微生物的分离与纯化
微生物的分离纯化方法
微生物的分离纯化方法微生物的分离纯化方法是微生物学研究的重要内容之一，旨在从混合的微生物群落中分离出单一种类的纯培养菌株。
微生物的纯化有助于研究其生物学特性、代谢途径以及应用领域等方面的深入研究。
下面将介绍常用的微生物分离纯化方法。
1. 单菌分离：是最常见的微生物分离方法之一。
通常使用传统方法（如分离培养基、落菌法、抗生素筛选等）以及现代分子生物学的技术手段（如16S rRNA 测序、荧光原位杂交等）对微生物进行筛选和分离，获得纯培养菌株。
2. 稀释平板法：是一种简单易行的微生物分离方法。
将待分离样品适当稀释后均匀涂布于富含适宜生长因子的平板培养基上，使微生物在固体培养基上形成单个菌落，然后用针头或者扩展环等工具将单个菌落接种于新的培养基上，形成纯培养单菌。
3. 滤膜方法：利用0.2μm以上的滤膜可以有效地将微生物和大颗粒物质分离开。
将待分离样品过滤，将滤膜放置于富含适宜生长因子的培养基上进行培养，从而获得纯菌落。
4. 凝胶去除法：主要针对混合微生物群落中细菌和其他微生物细胞凝胶的去除。
通过化学或物理方法（如酶解、超声波、渗透压等）将细胞凝胶分离离去，然后进行接种和培养，实现单菌分离纯化。
5. 选择性培养基法：利用特定的培养基，添加一定浓度的抗生素、染色剂或其他抑制物质限制其他微生物的生长，从而提高目标菌株的生长优势，实现单一种类的微生物分离纯化。
6. 微量稀释法：根据微生物的生长特性，将待分离样品进行多次连续稀释，然后分别在富含适宜生长因子的培养基上进行培养。
微生物的最高稀释度对应最大的菌落数目，可以通过对菌落的观察和计数，筛选到目标微生物。
7. 生物免疫法：利用微生物本身的免疫特性，通过制备抗体或其他免疫试剂对微生物进行分离纯化。
通过配对抗体和堆积生物试剂，将目标微生物从混合菌种中选择性地分离出来。
8. 流式细胞技术：是一种现代化的微生物分离纯化方法。
将待分离样品进行特定染色或标记，然后通过流式细胞仪对样品进行分析和排序，从而分离出目标微生物，实现单一种类微生物的分离纯化。
微生物菌种的分离和纯化方法
微生物菌种的分离和纯化方法1.空气平板法空气平板法是一种常用的微生物菌种分离方法。
将待分离的微生物样品进行适当的稀释并均匀涂布在含有经过固化的琼脂平板上，然后放置在适宜的温度下进行培养。
微生物在平板上呈现为单个菌落，每个菌落都代表一个来自单一细胞的微生物。
通过挑取单个菌落，将其再次传代培养，最终可以得到纯净的菌种。
2.稀释平板法稀释平板法也是一种常用的微生物菌种分离方法，在空气平板法的基础上进行了改进。
先将待分离的微生物样品按一定比例稀释，然后将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上。
由于稀释后的样品中菌落之间的距离更远，因此每个菌落代表的是来自更少数的微生物细胞，得到纯净的菌种的几率更高。
3.前体菌种法前体菌种法是一种通过选择性培养基将目标微生物分离出来的方法。
选择性培养基可以通过添加特定的抗生素、酸碱度调节和特定营养物等来抑制其他微生物的生长而促进目标微生物的生长。
将待分离的微生物样品进行适当的稀释后接种在选择性培养基上，利用培养基的选择性促使目标微生物生长并抑制其他微生物的生长，最终得到纯净的菌种。
4.形态学分离法形态学分离法是一种根据微生物在形态和结构上的差异进行分离的方法。
先选择合适的培养基和培养条件，将待分离的微生物样品进行培养。
在培养过程中，观察并挑选出形态和结构上有明显差异的微生物，然后将其进行单菌维持培养，并通过形态特征进一步分离和纯化菌种。
5.生理生化特性分离法生理生化特性分离法是一种根据不同微生物菌株在代谢和物质转化方面的差异进行分离的方法。
根据微生物菌株的生理生化特性，如生长速度、氨基酸利用能力、产酸产气等，将微生物菌株进行初步分离，然后通过进一步的生化鉴定和特性测试，最终得到纯净的菌种。
总结起来，微生物菌种的分离和纯化方法有很多种类，选择合适的方法依赖于待分离的微生物特性和研究目的。
这些方法在微生物学的研究中起到了关键作用，为了获得纯净的微生物菌种提供了有效的手段。
微生物的分离和纯化
微生物的分离和纯化一、基本原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
二、器材高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。
三、操作步骤1．稀释涂布平板法（1）倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55—60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。
