纤维连接蛋白1的原核表达、纯化及抗体的制备
人心肌肌钙蛋白I的原核表达及其兔抗体的制备
・论著・文章编号:1007-8738(2005)04-0463-04人心肌肌钙蛋白I 的原核表达及其兔抗体的制备徐 霞1,杨 能1,涂洪斌2(广州医学院:1检验系;2实验医学研究中心,广东广州510182)收稿日期:2004-07-02; 修回日期:2004-11-01基金项目:广东省医学科学技术研究基金资助项目(No .A2000265)作者简介:徐 霞(1962-),女,江苏连云港人,副教授,硕士生导师.Tel:(020)81340270;E mail:xuxia503@yahoo Prokaryoti c expressi on of human cTn I and prepara ti on of rabb it an ti 2hcTn I an ti bodyXU X ia 1,YAN G N eng 1,TU Hong 2bin21Depart m ent of Medical Laborat ory Sciences,2Ex peri m ental MedicalResearch Center,Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182,China[Abstract] A IM :To co n s truc t the p r o ka ryo ti c exp re s 2s i o n ve c t o r p ET 221a (+)2hcTn I a nd p rep a re the rabb it a n ti 2hcTn I a n ti bo dy u si ng hcTn I e xp re s sed i n E.co li a s i m m uno 2gen.M ETHOD S:The fu ll 2l e ng th ge ne e nco d i ng hum a n ca r 2d i a c tr opo n i n I (hcTn I )w a s syn the s i zed chem i ca ll y a nd i n 2se rted i n t o exp re s si o n p l a sm i d p ET 221a (+)t o co n struc t re 2com b i nan t p l a sm i d p ET 221a (+)2hcTn I .The recom b i nan t p l a sm i d w a s tran sfo r m e d i n t o E.co li BL21(D E3)p l ysS w h i ch the n e xp re sse d hcTn I unde r I PTG i nduc ti o n.The i m 2m uno l o g i ca l a c ti vity o f the exp re s se d hcTn Iw a s a na l yzed by W e s te rn b l o t .A ra bb it w a s i m m un i ze d w ith p u ri fi ed hcTn I t o p rep a re a n ti 2hcTn I an ti bo dy a nd the Ab ’s p r op e rti e s w e re i de n ti fi ed.RESU L TS:Hum an cTn I gene w a s syn the s i zed a nd co nfir m ed by DNA seque nc i ng.Po s iti ve recom b i nan tc l o ne s w e re i den ti fi ed by re s tri c ti o n e nzy m e d i ge sti o n a na l y 2s is a nd DNA seque nc i ng.Afte r i nduc ti o n w ith I PTG,hcTn I w ith M r be i ng 24000w a s e xp re sse d i n E.co li BL21(D E3)p l ysS ,a nd the e xp re sse d hcTn I a cco un tedf o r 28%o f t o ta l bac te ri a l p