同源重组基因敲除共34页
第六章：常用分子生物学技术——RNA干扰技术
识别并切割(qiēgē)与siRNA反义链互补的靶mRNA
（5）dsRNA的再生成
第十ānrǎo)
第十七页，共四十页。
RNA干扰(gānrǎo)
（RNA interference, RNAi）
siRNA（小干扰RNA）：21-23nt，由dsRNA裂 解而成的小片段，可诱导mRNA降解。siRNA主要
药学 分子生物 (yào xué)
学
第一页，共四十页。
生物芯片 （biochip） (shēnɡ wù xīn piàn)
以生物、电子、机械和信息技术为基础，在 固相支持物表面建立集成、连续、微型分析系 统(xìtǒng)，形成芯片，实现对生物大分子的准确、 快速、高通量、自动化检测。
第二页，共四十页。
第三十一页，共四十页。
REGγ基因敲除鼠（下图）出现脊椎(jǐ zhuī)弯曲等早衰现象
第三十二页，共四十页。
Gab1基因(jīyīn)敲除导致小鼠缺血性血管新生、侧枝循环建立出现 缺陷（图示上半部分），主要是由于血管内皮细胞管状结构形成的 信号调控通路出现障碍而引起的（图示下半部分）。
第三十三页，共四十页。
2、 RNA干扰技术缺点
“脱靶效应”（off-target effects）
第二十四页，共四十页。
RNA干扰技术(jìshù)的应用
1、基因功能研究（功能失活策略） “基因敲减（knockdown）”
2、基因治疗（基因(jīyīn)失活性治疗） （1）病毒感染性疾病
通过RNAi抑制 RNA病毒(bìngdú)复制 （2）基因过表达引起的疾病（如肿瘤）
特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片 段替代，从而使靶基因失活。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理引言随着基因工程技术的快速发展，人类对基因编辑和修饰的需求日益增加。
同源重组基因敲除是一种有效的基因编辑技术，可以精确地删除目标基因，进而研究其功能和影响。
本文将从基本原理、步骤以及应用场景等方面详细介绍同源重组基因敲除的原理。
基本原理同源重组基因敲除是一种人工改变生物体基因组的方法。
其基本原理是利用同源重组原理在特定基因位点引入外源DNA序列来替换目标基因或其部分序列。
这个外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因，用于筛选和鉴定敲除细胞。
在同源重组基因敲除中，通常选择目标基因的第一个外显子或关键区域进行敲除，以达到有效丧失目标基因功能的目的。
通过设计特异性的核酸引物，将外源DNA序列与目标基因特定区域相结合，通过同源重组来替代目标基因。
步骤同源重组基因敲除包括以下几个关键步骤：1.设计外源DNA序列：根据目标基因序列，设计与目标基因特定区域同源的外源DNA序列。
外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因。
2.制备敲除载体：将设计好的外源DNA序列插入到敲除载体中。
敲除载体通常是由质粒构建而成，具有选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以方便后续筛选。
3.细胞转染：将敲除载体导入目标细胞内。
转染方法有多种，包括化学法、电穿孔法和病毒介导转染法等。
转染后，对细胞进行培养和筛选。
4.筛选敲除细胞：根据选择性标记基因的特性，可使用对应的抗生素或其他筛选条件来选择敲除细胞。
只有敲除了目标基因的细胞才能存活下来，形成筛选突变株。
5.鉴定敲除细胞：通过PCR、Southern blot等分子生物学方法对转染细胞进行鉴定。
PCR扩增特定区域并进行测序分析，可确认目标基因是否被成功敲除。
应用场景同源重组基因敲除技术在基因编辑领域具有广泛的应用前景。
以下是该技术在一些应用场景中的具体应用：1.基因功能研究：同源重组基因敲除可以用于研究基因的功能和调控机制。
通过敲除特定基因，观察编辑细胞或生物体的表现差异，从而揭示该基因对生物体的重要性和功能。
分子生物学课件：基因敲除
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
基因敲除同源重组方法
基因敲除同源重组方法
哇塞，基因敲除同源重组方法，这可真是个超厉害的生物技术手段呢！
首先来说说它的步骤和注意事项哈。
一般呢，先得设计针对目标基因的同源臂，这就像是给基因做手术准备的精准工具。
然后把这些同源臂和筛选标记等构建到载体上，就像给工具找个合适的盒子装起来。
接着把这个载体导入到细胞中，让它们去发挥作用。
这里要注意载体的质量和导入的效率哦，可不能马虎。
在筛选的时候也要仔细，确保得到的是真正敲除了目标基因的细胞。
再说说这个过程中的安全性和稳定性。
其实啊，只要操作规范，安全性还是挺高的。
就像走在一条规划好的路上，只要不偏离轨道，就不会出大问题。
而且这个方法的稳定性也不错，一旦成功敲除，一般都能稳定遗传下去呢，这多让人放心呀！
那它的应用场景和优势可就多啦！可以用来研究基因的功能，这就好比是揭开基因这个神秘宝库的钥匙。
还能用于疾病模型的建立，为治疗疾病提供重要的线索和依据。
它的优势就是准确性高呀，能精确地敲除目标基因，这可太牛了！
比如说在癌症研究中，通过基因敲除同源重组方法，科学家们成功地研究了某些与癌症发生发展密切相关的基因，为癌症的治疗找到了新的方向。
这效果，简直太棒啦！
我觉得基因敲除同源重组方法真的是生物技术领域的一颗璀璨明星呀！它为我们探索生命的奥秘、解决疾病难题提供了强大的工具和手段，让我们对未来充满了希望！。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理同源重组技术是一种常用的基因编辑方法，它可以通过精确地改变某一特定基因的序列，从而实现对该基因的敲除或修饰。
