雏番鸭细小病毒病研究进展_董嘉文

雏番鸭细小病毒病研究进展董嘉文李林林孙敏华（广东省农业科学院兽医研究所，广东省兽医公共卫生公共实验室，广州，５１０６４０）雏番鸭细小病毒病是由雏番鸭细小病毒（Mus－covy duck parvovirus,MDPV）引起的雏番鸭以喘气、腹泻、脚发软及进行性消瘦为主要症状的一种急性、败血性传染病，其特点是传染性强和死亡率高[1-2]。

该病主要发生于3周龄以内的雏番鸭，因此又称雏番鸭“三周病”；发病率和死亡率可达40%以上，是目前番鸭饲养业中危害最严重的传染病之一，严重影响养鸭业的发展。

我国是发现和研究番鸭细小病毒最早的国家，1985年以来，在我国福建等南方多省均出现该病[3]，而后，法国、美国和日本等地也相继报道本病的流行。

1988年，程由铨等首次分离并鉴定该病的病原为番鸭细小病毒[4]。

１病毒特征1.1形态特征MDPV病毒粒子呈球形或六角形，二十面体，无囊膜，直径大小为22～25nm。

有实心和空心2种颗粒形态，空心内直径为15nm，衣壳厚度为5nm，壳粒数32，病毒衣壳的壳粒排列规则呈管状结构，壳粒直径为3～4nm。

在氯化铯中，实心和空心病毒粒子浮密度分别为1.39~1.42g/cm3和1.38g/cm3[5-6]。

1.2理化特性MDPV对pH3.0、pH5.0和60℃1h均有抵抗力；对酸、氯仿、乙醚和胰酶不敏感，但对紫外线辐射敏感。

对鸡、麻鸭、番鸭、鹅、猪、牛、兔、豚鼠、绵羊和“O”型红细胞无凝集作用。

1.3培养特性番鸭细小病毒初代分离只能用番鸭胚，而在其他胚中不能增殖，在鸭胚传代适应后可以在鹅胚上生长增殖并引起特征性病变。

MDPV也能在番鸭胚和鹅胚的成纤维细胞以及番鸭胚肾细胞上增殖，不能在鸡胚成纤维细胞(CEF)、猪肾传代细胞(PK15)、地鼠肾传代细胞(BHK21)和绿猴肾传代细胞(Vero)上增殖。

２流行病学和临床症状2.1流行病学雏番鸭是惟一自然感染发病的动物，发病率和死亡率与日龄关系密切，日龄愈小发病率和死亡率愈高，3周龄以内的雏番鸭发病率为20％～60％，病死率为20％～40％不等。

30日龄以上的番鸭也可发病，但发病率和死亡率较低，病鸭往往成为僵鸭。

病鸭通过排泄物特别是通过粪便排出大量病毒，污染饲料、饮水、用具、人员和周围环境造成传播。

如果病鸭的排泄物污染种蛋外壳，则引起孵房内污染，使出壳的雏番鸭成批发病。

本病发生无明显季节性，但是由于冬春气温低，育雏室空气流通不畅，空气中氨和二氧化碳浓度较高，故发病率和死亡率较高。

而在夏季发病率低，通风较好的情况下，发病率一般为20%～30%。

2.2临床症状本病的潜伏期4～9d，病程2～7d，病程长短与发病日龄密切相关。

根据病程长短可分为最急性、急性和亚急性两种类型。

最急性：多发生于6d以内的病雏，病势凶猛，病程很短，只有数小时，多数病例不表现前驱症状即衰竭，倒地死亡，此型的病雏喙短，偶见羽毛直立、蓬松。

临死时两脚呈游泳状，头颈向一侧扭曲。

该型发病率低，占整个病雏数的4%～6%。

急性型：主要见于7～14日龄雏番鸭，主要表现为精神委顿，羽毛蓬松，两翅下垂，尾端向下弯曲，两脚无力，懒于走动，厌食，离群；有不同程度腹泻，排出灰白或淡绿色稀粪，并黏附于肛门周围；呼吸困难，喙端发绀，后期常蹲伏，张口呼吸。