r o te i n.W e s te rn b l o t ana l ys is show e d tha t the hcTn I p r o te i n co u l d be reco gn i ze d by an a n ti 2hcTn I anti body .Rabbit po l ycl o na l anti body w ith a good speci fi city wa s obta i ned .The tite r of the po l ycl o na l anti body w a s 3×10-4.CO NCL U 2S I O N:The re com b i na n t e xp re s s i o n p l a sm i d o f hcTn I w a s co n struc te d succe s sfu ll y a nd exp re s se d i n E.co li .The p re 2p a re d rabb it an ti 2hcTn I an ti bo dy ha d a h i gh tite r and sp e c i 2fi c ity .[Keywords] cTn I ;p r o ka ryo ti c exp re ssi o n;an ti bo dy;rabbit[摘要] 目的:构建人心肌肌钙蛋白I (hcTn I )基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,并制备兔抗hcTn I 抗体。
人致肺纤维化因子的重组表达和抗体制备
人 致肺 纤维 化 因子 的重 组表 达 和 抗体 制备
陈 晓华 ，蔡 国平 （ 清华大学生物科学与技术系， 北京 １０８） ００４
ｓ ｒ ｌ ｅ ｔ Ｒｅ ｏ ｂ ｎ ｎ ｅ ｐｒ ｓｉ ｎ ｆ ｈｕ ａ ｆ－ 较高滴度 和较高 特异 性 的抗 体 ，并 用 Ｗｅｔ ｎｂｏ 鉴 定这 组 ｃ ｍ ｉ ａ ｔ ｘ ｅ ｓｏ ｏ ｍ ｎ ｉ
ｃＮ Ｄ Ａ连接 到 ｐＤ Ａ ． Ｄ载 体 后 在 真 核 细 胞 的 重 组 表 达。 ｃＮ ３１ 结果 ： 原核表达 的不可溶性 重组蛋 白也能 成功地 制备 出多克 隆抗体 。结论 ：成功地表 达 了人致肺 纤维 化 因子 ，并制备 出
高滴度 、高特异性 的多克隆抗 体 ，人致肺 纤维 化 因子 的表达 和功能研究提供 了一条途径 。 ［ 关键词 】 肺纤维化 ； 丁质 酶 ； 几 重组表达 ；多克隆抗体 ［ 中图分类号 ］ Ｒ ９ ． １ ３ ２ １ ［ 文献标识码 】 Ｂ
ｂ ｏ ｅ ｃ ａ ｔ ｒ ａ ｐｒ ｐａ ａ ｏ ｏ ｒ ｇ ｎｉ ｆ ｃ ｏ ｓ ｎｄ ｅ ｒｔ ｎ ｉ ｆ ｐ ｌ ｃｏ ａ ｎ ｉ ｏ ｉｓ ｏ ｙ ｌ ｎ ｌａ ｔｂ ｄ ｅ
Ｃ ＨＥＮ ａ — ｕ Ｘｉｏ ｈ ａ，Ｃ ｏｐｉｇ ＡＩ Ｇｕ － ｎ
Ｄ ｐ ｒ ｎ ｆ Ｂｉｌｇｃ ｌ ｃｅ ｃ ｎ Ｂ ｏ ｅ ｈ ｏ ｏ ｙ， Ｔ ｉ ｇ ｕ ｅ ａｔ ｍｅ ｔ ｏ ｏｏ ｉａ Ｓ ｉｎ ｅ ａ ｄ ｉｔ ｅ ｎ ｌｇ ｓｎ ｈ ａ
本 实验 室 曾于矽 肺大 鼠中纯化 出石 英 （ 氧化 硅 二 晶体 ） 导 的 支气 管肺 泡 灌 洗 蛋 白 ｉＢ Ｐ 诱 Ｓ Ｌ ｓ，体 外 具
ｏ ｅ ｇ ｎ ．Ｔ ｅｒｃ ｎ ｅ ｓ ｓ ｓ ｑ ｅ ｃ （ Ｓ）ｗａ ｌｎ ｄ ｎ ｅ ｅ ｈ ｉ ｏ ｓ ｎ ｕ ｅ ｕ ｎ ｅ Ｃｈ ｓｃｏ ｅ
原核表达及抗体的制备
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。
42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。
感受态细胞的制备1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50UL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行：3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。
在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。
注意：1mL的取液器设定在500mL。
悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。
4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。
细胞可以立即使用或储存。
5．将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。
注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。
转化：1．新鲜制备的或-20℃下保存的感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2．取200UL的感受态细胞，加入适量的重组子，轻轻混匀.3.冰浴30min.4．42℃水浴热激90秒。
5．冰上放置2-5分钟。
6．加400UL LB培养液，37℃振荡培养45分钟。
7．将适量的菌液涂布在Amp/LB（Amp50ug/ml）琼脂平板上。
pGEX-4T-3- pMD19-T-S11原核表达载体的构建、表达与纯化及多克隆抗体的制备
pGEX-4T-3- pMD19-T-S11原核表达载体的构建、表达与纯化及多克隆抗体的制备水生呼肠孤病毒是水域生态环境中广泛存在的一类病毒，其中草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)是在1991年被国际病毒分类委员会(ICTV)分到水生呼肠孤病毒属，是由中国分离鉴定的第一株鱼类病毒[1]。
GCRV是具有双层衣壳、无囊膜、立体对称的20面体球形颗粒，主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量以糖蛋白的形式存在的糖类，不含脂类[2]。
草鱼自古以来就是中国池塘养殖的当家品种，而GCRV被认为是水生病毒中对草鱼毒力最强、致病死亡率最高的病毒之一，该病毒引起的出血病不仅直接危害鱼体，而且会激发细菌性“三病”的发生，使草鱼的成活率降低到40~50[3]，甚至只有10%左右[4]，给中国的草鱼养殖业造成了很大的危害和困扰。
草鱼病毒性出血病，主要侵染于草鱼心脏、肝脏、肾脏、肌肉、脾、鳃、肠道等组织，且化学药物很难达到治疗效果，为了给草鱼养殖增产和减小不必要的经济损失，找到有效防治GCRV 的方法显得尤为重要。
GCRV基因组含有11条双链RNA(dsRNA)，其分段基因组RNA的3' 端不含poly(A)尾巴, 在5’和3’末端各含有特异的重复保守序列，为5’-GUUAUU和3’-UCAUC。
11个片段根据凝胶电泳迁移率可分为3组，即大片段(L1,L2,L3)、中等片断(M4,M5,M6)、较小片段(S7,S8,S9,S10,S11)。
GCRV共编码5 种非结构蛋白, 分别是NS16、NS26、NS31、NS38、NS80[5]。
病毒的非结构蛋白在病毒的复制过程中发挥重要作用。
其中NS26是由S11编码的，含有244个氨基酸残基，分子量为26.4KD, 是水生呼肠孤病毒特有的蛋白质, 没有同源蛋白，含ATP-依赖性的RNA解螺旋酶功能性位点[6]。
国际上对GCRV编码蛋白的功能(尤其是非结构蛋白的功能)方面的研究还不够系统和全面；但根据呼肠孤病毒家族中同源蛋白功能相似的原则，除非结构蛋白NS26外，GCRV各蛋白在病毒复制周期中的地位和作用已经初步明确[7]。
ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备
（Ａ ） ｍ ｂ 。方法 ： 克隆并 原核表达 Ｅ Ｃ １蛋 白， 氨基端带有 ＲＣ 其
６Ｈ ｓ － ｉ标签 。纯化后 的蛋 白免疫 Ｂ Ｉ ／ 小 鼠，经融合 、筛选 Ａ ｃ Ｂ 制备特 异 性 ｍ ｂ Ａ 。结 果 ：成 功 表 达 了 Ｅ Ｃ Ｉ蛋 白。Ｓ Ｓ ＲＣ Ｄ— ＰＧ Ａ Ｅ显示所表达蛋 白的相对分子质量 （ ） Ｍ 约为 ３ ０ 。获 ７０ ０ 得了 １株稳定分泌抗 Ｅ Ｃ ｌ Ｒ Ｃ 抗体 的杂交瘤 细胞 株（ Ｆ ） 其 ６８ ，
表达载体 ｐ Ｔ２ ａ ＋） Ｒ Ｃ 。 Ｅ －８ （ Ｅ Ｃ Ｉ
１２ ２ 重 纽 Ｅ Ｃ １蛋 白 的 表 达 及 纯 化 及 复 性 用 ｐ Ｔ２ ａ ．． ＲＣ Ｅ －８
（＋） Ｒ Ｃ Ｅ Ｃ Ｉ转化 大肠杆 菌 Ｂ ２ （ Ｅ ） Ｌ １ Ｄ ３ 。挑 取单 克隆接种 于
含 ５ ｇＬ卡那霉素 的 Ｌ ０ｍ ／ Ｂ培养基中， ７ ３ ℃震荡培养过夜 ， 按
