职业院校技能大赛资料--畜禽肉中氟喹诺酮类兽药残留检测项目-工作站考核操作规程
畜肉中氟喹诺酮类药物残留操作指南
第六届河南省高职院校技能大赛暨2013年河南省高职组农产品质量安全检测技能大赛畜禽肉中氟喹诺酮类兽药残留检测现场考核操作指南选手编号本项目操作规程在参照《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》（农业部1025号公告-14-2008）基础上，考虑到竞赛的时间要求以及公平公正的原则，考核内容略有改动。
操作规程中每位选手做两个平行样。
样品预处理完成后，由组委会统一提供数据，计算样品中氟喹诺酮类药物含量、回收率、RSD值。
组委会为每个选手提供的玻璃器皿均洁净干燥，无需洗涤。
1 采样准确称取2份鸡肉样品（已由组委会事先粉碎成肉糜）2（±0.05）g于具塞离心管中，记录数据；由裁判在样品中统一加入混合抗生素标准溶液100µL。
2 提取2.1 准确移取20.0mL磷酸缓冲溶液在每份已称量好的鸡肉样品中，搅匀；2.2中速振荡5min；2.3离心（4000r，7min）；2.4 将上清液倒入50mL烧杯中，以备过柱用。
3 净化3.1 安装固相萃取柱，分别用2.0mL甲醇、再用2.0mL磷酸缓冲溶液活化；3.2 将活化好的固相萃取柱安装在固相萃取仪上，取离心所得上清液5.0mL 过柱；3.3 用水2.0mL清洗，挤干；3.4 用流动相2.0mL洗脱，挤干；并用5mL试管收集洗脱液；3.5 用一次性注射器吸取洗脱液，并将收集的洗脱液过0.22µm有机膜，直接装在样品瓶中，做好标记，供色谱测定。
4 分析依据给定条件进行残留量、回收率和RSD的数据分析。
备注：本赛项有几个检测关键点，需举手示意裁判。
畜禽肉中氟喹诺酮类兽药残留的检测结果分析选手编号环丙沙星残留量计算公式：132X =A C sV V A sV M式中：X —试样中环丙沙星的残留量（ng/g ）；A —试样溶液中环丙沙星的峰面积；As —对照溶液中环丙沙星的峰面积；Cs —对照溶液中环丙沙星的浓度（ng/mL ）V 1—提取用磷酸盐缓冲溶液的总体积（mL ）V 2—过C 18固相萃取柱所用备用液体积（mL ）V 3—洗脱用流动相的体积（mL ）M —供试试样的质量（g ）已知：平行样1峰面积值：A 1—120；平行样2峰面积值：A 2—122；对照溶液峰面积值：As —220；对照溶液中环丙沙星的浓度：Cs —10ng/mL ，裁判加入0.5µg/mL 环丙沙星100µL 。
畜产品中氟喹诺酮类药物残留高效液相色谱法检测技术
2016年第9期（下半月）农民致富之友 Nong Min Zhi Fu Zhi You276财经◎畜牧兽医畜产品中氟喹诺酮类药物残留高效液相色谱法检测技术穆伟峰（新乡市畜产品质量监测检验中心，河南新乡 450003）[摘 要] 目的改善畜产品中氟喹诺酮类药物残留检测。
方法样品经过磷酸盐缓冲液提取，过HLB固相萃取柱，用适当乙腈比例的流动相进行分离。
结果鸡肉、鸡蛋、猪肉样品回收在85%—95%之间。
结论操作简单，回收稳定。
[关键词] 畜产品 氟喹诺酮 药物残留 高效液相色谱法[中图分类号] S826 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650(2016)09-0276-011 材料与方法1.1 仪器与试剂Waters2695高效液相色谱仪，15厘米C 18粒径5um 液相色谱柱，WatersHLB 固相萃取柱（30mg ），安捷伦1200荧光检测器，高速离心机，高速振荡匀浆器。
恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星标准品，色谱纯乙腈、甲醇，超纯水，其他试剂均为分析纯。
1.2 工作试剂配制5.0mol/L 氢氧化钠溶液：取氢氧化钠饱和溶液28mL 加水稀释至100mL 。
0.03mol/L 氢氧化钠溶液：取5.0mol/L 氢氧化钠溶液0.6mL 加水稀释至100mL 。
0.05mol/L 磷酸三乙胺溶液：取浓磷酸3.4mL 用水稀释至1000mL ，用三乙胺调pH 至2.4。
30%乙腈缓冲液：取30mL 乙腈和70mL0.05mol/L 磷酸三乙胺溶液混合。
磷酸盐提取液：取磷酸二氢钾6.5g 加水稀释至500mL ，用5.0mol/L 氢氧化钠溶液调pH 至7.0。
洗脱液：乙腈与0.05mol/L 磷酸三乙胺溶液2比8配制。
流动相：乙腈与0.05mol/L 磷酸三乙胺溶液14比86配制。