病程一般为2～4d，濒死前两肢麻痹，倒地抽搐，衰竭死亡。

亚急性型：多见于发病日龄较大的雏鸭，主要表现为精神委顿，喜蹲伏，两脚无力，行走缓慢，排黄绿色或灰白色稀粪，并黏附于肛门周围。

病程5～7d，病死率低，大部分病愈鸭颈部、尾部脱毛，嘴变短，生长发育受阻，成为僵鸭。

３病理学变化3.1剖检变化最急性型由于病程短，发病急，病变不明显，仅在肠道出现急性卡他性炎症，并伴有肠黏膜出血，其他内脏无明显病变。

急性型病变较典型，呈全身败血现象。

心脏变圆，心壁松弛，尤以左心室病变明显；肝脏稍肿大，少数有明显坏死灶。

胆囊显著肿大。

胆囊充盈，肾和脾稍肿大，胰腺充血或局灶性出血，表面散布针尖大灰白色病灶。

特征性病变在肠道，十二指肠前段有胆汁渗出，十二指肠后段及空肠前段呈急性卡他性炎症，中图分类号：S858.32文献标识码：A文章编号：1008-3847（2012）10-0002-05有大量出血点密布于黏膜表面。

空肠中后段和回肠前段的黏膜有不同程度脱落。

回肠后段可见大量炎性渗出物，或内混有脱落的肠黏膜，偶见形成假性“栓子”[7]。

3.2组织学变化心肌束间有少许红细胞渗出，血管扩张、充血；脑神经细胞轻度变性，胶质细胞轻度增生；肝小叶间血管扩张、充血，细胞局灶性脂肪变性；肺内血管充血，大部分肺泡壁增宽、充血及瘀血，肺泡腔减少，少数肺泡囊扩张；肾近曲小管变化较大，表现为肾小管上皮细胞变性，管腔内红染，分泌物积蓄；胰腺呈散在灶性胰腺泡坏死。

４ＭＤＰＶ基因组结构MDPV属于细小病毒科细小病毒属，其基因组为单链线性DNA，MDPV基因组全长约5.1kb，包含两个主要开放阅读框架(ORF)，两个ORF位于同一读码框内[6]。

左侧ORF编码非结构蛋白NS,由NS基因编码的蛋白主要参与病毒DNA的复制及调节基因的表达[8]。

NS1蛋白可能参与病毒对细胞的毒性作用、病毒复制及基因表达。

NS2蛋白能促进NS1蛋白对细胞的毒性作用[9-10]。

现已证明NS1蛋白具有与ATP结合、ATPase活性、解旋酶活性等功能[11]。

NS2蛋白还可能与病毒DNA和蛋白有效合成以及病毒增殖有关。

右侧ORF编码病毒的三种结构蛋白:VP1、VP2、VP3。

研究表明VP2和VP3为主要结构蛋白，其中VP3是主要衣壳蛋白，约占总蛋白的80%，它含有MDPV主要抗原决定簇成分，是病毒刺激机体产生保护性抗体的主要蛋白抗原[12]。

MDPV在病毒大小、理化特性、形态结构、核酸类型及免疫学特性等方面与鹅细小病毒（GPV）很接近[6,13]，但两者在致病性上存在较大差异。

MDPV只能感染番鸭及番鸭源细胞，而GPV既能感染鹅，又可以感染番鸭及其体外培养细胞。

因此，在MDPV的研究上，既要关注MDPV病毒本身的病原学和分子生物学及疫苗研究，也要关注MDPV与GPV之间的鉴别诊断和基因序列特点，以进一步探讨病毒的致病机理及防治关键。

５ＭＤＰＶ的检测和诊断5.1病原学诊断病毒分离主要参照程由铨等[4]的方法，将处理好的病料组织上清液，尿囊腔接种11～13d番鸭胚，观察病变，并取24h后死亡的胚液,胶乳凝聚试验呈阳性者判定为阳性。

MDPV病原学的检测现在实验室常用分子生物学方法，Jestin V等[14]最先建立了PCR检测MDPV核酸的方法。

娄高明等[15]也报道了PCR检测方法，但该法特异性不强，也能扩增出鹅细小病毒（GPV）。

因番鸭细小病毒和鹅细小病毒两者在核酸类型和基因组结构等方面很相似，基因组序列相似性达81.9%[16]，此后，研究者们更关注于鉴别诊断2种病毒的分子生物学方法。

通过比对Genbank上已发表的MDPV 和GPV核苷酸序列，根据不同区段设计引物，胡奇林等[17]设计并合成了1对通用引物(PC1/PC2)和1对MPV特异引物(PS1/PS2)，准确、快速鉴别番鸭和鹅细小病毒。