６ ℃ ５ ，最 后 ６ ℃ 延 伸 １ ｉ。Ｐ Ｒ产 物 纯 化 回收 ，用 ８ ０Ｓ ８ ０ ｒｎ Ｃ ａ Ｎ ｅＩ Ｈｎ ｄ 和 ｉｄⅢ双 酶切 ，同时用 Ｎ ｅＩ Ｈｎ ｄ 和 ｉｄⅢ进 行双酶切 ｐ Ｔ２ ａ Ｅ 一８ （＋）载体质粒 ， Ｔ Ｎ 在 ４Ｄ Ａ连接酶作用下 ， 构建重组
ｉ ａ ｕ —ｌ — ｗ层析 系统 ，进行 — 止 ，国内 尚无 制备 其 单 克 隆抗 体 （ Ａ ） ｍ ｂ 的报 道 。我 溶解 。溶解 上清 采用 ＢｏＲ ｄ Ｄ ｏＦｏ
Ｔ ｉ Ｂｎ ． 缓冲液 Ｂ ２ ｍ ｌ ＲＳ ｐ ７ ８ （０ ｍ ｏ Ｔ Ｉ 、 Ｈ ． 、 们在 本 研 究 中表 达 纯 化 了 Ｅ Ｃ １蛋 白并 制 备 了其 Ｎ Ａ Ｈ ｓ ｉｄ亲和柱层析 ， ＲＣ
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。
适用范围蛋白原核表达。
实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。
（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。
（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。
（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。
（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。
（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。
（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。
（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。
（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。
莱茵衣藻IFT25的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备
莱茵衣藻IFT25的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备王震;董彬;樊振川;孟德梅【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2018(037)009【摘要】IFT25是维持纤毛运动和感知所必须元件纤毛内运输蛋白IFT复合物B 中的重要组分之一,探索IFT25尤其在模式生物菜茵衣藻中的作用机制具有重要作用.作者采用经济和简单的方法,制备莱茵衣藻IFT25的兔源多克隆抗体.将ift25分别连接到pMAL-c2X-和pET-28a(+)-载体上,转入大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG 诱导大量表达,并经亲和纯化后蛋白质纯度超过90％.通过颈背部皮下多次免疫8周龄大的新西兰大白兔,制备多克隆抗体,取第五次免疫后血清用ELISA测定效价超过128 000.抗血清依次经过Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blotting 检测抗体特异性,结果表明制备的抗体可以特异性识别菜茵衣藻中的IFT25,为IFT25作用机制的阐明和纤毛相关疾病的诊断提供了重要理论和方法支持.【总页数】6页(P903-908)【作者】王震;董彬;樊振川;孟德梅【作者单位】天津科技大学教育部食品营养与安全重点实验室,天津300457;天津科技大学教育部食品营养与安全重点实验室,天津300457;天津科技大学教育部食品营养与安全重点实验室,天津300457;天津市食品营养与安全和药物化学联合实验室,天津300457;天津科技大学新农村发展研究院,天津300457;天津科技大学教育部食品营养与安全重点实验室,天津300457;天津市食品营养与安全和药物化学联合实验室,天津300457;天津科技大学新农村发展研究院,天津300457【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.