纤维素酶活力的测定

实验二十纤维素酶活力的测定

一、目的

学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维

素酶的作用特性。

二、原理

纤维素酶是一种多组分酶，包括C 酶、C 酶和 |?-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C

1 X 1

酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成

X

纤维寡糖，|?-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的

纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红

色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜

色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

（1）纤维素酶制剂 500mg

（2）新华定量滤纸 50mg / 份 4

（3）脱脂棉花 50mg / 份 4

（4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg

（5）水杨酸苷 500mg

2．主要仪器

（1）722 型或其他型号的可见分光光度计

（2）恒温水浴 2 台

（3）沸水浴锅

（4）电炉子

（5）剪刀

（6）万分之一分析天平

（7）恒温干燥箱

（8）冰箱

（9）试管架

（10）胶头滴管

（11）具塞刻度试管 20mL24

（12）移液管或加液器 0.5 mL3；2mL7

（13）容量瓶 100 mL6；1000 mL3

（14）量筒 50 mL2；100 mL1；500 mL1

（15）烧杯 100 mL6；500mL3；1 000 mL1

3．试剂（均为分析纯）

（1）浓度为 1mg/mL的葡萄糖标准液

将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至 100mL，充分混匀。4℃冰箱

中保存（可用 12～15 天）。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液

准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶

液 262mL，再加到 500mL含有 185g酒石酸钾钠（C H O KNa ! 4H O，MW=282.22）的热

4 4 6 2

水溶液中，再加5g结晶酚（C H OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na SO ，MW=126.04），

6 5 2 3

搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色

瓶中，室温放置一周后使用。

（3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液

A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C H O ! H O（MW=210.14）

21.014g于 500mL

6 8

7 2

大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至 1 000mL，充分

混匀。4℃冰箱中保存备用。

B 液（0.1 mol/L 柠檬酸钠溶液）：准确称取Na

C H O ! 2H

O（MW=294.12）29.412g

3 6 5 7 2

于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中，然后用蒸馏水定容

至 1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

取上述A 液 27.12mL，B 液 22.88mL，充分混匀后移入 100mL容量瓶中用蒸馏水定容

至100mL，充分混匀，即为0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液。4℃冰箱中保存备用，用于

测定滤纸酶活力。

（4）0.05 mol/L pH5.0 的柠檬酸缓冲液

取上述A 液20.5mL，B 液29.5mL，充分混匀后移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至

100mL，充分混匀。即为0.05M pH5.0 的柠檬酸缓冲液。4℃冰箱中保存备用。用于测定

C 酶活力。

（5）0.51％羧甲基纤维素钠（CMC）溶液

精确称取0.51gCMC于100mL小烧杯中，加入适量0.05 mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液，

加热溶解后移入 100mL容量瓶中并用 0.05 mol/L pH5.0 的柠檬酸缓冲液定容至100mL，用

前充分摇匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定 C 酶活力。

（6）0.5％水杨酸苷溶液

准确称取0.5g水杨酸苷于100mL小烧杯中，用少量0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液

溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定|?-葡萄糖苷酶活力。

（7）纤维素酶液的配制

准确称取纤维素酶制剂500mg 于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入 100mL

容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，此酶液的浓度为5mg/mL，4℃冰箱中保存备用。

四、操作方法和步骤

1．葡萄糖（G）标准曲线的制作

取 8 支洗净烘干的 20mL 具塞刻度试管，编号后按表 1 加入标准葡萄糖（G）溶液和

蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入 1.5mL DNS

溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。在 540nm波长