娄华等[18]、刘家森等[19]、季艳菊等[20]、鲜思美等[21]及宋永峰等[22]都报道建立了可用于鉴别诊断GPV和MDPV的PCR方法。

另外，Sirivan等[23]应用PCR结合限制酶切片段分析更加准确特异地鉴别诊断MDPV和GPV。

Gall-Recule等[24]报道建立了核酸探针检测MDPV核酸的方法可用于MPV的快速诊断，用地高辛标记作探针，能检出MDPV DNA的最低量为3fg，但该法与小鹅瘟病毒DNA有比较低的交叉反应。

Ji等[25]针对MDPV VP3基因设计了LAMP检测引物，建立的检测方法具有很好的特异性和灵敏性，能鉴别检测MDPV和GPV，并且所需时间短，仪器简单。

5.2MDPV血清学诊断MDPV常用的血清学诊断方法包括琼脂扩散试验（AGP）、胶乳凝集试验(LPA)、中和试验（NT）、免疫荧光抗体试验(FA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。

5.2.1琼脂扩散试验（AGP）娄华等[26]将分离的番鸭细小病毒通过正常发育的番胚传代，分别取不同代次的病毒尿囊液经氯仿、聚乙二醇浓缩处理后制成不同代次的抗原。

该抗原与抗番鸭细小病毒抗血清在含有20g/L PEG6000的琼脂平板上作用，可见有明显的沉淀线。

此法在流行病学调查及疫苗免疫检测方面具有重要的参考意义。

5.2.2中和试验（NT）程由铨[4]用固定单抗稀释病毒方法，即不同稀释度的病毒与等量的1：10稀释的腹水单抗充分混合后，置37℃CO2培养箱作用60min，接种细胞或番鸭胚，37℃培养，观察至第10d。

按Karber氏法计算中和指数。

5.2.3胶乳凝集试验(LPA)胡奇林等[27]、程晓霞[28]利用单克隆抗体建立了胶乳凝集试验(LPA)、免疫荧光抗体试验(FA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)3种检测MPV抗原的方法，并将这3种方法与病毒分离（VI）进行了比较，结果上述4种方法均可用于诊断番鸭细小病毒病，任何两种方法之间的符合率均在82.1%以上，LPA方法快速、简便及直观，是诊断番鸭细小病毒病的实用方法。

程晓霞[29]还比较了胶乳凝集抑制试验（LPAI）和血清中和试验（SN）检测番鸭细小病毒抗体效价，结果SN虽比LPAI敏感性高，但操作繁杂、费时，LPAI更适用临床。

5.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)黎敏等[30]建立了检测番鸭细小病毒抗体的间接ELISA方法，与DRV和DHV无交叉反应，但与GPV 阳性血清有一定的交叉反应。

批内批间重复性好，且与血清中和试验的符合率为98%。

Zhang等[31]用GPV Ep22株VP3蛋白的原核表达产物作包被抗原建立ELISA方法，可特异性检测出MDPV和GPV，特异性和灵敏度分别为91.8%、96.7%和90.2%、95.2%。

６ＭＤＰＶ的免疫和防制番鸭细小病毒病的发生无季节性，主要通过消化道和呼吸道传播，冬春季节气温低、空气不畅通，发病率和死亡率较高。

本病作为一种病毒病，重在预防，必须采取综合防制措施。

同时加强饲养管理，严格消毒制度，对种蛋、孵坊和育雏室要严格消毒。

6.1被动免疫在本病流行鸭场或者区域，1日龄的雏番鸭皮下注射高免血清或卵黄抗体，可达到预防或控制本病的流行发生。

每雏番鸭皮下注射0.5mL，其保护率可达95%左右；对已经感染发病的雏番鸭群的同群雏番鸭，每只皮下注射0.8～1.0mL，保护率可达80%左右；对已感染发病早期的雏番鸭，每只皮下注射1.0～1.5mL，治愈率可达50%左右[32]。

6.2主动免疫应用疫苗免疫种番鸭是预防本病最有效的方法。

种番鸭在产蛋前15天左右用番鸭胚化种鸭弱毒苗进行皮下或肌肉注射。