莱茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 [J], 田伟;董彬;李镇芳;孟德梅;樊振川2.莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定 [J], 董彬;吴松;程荣强;孟德梅;樊振川3.莱茵衣藻BBS1蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备 [J], 刘雁霞; 刘思佳; 王慧; 黄梦倩; 王岩; 樊振川4.莱茵衣藻BBSome组分蛋白BBS4的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备 [J], 周佳兰; 孙维越; Hadiatullah Hadiatullah; 董春明; 樊振川5.莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT57抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备[J], 韩鹏飞; 闫珍; 樊振川因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
AhAO2融合蛋白表达、纯化与抗体制备
ｍ ｌＬＮ Ｃ ） ｍｏ ａ Ｉ 漂洗 膜 以去除 膜 表 面 的 Ｔ ｅｎ２ ． ／ ｗ ｅ ０ 免 疫 复合 体 用 碱 性 磷 酸 酶 反 应 试 剂 盒 （ 根 生 化 科 天
３ Ｐ Ｏ Ｘ—Ｈａ—Ａ Ａ ２诱导 后菌体 总蛋 白（ ｒｔｉ ｆＩＴ ：ｐ Ｒ Ｅ ｔ ｈＯ Ｐｏｅ ｏ Ｐ Ｇ—ｉ— ｎ ｎ
心脏 采 血 ， 离 出血 清． 分
１ ６ Ｗ ｅ ｔｒ ｏ ． ｓｅ Ｂｌｔ ｎ
Ｍ：５ ｐＤＮ ａｄｒ１ Ｐ Ｒ空 白 对 照 （ Ｃ ｅａｉ ｏｔ １ ； ： ２ ０ｂ Ａ ｌ ｅ； ：Ｃ ｄ Ｐ Ｒ ｎｇｔ ｅｃｎ ｏ） ２ 重 ｖ ｒ
组质粒 Ｐ Ｒ检测 （ Ｃ ｒ ｕ ｔ ｆｐ Ｒ Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ ｐｏ ｃ Ｐ Ｏ Ｘ—Ｈｔ ｄ ｏ ａ—Ａ Ａ０ ； 重组 ｈ ２） ３：
ｅ ｌｔ ｒ ｂｏ 检测显示其只 与 Ｈ ｓ ｈ Ｏ Ｒ ｉ—Ａ Ａ ２融合 蛋 白结合． 实验成功制备 了抗 Ａ Ａ ２特异抗体． ｈＯ 关键词 ： 花生 ； ｈ Ｏ ；ｐ Ｒ Ｅ Ｈ ａ Ａ Ａ ２ Ｐ Ｏ Ｘ Ｔ ；原核表达 ； 抗体
中 图 分 类 号 ： ７ Ｑ８ 文献标志码 ： Ａ
１３ ｐＲ Ｅ ． Ｐ Ｏ Ｘ—Ｈ ａ—Ａ Ａ ２重 组表 达载体 构 建 ｔ ｈ０
ｏｉａｅＡ Ａ ｘ ｓ， Ｂ Ｏ）催 化 的 反 应 是 高 等 植 物 脱 落 酸 ｄ （Ｂ Ａ Ａ）生 物 合 成 途 径 的 重 要 步 骤 ¨Ｉ ． 中 由 ２ 其 Ｊ
ＡＡ Ｂ Ｏ催化 Ａ Ａ生物合成 的最后一步反应 ， Ａ Ａ Ｂ 将 Ｂ
２ 华南师范大学生命科学学院 ， ． 广东省植 物发育生物工程重点实验室 ， 广东广州 ，１６ １３ 广州甘蔗糖业研究所 ， ５０ ３ ；． 广东广 州 ，１３６ ５０１）
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究随着生物技术的发展，蛋白表达与纯化技术在医疗、工业以及科学研究等领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，重组蛋白的高效表达及纯化技术是蛋白质学研究的关键环节之一。
本文旨在探讨目前被广泛应用的几种重组蛋白表达及纯化技术，以及它们的新进展与应用前景。
一、背景介绍重组蛋白指的是通过基因重组技术将人工合成的DNA片段引导到细胞中，使其在受到特定刺激后大量表达特定功能蛋白的一种新型蛋白质。
由于其具有高度专一性、易制备性以及更高的效力和安全性，越来越多的药物被开发为基于重组蛋白的生物制剂。
二、重组蛋白表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是将DNA片段导入大肠杆菌等细菌中，在其形成菌落的过程中进行表达。
该系统的优点在于表达速度快、操作简便、表达产量高。
但同时，由于原核表达与真核细胞中的表达相比，它对于蛋白翻译辅助因子和蛋白修饰等生物特征的模拟程度较差，不利于蛋白的正确折叠，因此该系统表达的蛋白质通常需要经过重新折叠处理。
