植物细胞融合实验
植物体细胞杂交技术
法规限制
1
法规限制：植物体细胞杂交技术涉及基因编辑，可能受到相关法规的限制
2
伦理问题：植物体细胞杂交技术可能引发伦理问题，如基因编辑后的植物是否具有生命权等
3
技术难度：植物体细胞杂交技术难度较大，需要较高的技术水平和设备支持
4
安全性问题：植物体细胞杂交技术可能存在安全隐患，如基因编辑后的植物可能对环境造成影响
4
植物体细胞杂交技术的未来发展
技术优化
提高杂交效率：通过优化培养条件、选择合适的细胞融合方法等提高杂交效率
提高稳定性：通过优化培养条件、选择合适的细胞融合方法等提高杂交稳定性
提高产量：通过优化培养条件、选择合适的细胞融合方法等提高产量
降低成本：通过优化培养条件、选择合适的细胞融合方法等降低成本
法规完善
法规制定：制定植物体细胞杂交技术的相关法规，明确技术应用范围和限制
01
法规执行：加强法规执行，确保技术应用符合法规要求
02
法规修订：根据技术发展和社会需求，适时修订法规，适应新技术的发展
03
法规宣传：加强法规宣传，提高公众对植物体细胞杂交技术的认识和了解
04
谢谢
杂种植株经过筛选和鉴定，获得具有优良性状的新品种
技术应用
植物育种：提高作物产量和品质
生物制药：生产药用植物成分
环境保护：修复污染土壤和生态修复
生物技术研究：探索植物基因功能和调控机制
技术发展历程
01
19世纪末，植物体细胞杂交技术开始出现
02
20世纪初，植物体细胞杂交技术逐渐成熟
03
20世纪中叶，植物体细胞杂交技术广泛应用于农业生产
04
21世纪初，植物体细胞杂交技术在生物制药、环境保护等领域得到广泛应用
植物细胞融合(实验)
准备仪器
准备适当的显微镜、离心 机、摇床、培养皿等实验 仪器。
分离原生质体
表面消毒
将实验材料表面消毒，以避免污染。
酶解
用适当的酶溶液处理实验材料，使细胞壁分解，释放 出原生质体。
分离
将酶解后的组织用离心机或过滤法分离出生质体。鉴定通过形态学观察、分子生 物学技术或免疫学技术等 方法对融合细胞进行鉴定。
培养与繁殖
将筛选和鉴定合格的融合 细胞进行培养和繁殖，以 备后续实验或应用。
03
植物细胞融合实验结果分 析
融合细胞的筛选结果
1 2
筛选方法
采用抗性筛选和荧光激活细胞分选（FACS）等 方法，从融合细胞群体中筛选出具有稳定融合特 征的细胞。
筛选和培育融合细胞
在融合后的细胞中筛选具有双亲遗传 特征的融合细胞，并进行进一步的培 育和筛选。
克隆和繁殖
对筛选出的融合细胞进行克隆和繁殖， 获得具有特定性状的植物个体。
02
植物细胞融合实验步骤
准备实验材料
01
02
03
选择实验材料
选择健康、无病虫害的植 物组织作为实验材料，如 根、茎、叶等。
准备试剂
植物细胞融合(实验)
目录
• 植物细胞融合实验简介 • 植物细胞融合实验步骤 • 植物细胞融合实验结果分析 • 植物细胞融合实验的应用与展望 • 结论
01
植物细胞融合实验简介
植物细胞融合的定义
01
植物细胞融合是指将来自不同植 物的细胞通过物理或化学方法诱 导融合，形成一个具有双亲遗传 特征的融合细胞的过程。
植物细胞融合技术可以用于新品种的培育和遗传改良，未来可以开展 相关研究，为育种工作提供新的工具和方法。
(完整版)植物体细胞杂交技术
局限性：未能让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的优
良。
原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、 相互影响的，不能再像亲本遗传物质一样有序表达，杂交植株 不能地上长番茄、地下结马铃薯。
现学现用
• 如何培育出地上结大豆地下结花生的杂种植株呢？
本节小结
一、植物体细胞杂交的概念
将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞， 并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
（6）从理论上讲，杂种植株的育性为 可育。 若运用传统有性杂交方法能否实现？不能 ， 原因是 因为不同种生物之间存在生殖隔离。 因此，这项研究对于培养作物新品种方面 的重大意义在于 克服远源杂交不亲和的障碍。 （7）利用植物体细胞杂交的方法培育作物 新品种过程中，遗传物质的传递是否遵循 孟德尔的遗传规律？为什么？ 否
植物体细胞杂交过程示意图
植 物 细 胞 去壁 等量
原
生 质
原 生 质
体体
融
合
再
愈
杂
生杂
伤
种
细 胞 壁
种 细 胞
脱 分
化
组 织
再 分 化
植 株
去壁 纤维素酶
离心、振 动、电刺
筛 选
激、
果胶酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ聚乙二醇
意义：克服远源杂交不亲和的障碍，培育出自然
界中没有的、具有优良品质的新品种。
白 菜
甘
蓝
白菜－甘蓝
生产周期短、耐热、易储藏
小试牛刀
2.植物体细胞杂交技术去除细胞壁的原因是 （C）
A、植物体细胞结构中不包括细胞壁 B、细胞壁使原生质体失去活力 C、细胞壁阻碍了原生质体融合 D、细胞壁不是原生质体的组成成分
植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合
202X
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第 七 章 植物原生质体培养及细胞融合
陈传红 制作 2007 / 5
202X
本章内容提要： 原生质体培养的发展与意义 原生质体的分离 原生质体的培养 植物细胞的融合 体细胞杂种鉴定方法
1975年柑桔原生质体培养成功；
2
现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。
3
陈传红 制作 2007 / 5
番茄+马铃薯？
陈传红 制作 2007 / 5
3、融合方法
01
02
1、机械分离（Machanical isolation）
Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.
