red重组
Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文
Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——2001年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。
为了解这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。
然而，对于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百Kb.虽然现今有相应的载体，如BAC（人工染色体）和PAC（P1人工染色体）能装载如此大量的基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增的难度比较大[1、2].Red/ET重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源重组技术而言，它具有简单、快速、高效等特点，而且整个重组过程不需要经过体外扩增阶段，这样可以避免外界环境引起的不必要的突变。
1 传统同源重组自然发生的同源重组是两个DNA分子之间进行片段交换，从而使序列重排。
1956年，在大肠杆菌中，A John Clark发现了两种与同源重组有关的酶，RacA和RecBCD.在同源重组发生的时候，RecA 结合DNA单链或双链，对双链DNA进攻，把原来配对的互补链分开，并尝试自身与被入侵DNA链配对。
当配对成功后，RecA蛋白脱落。
或者在RecBCD的引导下，使目标DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的帮助下进行重组。
当两条链发生重组时，会产生holliday中间体，该中间体在重组完成时由RuvAB和RecG蛋白进行拆分。
至此，形成两条含有异源序列的双链DNA.在质粒或噬菌体转入大肠杆菌的实验中，当同源区段小于75bp时会使重组率显着降低。
但是实际上，在RecA重组系统中，要求同源臂的长度在1kb左右，且反应条件要求比较苛刻。
2 Red/ET 同源重组技术Red/ET同源重组系统，其实是Red同源重组系统和ET同源重组系统的总称，其中ET系统于1998年由Stewart等在大肠杆菌中导的Rac噬菌体中发现，随后又在噬菌体中发现了Red系统。
Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用
Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用李鑫;李亚芯;戴建君【摘要】基因敲除是研究基因功能最直接的方法.对于大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)而言,传统的基因敲除方法是利用其原有的RecA系统,此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点,且所需同源臂长,操作复杂.Red同源重组法的出现使得基因组的改造更为快速、简单,在E.coli基因敲除中的应用也愈加广泛和成熟.作者介绍了Red同源重组系统的组成和同源重组原理,阐述了常用的两步同源重组法敲除E.coli基因的操作步骤及注意事项.大肠杆菌的两步法基因敲除技术已在工程菌改造、病原菌致病机理、耐药机制研究等领域做出巨大贡献,由于两步法仍保留有Red同源重组系统电转效率低、有序列残留的缺陷,作者对几个针对两步法的经典的无痕化改造进行了总结介绍,通过对以上方法及应用进行综述,为以大肠杆菌作为工程菌的基因敲除技术提供参考.%Knock-out is the most direct way to exploregene''s function.The traditional method of Escherichia coli (E.coli) gene knock-out is to use its own RecA reorganization system, which relies onthe specific given cleavage sites of restriction enzymes, requires long homologous arm, furthermore, the operation is complex.Modification of the genome has become simple and rapid since the advent of Red homologous recombination method.And its application in E.coli gene knock-out has been more mature.The structure and functional principle of Red homologous recombination is introduced, besides, this review expounds the operating steps and notices of the common two-step Red-mediated recombination.The Red homologous recombination technologyin E.coli has made great contribution in the area of modifications ofengineering strain, pathogenicity and bacterial resistance of the pathogenic bacteria.Additionally,the advantages and shortcomings of the method are set forth.According to the disadvantage that the traditional method do leave recombinase recognition site scars and has low efficiency, a sum of classical methods for scar-less gene replacement are described in the final part of the article.These approach can provide better applications for the construction of E.coli genome.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)007【总页数】7页(P1934-1940)【关键词】大肠杆菌;Red同源重组;基因敲除;两步法【作者】李鑫;李亚芯;戴建君【作者单位】南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095【正文语种】中文【中图分类】Q784通过一定途径使基因去除或失活的技术称为基因敲除，又称基因打靶[1]，该技术可定向改造微生物，近年来已成为构建新型大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)生物工程菌的重要手段。
细菌基因缺失株的构建方法
汇 报 提 纲
1. 2. 3.