2. 原核表达系统与原核表达系统相比，真核表达系统更接近真实情况中的表达方式，对于全长的蛋白大多数时候能够实现正确的折叠。
在真核表达系统中，常用的系统包括昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌表达系统等。
其中，哺乳动物细胞表达系统能够实现高产量、高质量的蛋白质表达，因此被广泛应用于蛋白质制备。
三、重组蛋白纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中分离出来的技术。
该技术的依据是一种特定的与目标蛋白质具有相互作用的配体分离柱。
在该技术中，目标蛋白质与配体分离柱上的特定功能团结合，非特异性的蛋白质能够在洗脱过程中被去除。
2. 总体分离法总体分离法是将目标蛋白从混合物中分离出来，采用离心、可溶性和非可溶性的分离方法。
其中，在采用可溶性分离的方式时，常用的方法有两相法、分配层析等。
四、新兴技术及应用前景近年来，3D打印技术的应用逐渐渗透到生物医疗领域，并开始用于制备组织工程器官和人造蛋白质等领域。
LINE_1编码蛋白L1_ORF1的原核表达纯化和多克隆抗体制备
中国生物工程杂志 Ch i n a B iotechnology ,2010,30(10):7 11LI NE 1编码蛋白L1 ORF1的原核表达纯化和多克隆抗体制备*胡明明1,2朱运峰1**王 越2 王 宇2 张 亮2 高旭东1 董金凯3 于继云2**(1军事医学科学院附属医院 北京 100071 2军事医学科学院基础医学研究所 北京 100850)(3中国人民解放军总医院 北京 100853)摘要 目的:制备具有肿瘤组织特异性表达的L1 ORF1蛋白多克隆抗体并进行初步应用研究。
方法:采取基因工程表达方法制备L1 ORF1蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELI SA 检测抗体效价,W estern blot 和细胞免疫荧光方法检测抗体特异性,免疫检测验证其识别肿瘤细胞内L1 ORF1蛋白的特异性。
结果:制备的抗L1 ORF1蛋白多克隆抗体具有很高的敏感性与特异性,免疫学检测表明该抗体不仅能检测出正常细胞中瞬时表达的L1 ORF1蛋白,而且可检测出肿瘤细胞中天然表达的L1 ORF1蛋白。
结论:制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性,为以后该抗体的进一步应用奠定了基础。
关键词 L1 ORF1p 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体 间接免疫荧光中图分类号 R730.21收稿日期:2010 06 07 修回日期:2010 07 08*国家科技重大专项基金(2008ZX10002 003)、国家自然科学基金(30772002)资助项目**通讯作者,电子信箱:z huyf 2004@163.co m;yujyun @126.co mL I NE (long interspersed nuclear ele m e nts ,L1)长散布核元件,是人类基因组中重要的重复序列,L I NE1(L1)为主要的L I NEs 序列,占人类基因组的17%。
L1通过转座,在人类基因组中获得多达10万份的拷贝数[1]。
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·６０·纤维连接蛋白１的原核表达、纯化及抗体的制备王菲菲苏畅吴海东王萌孔鹏洲刘民李欣汤华【摘要】目的构建人纤维连接蛋白ｌ（ＦＮｌ）基因的原核表达载体，诱导其表达并纯化该蛋白，制备特异性抗体。
方法利用ＲＴ—ＰＣＲ方法扩增人ＦＮＩ编码序列４５０ｂｐ的片段，包含ＦＮｌ羧基端的１５０个氨基酸。
构建原核表达质粒ｐＲＳＥＴＡ２－ＦＮｌ，转化大肠杆菌Ｂ也１（ＤＥ３），ＦＮｌ蛋白经异丙基二Ｂ－Ｄ·硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达。
融合蛋白通过Ｎｉ“一ＮＴＡ树脂亲和纯化后免疫兔制备抗体血清。
蛋白质免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫组化检测其特异性。
结果成功构建重组质粒ｐＲＳＥＴＡ２一ＦＮＩ，限制性内切酶酶切鉴定及ＤＮＡ测序均显示插入片段正确。