高度液泡化的细胞
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离（Enzymatic isolation）
双子叶外植体/培养细胞
单子叶植物胚性细胞
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。
单击添加副标题
清新立春时节
什么是原生质体（Protoplast）？
1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
植物细胞融合
结果与分析
活力很低， 活力很低，取 该条件下作为 一个融合亲本
取该条件下作为 一个融合亲本
融合原生质体细胞的分裂
初始培养的1 初始培养的1-2 天, 异核体较易识别。 异核体较易识别。
绿色的霸王原生质体 与红色的草木樨状黄 芪原生质体粘连。 芪原生质体粘连。
UV照射3 UV照射3分钟的霸王原生质体 照射 与经R 6G处理的草木樨状黄 与经R-6G处理的草木樨状黄 芪原生质体融合产物
优点： 优点：可以收集到数量 较大的纯净原生质体， 较大的纯净原生质体， 同时避免收集过程中 原生质体因相互挤压 而破碎。 而破碎。
活力检测
酚藏花红染色法： 酚藏花红染色法： 0.1%酚藏 0.1%酚藏 花红能使有活力的 原生质体染成红色， 原生质体染成红色， 无活力的原生质体 不着色。 不着色。
返回
亲本原生质体的预处理
预 处 理
的 原生质体 的 原生质体
处理
·
处理的
处理
处理
处理的
处理
返回
原生质体诱导融合
融合比例：大约1:1 融合比例：大约1:1 诱导剂：聚乙二醇(polyethyleneglycol诱导剂：聚乙二醇(polyethyleneglycol(polyethyleneglycol PEG)融合诱导液 PEG)融合诱导液 最终状态： 最终状态：形成杂种小愈伤组织
具体步骤
1.亲本原生质体的分离、收集纯化及活力检测 亲本原生质体的分离、 亲本原生质体的分离 2.亲本原生质体的预处理 2.亲本原生质体的预处理 3.原生质体诱导融合 3.原生质体诱导融合 4.杂种融合细胞的鉴别和筛选 4.杂种融合细胞的鉴别和筛选 5.杂种融合细胞的培养和杂种愈伤组织的形成及分化 5.杂种融合细胞的培养和杂种愈伤组织的形成及分化 6.杂种愈伤组织的RAPD分析和线粒体CAPS分析 杂种愈伤组织的RAPD分析和线粒体CAPS 6.杂种愈伤组织的RAPD分析和线粒体CAPS分析 7.杂种愈伤组织对渗透胁迫的抗性分析 7.杂种愈伤组织对渗透胁迫的抗性分析 8.PEG PEG胁迫下杂种愈伤组织的游离脯氨酸含 8.PEG胁迫下杂种愈伤组织的游离脯氨酸含
植物细胞融合(实验)
Potato plants growing in a test tube
Phenotype of intraspecific diploids of S. tuberosum
US-W9310.3 Somatic hybrid US-W9545.99
在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部 位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可 能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂 质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰 动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合， 形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大， 两个原生质体最终融合。
使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。 关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和 PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间 的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+ 结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分 子在膜上相互分离，由此引起融合。
Putative somatic hybrid plants
A fertile somatic hybrid
Phenotype of somatic hybrids clearly shows characteristics of both parents
S. brevidens somatic hybrid S. tuberosum
电融合法原生质体的融合结果
原生质体成串（40×）
原生质体融合（图1）
电融合法原生质体的融合结果
原生质体融合（图2） 原生质体融合（图3）
植物细胞融合的事迹
植物细胞融合的事迹
生物种类细胞来源甘蓝—青菜叶—根大豆—马唐草愈伤组织—叶矮牵牛—龙面花叶—花瓣大麦—花生种子—种子大麦—大豆叶—悬浮细胞小麦—矮牵牛叶—花瓣油菜—大豆叶—悬浮细胞玉米—大豆叶—悬浮细胞大豆—野豌豆悬浮细胞—悬浮细
胞大麦—蚕豆叶—根大豆—香草木犀悬浮细胞—叶酵母菌—鸡原生质体—血红细胞大豆—烟草悬浮细胞—叶大豆—秋水仙悬
浮细胞—叶人—胡萝卜腹水癌细胞—原生质体番茄—马铃薯叶—根尖人—小鼠纤维瘤细胞—畸态瘤细胞
1978年德国的梅罗帕斯博士用细胞融合的方法培育出了马铃薯(土豆)和番茄的杂交后代---薯番茄;他们先用酶液除去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两种去壁细胞(原生质体)等量混合，在混合液中加进聚乙二醇溶液，使原生质体紧密粘聚，再用高钙和高pH溶液处理，结果，马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达40%~50%。
植物体细胞融合技术
2.1．1植物细胞工程的基本技术--------植物体细胞融合技术学习目标1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。
2、尝试进行植物组织培养。
学习重点1、植物组织培养的原理和过程2、植物体细胞杂交的原理一、 植物体细胞杂交技术1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。
2．过程 不同的植物体细胞果胶酶纤维素酶−−−→−不同细胞原生质体−−−→−人工诱导原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。