基本概念
Red重组系统介绍 重组自杀性质粒方法简介
一、基 本 概 念
基因的同源重组（homologous recombination） ， 又叫基因打靶（gene targeting）， 是指外 源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发 生重组， 并整合在预定的位置上， 从而改变了 细胞某些遗传特性的方法， 重组的目的是为了敲 除某个基因。
二、Red重组系统介绍 2、组
质粒pKD46： 为同源重组的 辅助质粒，含 温度敏感型复 制子，高于 37℃该质粒会 丢失，阿拉伯 糖诱导后能够 表达Gam、Beta 和Exo 3个λ 噬 菌体重组酶。
成
二、Red重组系统介绍 2、组
质粒pKD3： 为 PCR 扩增提供 氯霉素抗性基因 的模板，氯霉素 抗性基因两侧有 FRT位点(FLP重组 酶识别位点)，为 重组转化子提供 筛选标志。
二、Red重组系统介绍
Red重组系统
背景
组成
原理
利弊
二、Red重组系统介绍 1、背 景
敲除细菌基因的传统方法是利用RecA重组系统。RecA重 组系统是大肠杆菌内源性的同源重组体系，它由RecA蛋白和 RecBCD蛋白组成。这种方法需要较长的靶基因同源序列，还 需构建具有靶位点的质粒，重组效率较低。 近来由Murphy和Stewart等人用噬菌体的Red重组系统在 大肠杆菌中建立的快速敲除原核基因的方法简化了实验操作， 使实验周期大大缩短。这种重组技术是一项可在染色体水平 上进行遗传操作的新技术，只需较短的同源序列，而不需要 特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程，省 去了体外DNA 酶切、连接等步骤。
Red同源重组技术研究进展
Red同源重组技术研究进展Red 同源重组技术研究进展韩聪1,2张惟材1*游松2(1军事医学科学院⽣物⼯程研究所北京 100071 2沈阳药科⼤学沈阳 110016)摘要伴随着分⼦⽣物学的发展,⼀种基于噬菌体Red 重组酶的同源重组系统已应⽤于⼤肠杆菌基因⼯程研究。
Red 重组系统由三种蛋⽩组成:E xo 蛋⽩是⼀种核酸外切酶,结合在双链DNA 的末端,从5 端向3 端降解DNA,产⽣3 突出端;Beta 蛋⽩结合在单链DNA 上,介导互补单链DNA 退⽕;Gam 蛋⽩可与RecBC D 酶结合,抑制其降解外源DNA 的活性。
Red 同源重组技术具有同源序列短(40~60bp)、重组效率⾼的特点。
这种技术可在DNA 靶标分⼦的任意位点进⾏基因敲除、敲⼊、点突变等操作,⽆需使⽤限制性内切酶和连接酶。
此外,这种新型重组技术可直接将⽬的基因克隆于载体上,⽬的基因既可来源于细菌⼈⼯染⾊体也可是基因组DNA 。
Red 同源重组技术使难度较⼤的基因⼯程实验顺利进⾏,⼤⼤推动功能基因组研究的发展。
关键词 Red 同源重组基因打靶基因⼯程收稿⽇期:2003 08 05 修回⽇期:2003 11 03*通讯作者,电⼦信箱zhangweicai@/doc/c711836424.html同源重组是基因⼯程实验中常⽤的技术⼿段,在基因打靶和基因克隆⽅⾯具有重要作⽤。
常规的基因打靶技术是以Rec A 同源重组为基础,通常需要数百碱基甚⾄更长的同源序列,并且重组效率较低,更由于真核基因组中⼤量重复序列的存在,⽽导致意外重排现象的发⽣。
B AC 、PAC 、YAC 等克隆载体的构建为基因克隆提供了有⼒⼯具,但常规的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在,还需繁琐的连接、纯化步骤,⼤⼤限制了对⼤⽚段基因功能的研究。
近⼏年来,⼀种基于噬菌体Red 重组酶作⽤的同源重组技术逐渐成为基因⼯程研究的热点之⼀,并取得了⼀系列重要进展。
Red 同源重组技术的原理是将⼀段携带与靶基因两翼各有40~60bp 同源序列的PCR ⽚段导⼊宿主菌细胞,利⽤噬菌体Red 重组酶的作⽤,使导⼊细胞的线性DNA ⽚段与染⾊体(或载体)的特定靶序列进⾏同源重组,靶基因被标记基因置换下来(如图1所⽰)。
采用Red重组系统敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因
ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ － Ｐｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ｓ ｈ ｕ ｔ ｔ ｌ ｅ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｐ ＵＣＰ，ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｐ ＵＣＰ — Ｒｅ ｄ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｗａ ｓ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ Ｐ ＡＯ１ ｃ ｏ ｍｐ ｅ ｔ ｅ ｎ ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｂ ｙ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｏ —
采用 Ｒ ｅ ｄ重组 系统敲除铜绿假单胞菌弹性 蛋 白酶基 因
余 华 ， 熊浚 智 ， 何 晓梅 ， 盛哈 蕾 ， 蔡 文强 ， 谢 玮 ， 张克 斌
摘 要 ： 目的 敲 除 铜 绿假 单 胞 菌 弹 性 蛋 白酶 基 因 ， 获 得 无 弹 性 蛋 白酶 活 性 的 铜 绿 假 单 胞 菌 菌 株 。 方 法 采 用 Ｐ Ｃ Ｒ 从 ｐ Ｋ Ｄ ４ ６质 粒 上 扩 增 噬 菌体 的 Ｒ ｅ ｄ重 组酶 基 因 ，并 将 其 克 隆 到 大 肠 杆 菌 和 铜 绿假 单 胞 菌 穿 梭 质 粒 ｐ ＵＣ Ｐ多 克 隆 位 点 上 ， 电击 转化铜绿假单胞菌 Ｐ Ａ Ｏ１感 受 态 细 胞 ， 构建 Ｐ ＡＯ１ ／ ｐ ＵＣ Ｐ — Ｒｅ ｄ基 因敲 除体 系 。 常规 基 因 操 作 构 建 两 端 与 弹 性 蛋 白酶 基 因上 、 下 游 同源 ， 中 间 为庆 大 霉 素 抗 性 基 因 的线 性 打 靶 片 段 ； 并 将其 电击 转化 ｐ ＵＣ Ｐ Ｒ ｅ ｄ ／ Ｐ ＡＯ １感 受 态 ； 采 用 庆 大 霉 素 和 羧 苄 青 霉
ＹＵ Ｈｕ ａ ， ＸＩ ＯＮＧ Ｊ ｕ ｎ — ｚ ｈ ｉ ， ＨＥ Ｘｉ ａ ｏ — ｍｅ பைடு நூலகம் ， Ｓ Ｈ ＥＮＧ Ｈａ — ｌ ｅ ｉ ， ＣＡＩ Ｗｅ ｎ — ｑ ｉ ａ ｎ ｇ， ＸＩ Ｅ Ｗｅ ｉ ， ＺＨ ＡＮＧ Ｋｅ — ｂ ｉ ｎ
red同源重组操作流程
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RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法
RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组 酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化，当缺
少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，
降低模板对筛选工作带来的难度；
（1）纯化回收PCR产物； （2）内切酶消化处理模板； （3）使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切
选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性 克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增
“质粒多聚体”问题解决办法：
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统；
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）
解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。
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e、 RecBCD 切割产生3’单链末端
1.