ＳＤＳ．ＰＡＧＥ凝胶显示表达的融合蛋白相对分子质量约为２００００（ＦＮＩ．Ｈｉｓ标签），与预期结果一致。
酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测抗体效价约为ｌ：１００００，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示可以特异性地检测出人血浆和肝癌细胞系ＨｅｐＧ２全细胞裂解液中相对分子质量约２５００００的纤维连接蛋白。
免疫组织化学可显示ＦＮＩ在正常肺及肺癌组织中的特异性分布。
结论成功地原核表达了ＦＮＩｃ．末端蛋白，并免疫获得了抗ＦＮＩ特异性抗体。
【关键词】纤维连接蛋白；基因表达；抗体；癌症Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ１ＷＡＮＧＦｅｉ－ｆｅｉ，ＳＵＣｈａｎｇ，ＷＵＨａｉ－ｄｏｎｇ，ＷＡＮＧＭｅｎｇ，ＫＯＮＧＰｅｎｇ·ｚｈｏｕ，ｕｕＭｉｎ。
ＬＩＸｉｎ，ＴＡＮＧＨｕａ．Ｔｉａｎｊｉｎ啦ＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒａｎｄＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＴａｎｇＨｕａ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｔａｎ９２００２＠ｙａｈｏｏ．ＣＯｒｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｒｅｓｓｈｕｍａｎｆｉｂｍｎｅｃｔｉｎｌａｎｄｇｅｎｅｒａｔｅｓｐｅｃｉｌｉｃｈｕｍａｎｆｉｂｍｎｅｃｔｉｎｌａｎｔｉ：ｂｏｄｙｉｎｒａｂｂｉｔ．ＭｅｔｈｏｄｓＡ４５０ｂｐｌｅｎｇｔｈｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＦＮｌｇｅｎｅ。
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅ１５０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆｔｈｅＣ—ｔｅｒｍｉｎａｌ。
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０９ＪＣＺＤＪＣｌ７５００）作者单位：３０００７０。
天津医科大学基础医学院天津市生命科学中心实验室（王菲菲，硕士研究生）通信作者：汤华。
Ｅ．ｍａｉｌ：ｈｔａｎｓ２００２＠ｙａｈｏｏ．㈣·论著·成的二聚体，其结构类似、免疫原性相同，具有广泛的生物学活性，与细胞的形态、粘附和转移等相关…。
ＦＮ是许多组织基质中的组成成分，其在基质中的不断聚集，不仅在细胞周期的调节过程中发挥了重要作用，而且也是基质的其他组分，如胶原、凝血酶敏感蛋白和纤维蛋白原等沉积的基本调节因子，具有自我装配和配体结合的特性【引。
研究证实，ＦＮ的存在对于Ｉ型胶原、凝血酶敏感蛋白ｌ、无活性转化生长因子（ＴＧＦ－Ｂ）结合蛋白和原纤ｌ的持续组装是必需的，而且ＦＮ的胶彬明胶结合区域中存在着原纤的结合位点口刮。
同时，ＦＮ的聚集对基质的稳定、细胞一基质粘附位点的重塑和整连蛋白信号通路的调节也至关重要”】。
基质ＦＮ还可以通过促进已获得的抗药性的发挥和为靶组织中的转移细胞提供着位点来影响转移细胞的命运【６Ｊ。
所以说，ＦＮ是细胞外基质生物合成的主导。
ＦＮ是连接细胞与基质间的一种介质，存在于细胞表面、结缔组织、大多数基质膜和细胞外液中，根据其在体内分布的不同，分为细胞型和血浆型。
细胞型的纤维连接蛋白存在于成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌等的表面；血浆型的纤维连接蛋白则在血浆和细胞间液中，具有可溶性。
细胞ＦＮ是由成纤维细胞和其他细胞类型表达并释放于临近的细胞外基质，血浆ＦＮ则是由肝细胞高表达并以可溶的形式分泌于血浆，在循环中的半衰期是２ｄ。
细胞ＦＮ存在于组织中，并组合到纤维网，而可溶性的ＦＮ则在血管损伤的时候聚集。
ＦＮ从细胞分泌出来的时候是可溶的、无活性的、二硫键结合的二聚体，然后以活性形式结合到原纤，其中血浆ＦＮ含量对多种疾病的诊断和预后有重要的意义【＿７ｌ。
本研究通过克隆表达ＦＮｌ部分基因片段，纯化多肽。
免疫兔，获得了抗ＦＮｌ特异性纯化的抗体。