1.3 标准溶液配制准确称取恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星约25.00mg ，达氟沙星5.00mg ，用0.03M 氢氧化钠溶液定容于25mL 容量瓶中，制成标准储备液，根据称量量和标准品浓度计算标准溶储备液浓度，分别约为1mg/mL 和0.2mg/mL 。
4-3 氟喹诺酮类药物残留的检测
※ 动物性食品中氟喹诺酮类药物的最高残留限量可查找农业部 235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》。
— 18 —
药物名
达氟沙星 Danofloxacin ADI：0-20
— 13 —
食品理化检验技术
氟喹诺酮类药物残留的检测
2
— 14 —
喹诺酮类药物是一类化学合成抗菌药，由于具有抗菌谱广、
抗菌作用强、使用安全及易于制造等优点，发展迅速。
基本母核结构：6-氟-4-喹诺酮-3-羧酸
O
F
COOH
N
— 15 —
常用药物结构
F
N HN
O COOH
N C2H5
诺氟沙星
O F
— 10 —
兽药残留的危害
毒性：急性中毒、慢性中毒 三致：致癌、致畸、致突变 诱导耐药菌株： 过敏反应 激素样作用 污染环境、影响生态：
— 11 —
中华人民共和国农业部公告 第235号
目的：为加强兽药残留监控工作，保证动物性食品卫生安全
A.不需要制定最高残留限量的药物：88 B.需要制定最高残留限量的药物：94
— 21 —
规定了动物性食品中达氟沙星、恩诺 沙星、环丙沙星和沙拉沙星药物残留 检测的制样和高效液相色谱测定方法
适用于猪的肌肉、脂 肪、肝脏和肾脏，鸡的肝 脏和肾脏组织中达氟沙星、 恩诺沙星、环丙沙星和沙 拉沙星药物残留量检测
测定原理
用磷酸盐缓冲溶液提取试样 中的药物，C18柱净化，流 动相洗脱。以磷酸-乙腈为流 动相，用高效液相色谱-荧光 检测法测定，外标法定量。
畜禽肉中多类兽药残留的快速检测
畜禽肉中多类兽药残留的快速检测黄 立（昆明市食品药品检验所，云南昆明 650032）摘 要：建立了猪肉、牛肉、鸡肉中磺胺类、四环素类、喹诺酮类共15种兽药残留量的快速检测方法。
样品经过Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液-2.5%乙酸乙腈溶液提取，经氯化钠、无水硫酸钠除水盐析后取乙腈相用高含碳量的C18吸附粉吸附净化，再用0.1%甲酸水乙腈（75+25）定容后上机检测。
结果显示，本方法测定三类混合药物的回收率在63.9%～104.0%，RSD在1.1%～12.2%，检测快速、灵敏度高、重复性好，定性定量准确可靠，适用于猪肉、牛肉及鸡肉中磺胺类、四环素类、喹诺酮类药物残留的快速检测。
关键词：液相色谱-串联质谱法；磺胺；四环素；喹诺酮Rapid Detection of Multiple Types of Veterinary Drug Residues in Livestock and Poultry MeatHUANG Li(Kunming Institute for Food and Drug Control, Kunming 650032, China) Abstract: A rapid method was established for the determination of 15 veterinary drug residues of sulfonamides, tetracyclines and quinolones in pork, beef and chicken. The samples were extracted by Na2EDTA-Mcllvaine buffer-2.5% acetic acid acetonitrile solution, and the acetonitrile phase was purified by adsorption with high carbon content C18 adsorbent powder after dehydration salting by sodium chloride and anhydrous sodium sulfate, and then fixed with 0.1% formic acid aqueous acetonitrile (75+25) and detected on the machine. The results