3．植物体细胞杂交步骤：(1)去掉细胞壁，分离出有活力的 ，目前最常用的去细胞壁的方法是酶解法，也就是在温和条件下用 、 去除植物细胞的细胞壁。
(2)不同植物体细胞原生质体融合，必须通过 法和 法来诱导融合。
方法有： 等促使原生质体融合。
化学法是用(PEG)作为诱导剂来诱导融合。
融合后再生出 。
(3)用植物组织培养方法进行培育，可得到杂种植株。
如图在此过程中需要注意的问题有：①植物体细胞杂交过程中，植物体细胞融合所依据的生物学原理是 ；植物组织培养的理论基础是 。
②体细胞融合成功以后，既有AB 型杂种细胞，还能形成AA 型和BB 型两种融合细胞，但只有AB 型细胞是植物体细胞杂交所形成的杂种细胞，因此在杂种细胞形成后还应有一个 过程。
③目前常用的去除细胞壁的方法是 ，保证了原生质体活性。
植物体细胞融合完成的标志是新细胞壁的形成。
④植物体细胞杂交过程仍以植物组织培养为前提，通过植物组织培养完成杂种植株的培育过程。
⑤植物体细胞杂交的最大突破是克服远缘杂交不亲和的障碍，但是目前仍有许多理论和技术问题没有解决，离推广应用仍有一定距离。
【当堂检测】 1．不能．．用于人工诱导原生质体融合的方法是 （ ） A ．振动 B ．电刺激 C ．PEG D ．重压 2．与传统的有性杂交法相比，植物体细胞杂交的最大优点是 （ ） A ．可使两个亲本的优良性状组合到一起 B ．可以克服远缘杂交不亲和的障碍 C ．可以培育出高产性状明显的新品种 D ．可以降低生成成本，提高接济效益3．植物体细胞杂交的过程实质是 （ ）A ．细胞质融合的过程B ．细胞核融合的过程C ．细胞膜融合的过程D ．细胞原生质体融合的过程 4．原生质体融合后，需诱导产生细胞壁，参与此过程的细胞器是 （ ） A ．叶绿体、高尔基体 B ．线粒体、高尔基体 C ．叶绿体、线粒体 D ．线粒体、内质网 5．高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误．．的是 （ ）A ．该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的B ．该愈伤组织的细胞没有全能性C ．该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞D ．该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构 6．以下不能．．说明细胞具有全能性的实验是 （ ） A ．胡萝卜韧皮部细胞培育出植株 B ．紫色糯性玉米种子培育出植株 C ．转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株 D ．番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出植株7．植物组织培养过程中的脱分化是指 （ ）A ．植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞B ．未成熟的种子经过长期培养，培养出幼苗的过程C ．植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程D ．取植物的枝芽培育成一株新植物的过程8．在脱分化形成愈伤组织的过程中，下列各项为非．必要条件的是（）A．培养基需要消毒灭菌B．给予适宜的温度C．给予充足的光照D．给予适宜的养料和激素9．通过植物体细胞杂交，获得一个杂种植株需要的步骤是（）A．分离原生质体→诱导原生质体融合→组织培养→得到杂种植物B．分离原生质体→原生质体直接融合→组织培养→杂种植株C．获取细胞→原生质体融合→组织培养→杂种植株D．获取细胞→原生质体直接融合→组织培养→杂种植株10．胚状体是在植物组织培养的哪一阶段上获得的（）A．愈伤组织B．再分化C．形成完整植株D．取离体组织11．利用植物的茎尖、茎段、花药、花粉等，在无菌的条件下，放在玻璃器皿中人工配制的培养基上，使它发育成完整的植株。
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7 mmol/L 0.7mmol/L 3 mmol/L
甘露醇
0.5 mmol/L
用重蒸馏水溶解，调pH5.6，定容为酶
储备液，灭菌备用。
植物细胞融合实验
植物细胞融合实验
PEG诱导原生质体融合的机理： 带有大量负电荷的PEG与水之间的氢
键结合，使溶液中自由水消失，由于高度 脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不 同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭 曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。
植物细胞融合实验
在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部 位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可 能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂 质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰 动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合， 形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大， 两个原生质体最终融合。
主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、 二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂 质、Ca2+配合物等。 （三）电处理融合法
植物细胞融合实验
聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)融合 在众多的化学试剂中，PEG应用最为
广泛，因PEG液比病毒更易制备和控制、 活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合 的能力更强。PEG是一种多聚化合物。
在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两 个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生 膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。