１材料和方法ｉ．Ｉ材料主要试剂与菌株：ＴＲｌｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｉｇｅｎ公司，Ｍ．ＭＬＶ逆转录酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，限制性内切酶ＢａｍＨｌ和Ｘｈｏｌ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ为ＴａＫａＲａ产品，，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂为Ｓｉｇｍａ公司产品。
大肠杆菌ＸＬｌ一Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态、ｐＲＳＥＴＡ２表达载体由本实验室保存。
Ｎｉ２＋一ＮＴＡ树脂购自Ｑｉａｎｇｅｎ公司，Ｅｐｏｘｙ修饰琼脂糖凝胶购于北京韦氏博公司。
１．２方法１．２．１ＨｅｐＧ２细胞ＲＮＡ的提取、逆转录：提取ＨｅｐＧ２细胞ＲＮＡ按照ＴＲＩｚｏｌ说明书进行。
逆转录反应：总ＲＮＡ５斗ｇ，ＯｌｉｇｏｄＴｌ斗ｇ，加ＤＥＰＣ水至１１山，６５℃１０ｍｉｎ，冰上冷却２ｍｉｎ，１２０００ｒ·ｍｉｎ。
离心５ｓ，加入逆转录缓冲液４山、１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｌ一、０．１ｍｏｌ／ＬＤ’ｒＩ’２山、ＲＮａｓｉｎ１一、２００Ｕ·ｗｌＭ－ＭＬＶｌ山。
４２。
Ｃ孵育１ｈ，７０℃１０ｒａｉｎ，产物保存于一２０℃。
１．２．２ｐＲＳＥＴＡ２一ＦＮｌ载体构建：以逆转录产物ｅＤＮＡ为模板，上游引物５’ＧＣＧＧＡＴＣＣ’兀ＷＧＡＡＧＴ－ＧＧＴＣＡＴＩｑ＇ＣＡＧＡＴＧ３’（含ＢａｍＨｌ内切酶位点）和下游引物５’ＣＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴｃＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴ．ＴＣＴＣＴＧ３７（含Ｘｈｏｌ内切酶位点，引物由北京奥科合成）。
ＰＣＲ反应条件：９４ｏＣ预变性４ｍｉｎ，再以９４℃１ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
切胶回收ＰＣＲ产物，ＢａｍＨｌ、Ｘｈｏｌ酶切ｐＲＳＥＴＡ２表达载体和ＦＮｌＰＣＲ回收片段，３７℃孵育４ｈ，酶切后再次回收，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶４℃连接约１６ｈ。
然后将重组质粒ｐＲＳＥＴＡ２一ＦＮｌ转化入ＸＬｌ一Ｂｌｕｅ中，３７ｏＣ２５０ｒ·ｍｉｎ。
１培养过夜。
采用碱裂解法小量快速抽提质粒ＤＮＡ，以ＢａｍＨｌ、Ｘｈｏｌ双酶切作进一步鉴定，选取阳性重组子委托北京奥科公司测序。
１．２。
３ｐＲＳＥＴＡ２－ＦＮＩ融合蛋白的诱导表达：将重组质粒ｐＲＳＥＴＡ２．ＦＮｌ转化人大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），挑取单克隆菌落培养过夜后按１：１００的比例接种于１００ｍｌＬＢ氨苄抗性培养基中，３７℃培养至菌液ＯＤ６００达到０．５—１．０时，取１ｍｌ作为诱导前对照，加入ＩＰＴＧ至终浓度为１ｍｍｏｌ·Ｌ～，３７０Ｃ诱导表达４ｈ。
６０００ｒ·ｒａｉｎ一，４０００ｇ离心１５ｍｉｎ，去上清收集菌体，加入Ｂｕ能ｒＢ（１００ｍｍｏｌ·Ｌ４ＮａＨ２Ｐ０４，１０ｍｍｏｌ·Ｌ～ＴｒｉｓＣｌ，８ｍｏｌ·Ｌ４尿素，ｐＨ８．０）重悬菌体后超声裂解，１００００ｇ离心１０ｍｉｎ留取上清。
取部分上清加入上样缓冲液（含有１００ｍｌ·Ｌ４ｐ一巯基乙醇）水浴煮沸５ｒａｉｎ，冰上放置５ｍｉｎ，上样，进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，考马斯亮蓝染色分析。
１．２．４融合蛋白的纯化：将表达融合蛋白的菌液转接到３００ｉｎｌＬＢ中扩大培养，并按上述条件诱导表达和裂解菌体，然后离心将上清液加到Ｎｉ“－ＮＴＡ树脂中，４ｏＣ旋转混匀３０ｍｉｎ，加入ＢｕｆｆｅｒＣ（１００ｍｍｏｌ·Ｌ—ＮａＨ２Ｐ０４、１０ｍｍｏｌ·Ｌ～ＴｒｉｓＣｌ、８ｍｏｌ·ＬＪ尿素，ｐＨ６．３）洗涤柱床去除杂蛋白，再加入ＢｕｆｆｅｒＤ（１００ｍｍｏｌ·Ｌ“ＮａＨ２Ｐ０４、１０ｍｍｏｌ·Ｌ“ＴｒｉｓＣｌ，８ｍｏｌ·ＬＪ尿素，ｐＨ４．５）洗脱目的蛋白，最后洗脱液经磷酸盐缓冲液（１×ＰＢＳ）透析后一２０℃保存。