试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。
也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板，如图Ⅶ-1所示。
微生物的分离和纯化
1、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。
单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
2、涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。
3、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。
用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
4、富集培养法富集培养法的方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。
所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。
在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
5、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。
然后快速冷却，并进行接种。
接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。
另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。
有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
微生物的分离与纯化-环境工程
1ml
∪
1ml
∪
1ml
∪
1ml
∪
1ml
∪
0.5ml
〇 〇 37℃培养 〇 〇 28℃培养
四、教师演示：
1、涂布 2、混合 3、划线 ..\微生物 \MPEGAV\AVSEQ01.DAT(19min) .\微生物\MPEGAV\AVSEQ02.DAT
实验结果示例1：
☆涂布
实验结果示例2：
☆划线
五、实验内容：
一、实验目的：掌握倒平板的方法和几种
常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 二、基本原理：从混合的微生物群体中获 得只含有某一种或某一株微生物的过程 ——即为微生物的分离与纯化。
常用方法：
1、单细胞挑取法：适用专业性研究； 涂布：先倒平板，后加 样 再涂布； 2、平板分离法 混合：先加样，后倒平板 混合均匀； 划线：挑取菌种，也可挑 取土壤悬液。
两皿涂布。
1、细菌培养基
一皿划线。 两皿混合。 ★ 把上述平板放入37℃培养培养箱培养。
※ 同学每人做两皿涂布、两皿混合（不同稀释度） 一皿划线共五套平板倒置培养
பைடு நூலகம்
六、实验材料：
涂棒 、接种环 、培养皿 、酒精灯 火机 、 酒精棉球
下次实验：显微镜使用与微生物形态观察
七、实验报告：
1、统计结果，计算出1g土壤的微生物含量； 2、思考题：
三、采集样品：
1、土壤中微生物及其丰富，是微生物多样化 的重要场所。作为科研或毕业课题要有目 的到尽可能分离到的地方去采集土样。 ☆ 举例： 2、制备土壤稀释液： 称取1g土样，放入90 ml的水，在三 角瓶中充分摇匀——细胞分散
▲梯度释稀：
9ml水 9ml水 9ml水 9ml水 9ml水
微生物的分离与纯化实验报告
微生物的分离与纯化实验报告微生物的分离与纯化实验报告引言：微生物是一类非常微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，同时也存在于人体内。
微生物对人类的生活和健康具有重要影响，有些微生物可以引起疾病，而另一些微生物则可以用于食品发酵、环境修复等方面。
为了更好地研究微生物的特性和功能，需要对其进行分离与纯化实验。
材料与方法：1. 样品采集：我们选择了土壤样品作为研究对象，从自然环境中采集了多个不同地点的土壤样品。
2. 稀释与接种：将采集到的土壤样品进行适当稀释，然后在琼脂平板上接种。
3. 培养与分离：将接种好的琼脂平板置于恒温箱中，以适当的温度和湿度进行培养。
经过一段时间后，我们观察到在琼脂平板上形成了不同形状和颜色的菌落。
4. 单菌分离：选择单个菌落，用无菌的铂丝将其转移到新的琼脂平板上，进行二次培养。
重复此过程，直到获得纯净的单菌培养物。
5. 形态观察：观察纯菌培养物的形态特征，包括菌落形状、颜色、透明度等，以及菌体形态特征，如细胞形状、大小等。
6. 生理生化特性检测：对纯菌培养物进行一系列生理生化特性检测，包括氧需求性、温度适应性、酸碱耐受性、产酶能力等。