showed that the method determines the recovery of the three types of mixed were 63.9%～104.0%, RSD were 1.1%～12.2%, rapid detection, high sensitivity, good repeatability, accurate and reliable qualitative and quantitative, suitable for the rapid detection of sulfonamides, tetracyclines, quinolones drug residues in pork, beef and chicken.Keywords: liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sulfonamide; tetracycline; quinolone合理使用兽药可以提高畜禽养殖效率，节省成本，缩短出栏周期，进而增加收益，但越来越多的人为追求经济效益滥用药物，导致了一些兽药以残留的形式流入人体，从而对身体健康造成威胁[1]。
DB13T1006-2009鸡肉中四种氟喹诺酮类药物残留
（１）
Ｃ＝望二生塑立丝Ｘ１０００ ＡＳ ｘ ｍ
式 中：
ｃ— 样品中氧氛沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留量，Ｗｇ／ｇ； Ａ — 样品溶 液中氧氟沙星 、诺氟沙星 、环 丙沙 星、恩诺沙星的峰面积 Ａｏ一一一空白实验被测物的色谱 峰面积或 峰高
Ａｓ — 标准工作溶翔液中氧氟沙 星、诺氟沙星、环丙 沙星 、恩诺沙星的峰面积 Ｃｓ
６ 色谱条件
６．１ 色谱柱：ＺＯＲＢＡＸ ＳＢ－ＡＱ ４．６Ｘ２５０ ｍｍ， ５ ５ｍ或相当者。 ６．２ 流动相：０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四Ｔ基澳化钱 （ｐＨ＝３．０）＋乙睛＝（９７．５＋２．５， ＶＮ）ｏ ６．３ 流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎｏ ６．４ 检测波长：激发波长２８０ ｎｍ，发射波长４５０ ｒａｎ， ６．５ 柱温：４０ｃＣ ６．６ 进样量：２０ ｐＬｏ
Ｄ Ｂ １ ３／ Ｔ １ ００ ６ － ２０ ０ ９
８．３ 空白试验与空白添加回收试验 每个试验批次的样品中至少必须 同 时 做 空白样品和空白添加样品 （实际加人值为已知）。空白鸡肉
添加样品的实际加人值水平可选在等于最大残留限量１０ ｇｇ／ｋｇ，或方法检测限２ ｐ ｇ／ｋｇ或略高的实际加 人值水平上操作 ；空 白样品和空 白添加样品的测定按步骤７操作。本试验用于计算试验的回收率Ｒｃ，试 验的回收率用于对阳性的残留结果进行残留量的校正。回收率Ｒ滋 公式 （１）计算。
７ 样 品 处理
７．１ 样品制备 取待检胸 肉 （或 腿 肉）样品，弃去筋 、皮 、骨和脂肪 ，切成小块后 ，用搅 肉机搅碎 。
７．２ 提 取
准确称 取 绞 碎 鸡肉样品５ｇ（精确至０．０１ ｇ）于５０ ｍＬ塑料离心管，加人１０ ｇ无水硫酸钠，加２５ ｍＬ 乙睛，用高速组织均质器于１５ ０００ ｒｐｍ高速均质０．８ ｍｉｎ＇ｖ １．５ ｍｉｎ后 ，３ ５００ ｒｐｍ离心１０ ｍｉｎ，移取上清 液转移到另一个５０ ｍＬ塑料离心管中，残渣用１５ ｍＬ乙睛重复提取一次 ，合并上清液。
氟喹诺酮类药物残留检测国标解读
氟喹诺酮类药物残留检测国标解读氟喹诺酮类药物残留检测国标解读氟喹诺酮类药物是一类广泛应用于人类及动物医药领域的抗菌药物，包括诸如氟苯尼考、氟哌酸、氟氧氟嗪等。
在兽药的使用中，为了保证食品中不残留过多的药物，国家制定了一系列的标准和方法来检测氟喹诺酮类药物的残留。
国标是指国家发布的关于特定物品或行为的规范和标准，是行业内进行质量控制和监督的重要依据。
对于氟喹诺酮类药物残留检测而言，国标主要涉及以下几个方面的内容：1. 检测方法：国标要求制定适用于氟喹诺酮类药物残留检测的方法，包括样品的采集、处理、提取、分离和定量等方面的技术要求。
这些方法通常采用高效液相色谱仪（HPLC）或质谱仪（MS）等仪器设备进行分析，以确保准确度和可靠性。
2. 检测限值：国标规定了氟喹诺酮类药物在食品中的残留限值，即食品中允许存在的最大药物残留浓度。
