而改变蛋白质的翻译过程。
例如，突变可能导致起始密码子的改变，影响蛋白质的翻译起始，或者导致终止密码子的改变，影响蛋白质的翻译终止。
4. 功能影响：定点突变引起的氨基酸序列的改变可能会影响蛋白质的结构和功能。
如果突变发生在蛋白质的活性位点或功能域内，可能会影响蛋白质的结合能力、催化能力或信号转导等功能。
这种影响可能是有益的，例如产生对环境更有优势的适应性变异，也可能是有害的，例如导致疾病的发生。
总之，定点突变是指DNA序列特定位置发生的突变，可能是自发发生的或由外部因素引起的。
突变可以是碱基替代，导致密码子的改变，进而影响蛋白质的结构和功能。
这些突变的结果可能是有益的适应性变异，也可能是有害的疾病突变。
基因定点突变DNA实验技术方法
基因定点突变DNA实验技术方法要研究和检测基因定点突变，需要使用一系列的实验技术方法。
以下是几种常用的DNA实验技术方法：1.基因测序技术基因测序技术是研究基因组突变的关键方法之一、它可以将DNA分子按顺序解码，并确定单个核苷酸的序列。
经过多年的发展，现在有很多种基因测序技术可供选择，如Sanger测序、Illumina测序、PacBio测序和单分子DNA测序。
这些技术可以高效地测定基因组中各个位置的核苷酸序列，并揭示基因定点突变的存在。
2.聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种用于扩增特定DNA片段的方法，可以在PCR反应过程中选择性地扩增感兴趣的基因片段。
对于基因定点突变的研究，PCR可以用来扩增包含突变位点的DNA片段，并通过测序分析来确定突变的类型。
3.引物延伸法引物延伸法是一种常用的检测单核苷酸多态性（SNP）和点突变的方法。
该方法使用引物和DNA聚合酶来识别特定位点，并从该位点延伸引物，以确定突变的存在与否。
引物延伸法可以用于快速、高效地检测多个位点的突变。
4. 限制性酶切酶（Restriction Enzyme Digestion）限制性酶切酶可以通过识别特定的DNA序列并在该序列周围切割DNA来检测和分析基因定点突变。
当突变中产生或消失限制性酶切位点时，可以通过酶切后的DNA片段的大小变化来检测突变。
5. DNA芯片技术（DNA Microarray）DNA芯片技术是一种高通量的基因分析技术，可以同时检测和比较大量的基因表达水平。
通过将DNA分子固定在芯片的表面并用荧光探针进行杂交反应，可以检测不同样品中基因定点突变的存在。
以上是几种常用的DNA实验技术方法，用于研究和检测基因定点突变。
随着技术的不断发展和创新，这些方法将进一步提高灵敏度和分辨率，为基因定点突变的研究提供更多的选择和可能性。
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1.1.1 基因定点突变
简介（INTRODUCTION ）
定点突变（site-directed mutagenesis ）是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR ）2. 一步法（全质粒PCR ） ► 搭桥法（重叠PCR ）定点突变
搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR ，其中前两次PCR 可同时完成，原理如图一所示：两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。
PCR1：以primer F 和
primer Rm 为引物对扩增
PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增
实验步骤（PROCEDURE ）
1. 两对引物的Tm 值都应相当。
两端PCR 引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突
变包含在中间引物互补区域内 （需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，
也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm 值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
搭桥法定点突变
一对中间位置的点突变引物设计 3.
PCR ：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为
引物对扩增。
两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。
（注意前两次不能使用taq 聚合酶，因为taq 在产物3’ 端多加一个A ，导致后续的PCR3出现移码突变）
4. 克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。
► 一步法定点突变
一步法是以质粒为模板，考虑扩增效率需将正向引物和反向引物分开扩增，避免二聚体的产生。
原理如图
实验步骤（PROCEDURE ）
5. 引物设计：设计一对含有目标突变的引物，除所需要引入的突变位点外，其余序列与质粒模
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’
完全互补
5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’
部分互补
5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’
部分互补
板完全匹配。
不同于搭桥法的一对中间引物，全质粒PCR法的一对引物最好不是完全配对，因为这对引物是放在一个PCR反应中，完全配对极易形成引物二聚体，而不是与模板质粒结合。
这就要求两条引物间配对区域的Tm值要小。
6.PCR。
PCR1：质粒+正向引物扩增，PCR2：质粒+反向引物扩增。
两次PCR均按照常规PCR
程序进行，不同的是只反应12个而不是30个循环。
PCR3：PCR1和PCR2反应完成后，将二者体系混合成一个体系并补加适量的高保真聚合酶（如Pfu 或Pfu-X1），然后按照常规PCR程序继续反应16个循环。
▲关键步骤：
♫不能用taq酶，一是taq酶无3’-5’外切酶活性导致保真性差，全质粒PCR片段长，易出现非目标突变。
二是因为taq酶具有5’-3’外切酶活性这就导致当PCR以质粒
为模板复制一圈回到最初引物位置时，原有引物会被外切导致引入的突变又变回
野生型质粒的序列。
♫为防止非目标突变，PCR循环数不要太多（建议不超过25个cycle）
♫在质粒能正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板使用量以免模板质粒消化不完全背景增加。
（酶切和PCR都无法区分）
7.PCR产物的甲基化酶处理
8.待突变的质粒通常来源于DH5α等dam+大肠杆菌，在这些dam+细菌中质粒会被甲基化修
饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。
这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来（DpnI酶只消化甲基化的DNA）。
随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后，突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
9.向PCR产物中加入1 μL DpnI酶和4 μL的10× NEB cutsmart buffer消化模板质粒置于37°C
反应1 h，取出5 μL跑胶检测，剩余的取部分做细菌转化，涂板。
筛选转化子，测序。