通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完 整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代 的一些优良性状。
植物细胞融合实验
细胞在融合过程中发生的主要变化：
呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用 下，细胞膜的性质发生变化。 首先出现 细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的 膜发生粘连；继而融合形成多核细胞；在 培养过程中多核细胞又进行核的融合而成 为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核 的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。
permeate the
has mixed
membrane. The together. Only
membranes
the nuclei
then fuse.
remain separate.
植物细胞融合实验
D Entire fusion product:
The nuclei are now fused as well. As a rule, the number of chromosome s is reduced.
体伤害小；
4、融合是在同步状态下进行，活细胞数目多；
5、装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录
像融合过程；
6、免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控制
性强。
植物细胞融合实验
四、实验材料、试剂和仪器
1.材料
无菌烟草叶片、洋葱根尖
植物细胞融合实验
2.试剂
1）酶混合液
配制分两部进行：
（1）将CaCl2.2H2O NaH2PO4.2H2O MES
第六章 植物细胞融合（实验）
植物细胞融合实验
一、细胞融合的目的和意义
细胞融合能实现远缘杂交。其意义在 于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造 新种的界限，有可能形成有性杂交方法无 法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基 因型，扩大了遗传物质的重组范围。
植物细胞融合实验
二、细胞融合（cell fusion)概念
再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细 胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成 若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细 胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的 形成。
植物细胞融合实验
电融合法优点（与PEG法比较）：
1、融合率高； 2、重复性强；
Electrofusion
3、诱导仅发生在质膜接触部位，对细胞 或原生质
植物细胞融合实验
使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。 关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和 PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间 的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+ 结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分 子在膜上相互分离，由此引ectrofusion technique)法：
电处理融合法是20世纪80年代发展起 来的细胞融合技术，使融合率大为提高。
植物细胞融合实验
Model ECM830 from BTX
植物细胞融合实验 Electroporator 2510 from Brinkmann
电融合过程的分子机制： 是以电降解及双向电泳的联合作用为
基础。通过电泳，两细胞膜紧密接触，且 膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白 的类脂区。
植物细胞融合实验
三、细胞融合技术原理和方法
由于体外培养的细胞很少会发生自发 融合（融合频率大约在10-4~10-6之间）， 因此要采用生物、化学或物理的方法人为 地促使细胞融合。
植物细胞融合实验
促细胞融合的方法有： （一）病毒促进细胞融合
其中仙台病毒（HVJ）是最早用于动物细胞融 合的融合剂。 （二）化学融合剂促进细胞融合
B Fusion pulse: C Heterokaryon
phase:
A squarewave
pulse of a mere The cell
15
membranes are
microseconds
fused
is applied in
completely and
order to
the cytoplasm
Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa)
植物细胞融合实验
实际操作： 先把待融合的细胞或原生质体混合，取
样置于100V/cm的高频交流电场中，在非 均匀交流电场中形成项链状排列；
完整烟草原生质体（40×） 原生质体成串（40×） 植物细胞融合实验
植物细胞融合实验
电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱， 出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范 德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接 处的细胞膜表面曲率大，处于高张力状态， 在热力学上是不稳定的，所以最终导致两 细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。
植物细胞融合实验
A Alignment:
Cells are brought into close contact by means of dielectrophor esis.