这些限值根据食品的种类、人们对该食品的摄入量以及药物的毒性等因素来确定，旨在保证食品的安全性和合规性。
3. 样品类型：国标规定了适用于氟喹诺酮类药物残留检测的样品类型，包括肉类、乳制品、水产品、蔬菜等。
针对不同的样品类型，可能需要不同的样品处理和预处理方法，以确保药物残留的有效提取和准确测定。
4. 检测设备和操作要求：国标还规定了氟喹诺酮类药物残留检测所需的设备和操作要求，包括仪器的性能指标、试剂的选择和使用、流程的标准化等。
这些要求有助于确保检测结果的准确性和可比性。
氟喹诺酮类药物残留的检测国标的制定和执行，对保障食品安全、合规经营和消费者权益具有重要意义。
遵循国标的要求进行药物残留检测，可以有效监控食品中的氟喹诺酮类药物残留情况，减少潜在的食品安全风险，保障公众健康。
同时，对于相关行业从业人员而言，了解并遵守国标的要求也是履行职责、提升专业素养的必要条件。
畜禽肉中兽药残留的测定(精)
《技能训练库》综合技能实训指导书实训项目名称畜禽肉中兽药残留的测定学时6学时实训目的1.熟练掌握高效液相色谱仪的使用方法。
2.学会NY/T 1025-14-2008测定动物性食品中氟喹诺酮类药物残留的方法。
一、原理用磷酸盐缓冲溶液提取试样中的药物，C18柱净化，流动相洗脱。
以磷酸-乙腈为流动相，用高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。
二、仪器、物品分析天平，高效液相色谱仪（配荧光检测器），组织匀浆机，旋涡混合器，离心机，固相萃取柱，离心管，移液管。
牛肉。
试剂：1.5.0mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠饱和液28mL，加水稀释至100mL。
2.0.03mol/L氢氧化钠溶液：取 5.0mol/L氢氧化钠液0.6mL，加水稀释至100mL。
3.0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液：取浓磷酸 3.4mL，用水稀释至1000mL。
用三乙胺调pH至2.4。
4.磷酸盐缓冲溶液：取磷酸二氢钾 6.8g，加水溶解稀释至500mL，用5.0mol/L氢氧化钠调节pH至7.0。
5.达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星标准工作液：准确量取适量标准储备液，用乙腈稀释成适宜浓度的标准工作液。
置2～8℃冰箱中保存，有效期1周。
三、操作步骤（一）称样准确称取3份牛肉样品（事先粉碎成肉糜）2±0.05g于50mL具塞离心管中，记录数据。
（二）提取准确移取20.0mL磷酸盐缓冲液在每份已称量好的牛肉样品中；将离心管置于漩涡振荡器上，中速振荡5min；用空离心管和纯化水在托盘天平上进行配平，然后高速离心（10000r，5min）；将上清液倒入25mL烧杯中，以备过柱用。
（三）净化将固相萃取柱在固相萃取仪上安装好，用5mL的刻度吸管分两次、每次吸取 3.0mL共6.0mL的甲醇活化，再用5mL的刻度吸管分两次、每次吸取 3.0mL共6.0mL的水进一步活化；取离心所得上清液 5.0mL过柱；用水 2.0mL清洗，挤干；用流动相 2.0mL洗脱；并用5mL试管收集洗脱液；用2mL的一次性注射器吸取洗脱液，并将收集的洗脱液过0.22μｍ有机系膜，直接装在样品瓶中，做好标记，供色谱测定。
职业院校技能大赛资料--畜禽肉中氟喹诺酮类兽药残留检测项目-预处理标准操作规程
2016年全国职业院校技能大赛（高职组）农产品质量安全检测赛项畜禽肉中氟喹诺酮类兽药残留的检测预处理标准操作规程考虑到竞赛的时间要求以及公平公正的大赛原则，本项目操作规程在参照《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》（农业部1025号公告-14-2008）基础上略有改动。
操作规程中由组委会统一准备空白样品，每位选手做三个平行加标样，样品预处理完成后，由组委会统一送至第三方检测机构检测。
注意事项：（1）为降低玻璃器皿本底残留的影响，组委会为每个选手提供的玻璃器皿由20%硝酸浸泡洗涤，均洁净干燥，使用前无需洗涤，也无需用蒸馏水润洗。
净化步骤用的一次性注射器和样品瓶均为全新、干燥、洁净，无需任何润洗。
（2）考前10分钟选手可认真阅读本操作规程，并对即将使用的玻璃器皿以及其他设备进行检查，如有需要更换，请向裁判提出更换。
比赛正式开始后，将不再更换任何设备，一切后果选手自负。