Homologous DNA pairs
2. Nicks made near Chi GCTGGTGG) sites by RecBCD
2.两个DNA分子单链的 同一部位发生断裂。
8
.
ssDNA carrying the 5’ ends of the nicks is coated by RecA to form RecAssDNA dilaments. 3.两个断裂的单链的 游离末端彼此交换
recA蛋白：可结合单链DNA ，插入双链DNA同 源区，与互补链配对，将同源链置换出来。 recBCD：有三种酶活性，依赖于ATP的核酸外 切酶、核酸内切酶和解螺旋酶。 Beta:形成环状结构，SSB，结合在3’突出端， 防止被单链核酸酶降解，介导互补单链退火。 Gam:与RecBCD核酸外切酶结合，抑制对外源 DNA降解作用。 Exo:核酸外切酶，环状三聚体，中空通道一端容 dsDNA,另一端容纳ssDNA,结合在双链DNA末 端，从5’到3’降解DNA，形成3’突出
◘ RecBCD的识别和切割位点 a、 RecBCD结合在DNA的平 头末端 b、 外切、解链、移动 （ATP） c、 兔耳状 loop 结构产生 （再旋酶活性低于解旋酶活性） d、 RecBCD 在 loop 单链区的 chi 位点3‘方4～6NT处切 断单链（单链内切酶） ☀ chi位点：GCTGGTGG
9
4. RecA-ssDNA filaments search the opposite DNA duplex for corresponding sequence (invasion).
4.末端彼此连接形 成Holliday连接体 重组接点Recombination joint
10
接合分子 joint molecule
在大肠杆菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白参与 的同源重组。
（a） RuvA四聚体的图解。四个亚基形成的结构 像四个花瓣的花。 （b） RuvA/RuvB的作用： （左）RuvA四聚体结合到Holliday位点； （中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面， DNA穿过其中心， RuvB六聚体解螺旋，促进超螺旋分 叉点通过复合体移动。 （右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活 性位点ATTG切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。 （c） RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷 ，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面， 有四个负电荷区域位于其中心。 （d） 假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的 结构模型。
RecBCD的酶活性受重组热点Chi的调节。Chi位点 大肠杆菌基因组中的一种不对称的8 bp核苷酸序 列，5′-GCTGGTGG-3′，Chi位点能够改变RecBCD 的酶活性，它是大肠杆菌重组过程的必需组分， 是重组的热点。一旦RecBCD识别出Chi序列， RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活 性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原来优 先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链。但是它 的解旋酶活性未受到影响。 RecBCD酶活性变化的 结果是产生3’末端带有Chi位点的ssDNA。
4. form a four branched Holliday structure
5. Branch migration( 分支迁移)
异源双链heteroduplex
11
12
13
6.Holliday连 接体异构化 、拆分
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Resolving Holliday junction
15
5´ 3´ 3´ 5´
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´
内切酶
3´(recBCD)
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
DNA插入 (recA)
5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´
内切酶 (recBCD)
3´ 5´ 5´ 3´
分支迁移 (recA)
5´ 3´ 3´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´
DNA 连接酶
5´ 3´ 3´ 5´
Holiday中间体
3´ 5´ 5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
Holiday中间体
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´
内切酶 (ruvC)
5´ 3´ 3´ 5´
内切酶 (ruvC)
3´ 5´
3´ 5´Leabharlann 3´ 5´5´ 3´
DNA 连接酶
3´
5´ 3´ 片 段 重 组 体 5´ 3´ 5´ 3´
5´ 3´
5´
拼 3´ 5´ 接 重 组 体 5´3´
DNA 连接酶
3´ 5´
5´
3´ 5´
3´