7. 16S rRNA测序：对纯菌培养物进行16S rRNA基因测序，以确定其系统发育地位和亲缘关系。
结果与讨论：经过分离与纯化实验，我们成功地获得了多个不同的微生物菌株。
通过形态观察，我们发现这些菌株在菌落形状、颜色和透明度等方面存在显著差异。
进一步的菌体形态观察发现，它们的细胞形状和大小也各不相同。
在生理生化特性检测中，我们发现不同菌株对氧的需求性、温度适应性和酸碱耐受性存在差异。
有些菌株需要氧气才能生长，而另一些则可以在无氧条件下生长。
对于温度适应性，有些菌株在低温下能够生长，而另一些则喜欢高温环境。
此外，我们还发现一些菌株对酸性环境更耐受，而另一些则对碱性环境更适应。
通过产酶能力的检测，我们发现一些菌株具有蛋白酶、淀粉酶等多种酶的产生能力，这对于它们在环境修复和食品工业中的应用具有重要意义。
微生物的分离与纯化
常用的微生物分离纯化方法1. 稀释混合倒平板法平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。
该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。
待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。
于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。
每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。
挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。
若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。
2. 稀释涂布平板法采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。
在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。
该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。
待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。
另一种简单快速有效的涂布平板法, 可省去含菌样品悬液的稀释, 直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上, 用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定), 翻转此涂棒再涂布5号、6号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。
该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。
3. 平板划线分离法先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。
【实验】微生物的分离与纯化
梯度稀释菌液
3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注 入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。 依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。
涂布平板
问题讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附 近进行。结合平板划线与系列稀释的无 菌操作要求，想一想，第2步应如何进行 无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无 菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离 要合适、吸管头不要接触任何其他物 体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
的缝隙，右手将
锥形瓶中的培养
基(约10~20mL)
倒入培养皿，左
4
手立即_盖__上_____
培__养__等待平板冷__却__凝__固__，大
约需_5_~_1_0_m_i_n__。然后，
将平板_倒__过__来__放__置___，
使皿盖在下，皿底在上。
1
2
Q:这么做的目的是什么？
分别（依次）涂布平板
梯度稀释菌液 注意： 移液管需要经过 灭菌。操作时，试管口和 移液管离火焰1~2cm处.