（3）每场比赛由上、下两个半场组成，固相萃取之前预处理操作为上半场，固相萃取之后预处理操作为下半场，每个半场比赛限时75分钟，各包括了器皿和设备整理和清洗，超时将相应扣分。
上半场结束后马上开始下半场考核。
注意：由于上下半场考核分别计时，因此请注意考核时间和内容！（4）请及时填写数据记录表，并不得在数据记录表上透露任何考生信息，数据记录表、操作规程在操作比赛结束后将收回。
（5）比赛过程中，有多个步骤需举手示意裁判，由于涉及到比赛的公平和公正，请切记要举手示意裁判！操作规程及要求：预处理上半场1 采样（本阶段完成请举手示意裁判）准确称取3份牛肉样品（已由组委会事先粉碎成肉糜，并放置于培养皿中。
）2±0.05g于50mL具塞离心管中，记录数据；举手示意，由裁判在样品中统一加入抗生素标准溶液。
数据记录表2 提取（本阶段完成请举手示意裁判）2.1 举手示意裁判来确认所加磷酸盐缓冲液体积，准确移取20.0mL磷酸盐缓冲液在每份已称量好的牛肉样品中；2.2 将离心管置于漩涡振荡器上，中速振荡5min；2.3 用空离心管和纯化水在托盘天平上进行配平，然后高速离心（10000r，5min）；2.4 将上清倒入25mL烧杯，以备过柱用；3 整理3.1 请保管好装有离心上清液的25mL烧杯和固相萃取柱，将其他用过的器皿进行清洗和整理；3.2 等待下半场考核。
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流动相：乙月葩0・025mol/L磷酸溶液
流速：0.8mL/min
压力：（T400bar
检测：278nm
温度：25°C
采集：运行时间8min
保存方法名为：Liquid方法“赛位号"。
如赛位号为SX05号，保存名为"Liquid方法SX05・mtd"。
2、单针序列
单针序列里完成下列功能：（其余参数默认）
文件名针数进样体积（uL）样品数量（憾/mL）是否为标准样氟喳诺酮标样1# 2 20 0.15 是
氟喳诺酮标样2# 2 20 0.25 是
氟喳诺酮标样3# 2 20 0.50 是
氟喳诺酮标样4# 2 20 0.75 是
氟喳诺酮标样5# 2 20 1.00 是
氟喳诺酮未知样 2 20 否
保存序列名为：Liquid序列"赛位号"。
如赛位号为SX05号，保存名为"Liquid序列SX05.ss"。
3.建标准曲线（利用外标法制作环丙沙星的五级别的标准曲线）
谱图组分保留时间（min）数量(pg/mL) 氟喳诺酮标样1# 环丙沙星 3.542 0.15
氟咚诺酮标样2# 环丙沙星 3.540 0.25
氟喳诺酮标样3# 环丙沙星 3.543 0.50
氟咚诺酮标样4# 环丙沙星 3.538 0.75
氟咚诺酮标样5# 环丙沙星 3.538 1.00
标准曲线数据存放在桌面“农产品质量安全检测竞赛•液相”文件夹中,打开标准图谱,判断图谱是否需要处理,如需处理,请先进行图谱处理,并保存,再用于标准曲线制作。
描述：氟喳诺酮标准曲线
显示模式：外标模式；组分名：环丙沙星；组分单位：pg/mL;响应类型：面积；
左窗宽：0.2;右窗宽：0.2;曲线类型：线性；原点方案为：考虑。
制作标准曲线并保存标准曲线名为：Liquid标准曲线“赛位号〃。
如赛位号为SX05号，保存名为"Liquid 标准曲线SX05.cal"。
4、未知样的谱图处理和含量计算
（1）利用软件打开未知样，谱图存放在桌面中"农产品质量安全检测竞赛-液相〃文件夹中，将基本积分参数峰宽设为0.02,峰高设为2,斜率设为20,并手动积分删除杂峰，只保留主峰。
（2）打开刚制作的标准曲线计算含量。
（3）保存处理的未知样图谱，备注中填写：手动积分保存，然后保存。
5、报告设置及打印
（1）打开桌面中"农产品质量安全检测竞赛-液相〃文件夹中“液相样式设置.sty〃，在"实验标头”上输入相应信息：如赛位号为SX05,在赛位号后输入SX05。
（2） PDF文档保存：选中"tinypdf打印机"将报告打印成"Liquid赛位号.pdf"并保存于桌面中"农产品质量安全检测竞赛-液相〃文件夹中。
（3）将桌面中"农产品质量安全检测竞赛-液相〃文件夹名称改名为"Liquid赛位号"，然后举手示意考官"请注意:此后考生不得再做任何修改。
（4）由工作人员当面将桌面上名为"Liquid赛位号〃的文件夹上传至主机存档，选手在赛位上等待现场裁判及工作人员打印工作站操作报告。
选手需由工作人员引导，到达指定位置亲自确认报告打印无误，并在报告第一页空白处签署"赛位号-我已确认”字样。
（5）在赛位上安静等待比赛结束，结束前不得离场。