同源重组基因敲除原理是基于DNA双链断裂修复机制的原理，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
下面我们将详细介绍同源重组基因敲除的原理及其应用。
首先，同源重组基因敲除的原理是基于DNA修复机制的。
在细胞中，DNA双链断裂是一种常见的DNA损伤形式。
细胞会通过两种主要的修复途径来修复这种损伤，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。
在同源重组修复过程中，细胞会利用同源DNA片段来修复断裂的DNA，从而实现对目标基因的敲除或修饰。
其次，同源重组基因敲除的实现需要引入外源DNA片段。
这些外源DNA片段通常包含有与目标基因相同或相似的序列，以便在同源重组修复过程中与目标基因发生配对。
一旦发生同源重组，外源DNA片段会替代目标基因的部分或全部序列，从而实现对目标基因的敲除。
同源重组基因敲除技术在基因编辑领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能。
通过敲除特定基因，研究人员可以了解该基因在生物体内的功能及其对生物体的影响，从而揭示基因与生物性状之间的关系。
其次，同源重组基因敲除还可以用于生物工程和生物医学研究。
研究人员可以利用这一技术来改良农作物、动物，甚至进行基因治疗，为人类健康和农业生产提供新的解决方案。
总之，同源重组基因敲除是一种重要的基因编辑技术，它基于DNA修复机制，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
这一技术在基因功能研究、生物工程和生物医学研究等领域有着广泛的应用前景。
随着基因编辑技术的不断发展，同源重组基因敲除技术将为人类社会带来更多的福祉和进步。
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 ppt课件
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
ppt课件
15
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
ppt课件
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TALEN 发展过程
ppt课件
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TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对
TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点
切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型； 干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
ppt课件
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III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
ppt课件
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（一）ZFN技术系统
ppt课件
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《基因敲除技术》PPT课件
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
15
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
23
2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂
同源重组的基因敲除
3.RNA干扰引起的基因敲除
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进 化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效 特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上 由双链RNA诱发的基因沉默现象。所以RNAi的反应过 程也可以用于基因敲除。
反转录病毒转染法：把含有重组的逆转录病毒载体病毒颗粒去感染卵 裂期胚胎，于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中，整合 到宿主细胞的染色体上。
体细胞核移植
二、基因敲除技术
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。
2、利用随机插入突变进行基因敲除 3、RNA干扰也可以引起基因敲除
摘自《中华医学信息》 2007年第22卷第21期
文献：
Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的 发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
基因敲除技术与诺贝尔奖
医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了 卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们 是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的 Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授