1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌， 并按101~106的顺序编号。
梯度稀释菌液
1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌， 并按101~106的顺序编号。
梯度稀释菌液
2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第 二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮 头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。
平板划线的操作
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达 到分离单菌落的目的；
二是存留在划破处的单个细胞无法形成 规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形 成一个条状的菌落。
平板划线的操作
Q:为什么每次划线之前 都要灼烧接种环？
每次划线前灼烧接种环是 为了杀死上次划线结束后， 接种环上残留的菌种，使 下一次划线时，接种环上 的菌种直接来源于上次划 线的末端，从而通过划线 次数的增加，使每次划线 时菌种的数目逐渐减少， 以便得到菌落。
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一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。
二、实验步骤
（1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成）
（
三.巩固检测
1．获得纯净培养物的关键是( )
A．在无菌环境中培养B．接种纯种细菌
C．接种环灼烧灭菌D．防止外来杂菌的污染
2．巴氏消毒法常用于酒、奶等食品的消毒，该消毒法就是加热到70～75 ℃、保持30 min，或加热到80 ℃、保持15 min，能杀死一般杂菌和病原菌。
这与灭菌的要求相比，巴氏消毒法( ) A．不能杀灭芽孢和孢子B．只能杀灭芽孢等休眠状态的细菌
C．能杀灭各种细菌，包括芽孢D．能杀灭各种真菌，包括孢子
3．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部分的微生物（）
A．接种环、手、培养基 B. 高压锅、手、接种针
C. 培养基、手、接种环
D. 接种环、手、高压锅
4.下列操作与消毒或灭菌无关的是（）
A. 接种前用酒精灯火焰灼烧接种环
B. 接种前用酒精擦试双手
C. 接种在酒精灯水焰旁完成
D. 培养基在冷却到50℃ 时倒平板
5．制备固体培养基的步骤是( )
A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌
B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板
D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
6.平板冷却凝固后要将平板倒置，其意义是（）
A. 防止菌种死亡B．利于培养基的冷却
C．利于大肠杆菌的接种D．防止皿盖上的冷却水倒流入培养基
7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱培养的目的是（）A．为了检测温度是否最适宜B．检查培养基是否灭菌彻底
C．为了下次接种时再使用D．没必要放入未接种的培养基
8. 下列关于平板划线操作的叙述正确的是（）
A．使用已灭菌的接种针、培养皿，在操作过程中不再灭菌
B．打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞10. 稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。
下列相关叙述错误的是（）
A．操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释
B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
11. 下列关于平板划线法和稀释涂布平板法纯化大肠杆菌的叙述，正确的是（）
①可以获得单个的菌落②都需要使用接种环进行接种
③都需要在火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌．
A．①② B. ③④ C.①③ D. ②④
12. 下列有关实验室中微生物培养和分离的叙述，错误的是（）
A. 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵
B. 高温灭菌的目的是杀死所有微生物
C. 划线分离可在培养基上获得均匀分布的单菌落
D. 稀释涂布平板法可用于计数活菌数目
13. 平板划线法：通过在琼脂固体培养基表面的操作，将聚集的菌种逐步
到培养基的表面。
在数次划线后培养，可以分离到由繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是。
14. 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的，然后将不同稀释度的菌液分别
在琼脂固体培养基的表面，进行培养。
在稀释度的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成。
15．大肠杆菌是生存在人体肠道中的正常菌群，每克粪便中含有109 个，且能够与致病菌混杂生长。
如果食品和饮用水中出现大肠杆菌，就意味着食物可能被粪便污染而带上致病菌，因而常将大肠杆菌的数量作为食品卫生的检测指标之一。
请据此回答下列问题：
（1）测定街边出售的奶茶中大肠杆菌的数目，常用稀释涂布平板法进行测定。
该方法首先配置LB 培养基，进行高压蒸汽灭菌后冷却至60℃，在
旁倒在培养皿中形成平板；对奶茶样品进行一定倍数的稀释，取0.1mL 奶茶稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用涂布在培养基平面上，然后进行培养；观察统计培养皿中的数目；该数据比实际数值要(高、低)，原因是
C．将培养皿盖全部打开后，用沾有菌液的接种环进行划线接种
D. 接种时，接种环在培养基上迅速划线后盖上皿盖
9. 在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数，下图是利用平板划线法进行微生物接种过程中的部分操作，有关叙述不正确的是（）
A．每次划线前都需要灼烧接种环
B．接种环冷却后从上一区划线的末端开始划线
C．最后一区和第一区要保证不重叠
D．只有在图中的5 区域才可以得到所需菌落。
实验完成后需要对培养基进行处理，然后才能倒掉。
（2）若要对上述培养基中的菌种进行扩大培养，则需配置LB 培养基，灭菌后，将在酒精灯火焰上烧红后冷却，然后蘸取单菌落中的菌体接种到新的培养基中，在适宜环境中培养。