第2章 细胞生物学研究方法

CHAPTER 2
细胞生物学研究方法 Experimental Approaches
for Studying Cells
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OUTLINE
2.1显微成像技术（TECHNIQUES OF MICROSCOPY） 2.2 细胞组分的分析方法 （TECHNIQUES OF CYTOCHEMISTRY、 CELL
Mass spectrometry…
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思考题： 1、普通光学显微镜、暗视野显微镜和相差显微镜各有 什么特点，适于观察什么类型的样品？ 2、电子显微镜技术有哪些发展？与光学显微镜技术比 较有哪些优缺点？ 3、细胞组分的分析包括那些基本的实验技术？
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放大率 (magnification, M)
M=物镜放大率 X 目镜放大率
分辨率（resolution, R）:分辨出相邻两个物点间的最小距离
R=0.61λ/NA （λ:波长，可见光0.4~0.7μm）
显微镜的数值孔径 (numerical aperture, NA)
NA =n sina （n，介质折射率; a，镜口角）
? ? ? 最大分辨率
a:70° n:1.5(油) λ :450nm(可见光)
200nm(紫外光)4
2.1.1.2 常用光学显微镜：
◆普通双筒显微镜
(binoular microscope) ◆相差显微镜:
(phase contrast microscope) ◆微分干涉显微镜
(differential interference microscope） ◆暗视野显微镜
CHO细胞的培养
胚胎干细胞（embryonic stem cell）
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诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cell ,iPSC）
Yamanaka / Jaenisch四因子实验
带选择标记的成纤维细胞
Oct4 Sox2 Myc Klf4
嵌合体小鼠
iPS细胞
显微注射
移植
囊胚
2.3.2 细胞融合与单克隆抗体
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2.3.3 基因转染与敲除
转染 (transfection)：将具有生物功能的核酸转移 或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生 物功能
敲除 (knockout）:
显微操作术 (micro injection)
动物细胞核移植克隆 (Nuclear transfer)
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2.3 细胞工程技术（CELL ENGINEERING）
2.3.1 细胞培养 (Cell culture) 体外细胞培养的条件 ◆营养 ◆环境因素∶ 无菌环境、合适的温度、一定的渗透 压和气体环境、O2和CO2。后者对于维 持细胞培养液的酸碱度十分重要。 ◆代谢物和废物排除
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原代细胞 (primary cells)：从机体分离取出，<10 passages 细胞系 (cell line)：原代培养物首次传代成功后 细胞株 (cell clone) ：单细胞克隆
实验分三步∶ ◆构建重组载体； ◆转基因敲除； ◆筛选。
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基 因 敲 除 原 理
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基 因 敲 除 示 意 图 （1）
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基 因 敲 除 示 意 图 （2）
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2.4 组学研究技术 (GENOME、TRANSCRIPTOMICS、 PROTEOME)
• GENOME：High throughput DNA sequencing… • TRANSCRIPTOMICS: Gene expression array/Chip… • PROTEOME: protein array/Chip, tissue or cell chip,
◆其他：DNA、RNA染色: 原位杂交技术 (in situ hybridization)15
2.2.2 细胞分选 (cell sorting)
◆流式细胞术 (Flow cytometry) 干涉检测器：发现细胞 荧光检测器：发现标记
◆染色体分选 (chromosome sorting)
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2.2.2 细胞分选 (cell sorting)
(dark field microscope) ◆荧光显微镜
(fluorescence microscope) ◆激光共聚焦显微镜
(laserconfocalscaning microscope)
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正置显微镜
倒置显微镜
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◆相差显微镜： (phase contrast microscope) 无色、透明、活细胞结构 环形光阑（annular diaphragm） 相位板（annular phaseplate） 标本密度不同导致光程差 振幅差
◆流式细胞术 (Flow cytometry)
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2.2.3 细胞组分的分离 (isolation of cell components)
超速离心技术 (Ultra centrifugation)： 分离细胞器与生物大分子及复合物 ◆ 速度离心： 差速离心、移动区带离心 ◆等密度离心：density gradient
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◆微分干涉显微镜： (differential interference microscope） 更强立体感 ，便于显微操作
DIC
8பைடு நூலகம்
◆暗视野显微镜 (dark field microscope) ： 物体轮廓，无微细结构 丁达尔现象：光斜射到样品上
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◆荧光显微镜： (fluorescence microscope)
(scanning electron microscope) ◆扫描隧道显微镜
(scanning tunneling microscope) 微观世界物质表面特征，但样品必须是导体
◆原子力显微镜
(atomic force microscope） 微观世界物质表面特征，不要求导体，提供三维表面图，
不需样品处理、常压及液体环境中工作；但分辨率低于扫
层析分离技术 (High performance liquid chromatography, HPLC)： 分离蛋白质 ◆ 凝胶过滤 (gel filtration)： ◆亲和层析 (affinity purification)： ◆离子交换层析 (ion-exchange chromatography )
基本结构
◆电子光学系统由照明系统、标本室、成像系统、
观察窗和记录用的照相机等组成；
◆真空系统是保持电镜的真空度； ◆电子学系统即供电系统，需要高压稳压。
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电子显微镜种类：
◆透射电子显微镜：细胞内部结构观察
(transmission electron microscope) ◆扫描电子显微镜：样品表面形貌特征观察
转基因鼠及选择性基因剔除 (transgenic mice and conditional knockout)
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细胞核移植克隆
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Knockout Mice
The technique used to generate knockout mice was developed in the late 1980s by Marlo Capecchi at the University of Utah.
紫外光源激发细胞内
荧光标记染料
Excitation
Emission
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◆激光共聚焦显微镜： (laserconfocalscaning microscope) 激光扫描、分辨力提高、可立体三维重建
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2.1.2 电子显微镜 (Electron microscope) 电子束波长比光短100000倍 亚显微结构（超微结构）：R< 1nm
SORTING、 ISOLATION OF CELL COMPONENT） 2.3 细胞工程技术（CELL ENGINEERING） 2.4 组学研究技术 (GENOME、TRANSCRIPTOMICS、
PROTEOME)
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2.1 TECHNIQUES OF MICROSCOPY
镜像形成的三要素:
◆酶细胞化学技术（酶与底物） 酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细 胞内的定位。
◆免疫细胞化学技术（抗原抗体） 利用免疫反应定位组织或细胞中的抗原成分分布 免疫荧光技术 免疫电镜技术
◆放射自显影技术 (radioautography)：利用放射性同位素标记研 究细胞内大分子的合成动态（分布、定位、排出、合成等）
描电镜
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2.2 细胞组分的分析方法 2.2.1 细胞化学技术 （cytochemistry） 2.2.2 细胞分选 (cell sorting) 2.2.3 细胞组分的分离 (isolation of cell component)
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2.2.1 细胞化学技术（cytochemistry）
Cell morphology + cell component analysis
光学显微镜
电子显微镜
(The Light Microscope) (Electron microscope)
照明系统 (illumination)
可见光 vs 电子束
Light
Electron
样品 (sample)
透镜系统 (optics)
物镜: 玻璃 vs 目镜： 玻璃 vs
电磁透镜 荧光屏
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2.1.1 光学显微镜（The Light Microscope） 2.1.1.1技术参数：