怀山药种质资源的包埋玻璃化超低温保存和植株再生
焦作市四大怀药种植现状及应对措施
河南农业2021年第28期经济作物四大怀药是指古怀庆地区系焦作市所辖的沁阳市、温县、孟州市、武陟县、博爱县、修武县所生产的山药、地黄、牛膝、菊花4种中草药，是最具地域特色和开发价值的独有资源，距今已有3000年的种植历史。
四大怀药因其独特神奇的作用和悠久的历史，已被国家列为“国药四宝”，享誉中外。
一、四大怀药种植情况2020年，焦作市四大怀药种植面积达到1.24万hm 2，其中，山药种植面积0.48万hm 2，地黄种植面积0.65万hm 2，牛膝种植面积0.03万hm 2，菊花种植面积0.08万hm 2。
每667 m 2山药平均收益为1万元，每667 m 2地黄、菊花平均收益为5000元。
从种植区域看，怀药种植主要集中在温县、武陟县、孟州市和沁阳市，种植面积分别达到0.53万hm 2、0.31万hm 2、0.25万hm 2、0.1万hm 2，分别占全市种植总面积的43.1%、25.2%、20.3%、8.1%。
山药80%以鲜品销售，主要是特产店销售、连锁商超销售和网络销售，20%通过加工转化销售；怀地黄、怀牛膝和怀菊花主要以干品形式，通过药材市场销售。
初步形成了以温县的北冷乡、武德镇和武陟县的大封镇、西陶镇、大虹桥乡、北郭乡为代表的一批特色乡镇。
二、存在的问题（一）怀药标准化种植水平不高当下，在“公司+基地+合作社+农户”发展模式下，怀药标准化规模化种植水平有所提高，但还存在覆盖范围不广的情况，农户分散种植怀药的模式仍大量存在。
同时，对怀药种苗的研发滞后、投入不够，农户自留的怀药种苗种质退化、品质不高，严重影响产量和效益。
（二）土壤污染严重，无公害怀药种植受限土壤是药用植物的生长基础，是重要的生长环境条件，怀药种植基地的土壤应符合土壤质量二级标准。
但随着国内外市场对怀药需求量的增加，种植户为了增加怀药产量，过量使用化学农药、化学肥料，导致生产环境被人为干扰和破坏，造成了药用植物体内蓄积了大量有害于身体健康的物质，药用质量受到影响。
植物种质的超低温保存
在培养基中添加生长延缓剂能有效减缓材料的生长。
a.不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差 异 b.同一种抑制剂应用在不同植物中，要达到抑制 作用而不对植物造成伤害所需要的浓度也有所不 同。 c.在一种植物上有效地抑制剂在另一种植物上则 可能无效。
实验已经证明，利用多效唑可以使玉米、水稻、小麦和马铃 薯等的试管苗生长素率降低，同时移栽成活率提高。利用二 甲基氨基琥珀酰胺酸（B9）、矮壮素（CCC）可以使葡萄试 管苗的转管从3个月一次变为一年一次。如果将低温保存与 一些生长抑制剂配合使用，则效果更佳。
d.材料大小也有影响，太大影响预培养效果，冻 存易受冰晶伤害；太小则切取困难，而且增加切 取时对材料的伤害。 e.如果采用大田生长的植物的芽，最好选择在冬 季取材。因为夏季生长的芽都不耐寒，而经秋冬 季的低温锻炼后，植物体的抗冻能力提高，所以 动机去才有较高的存活率
10.2.2材料的预处理
预处理包括材料的预培养和低温预处理，目的是 减少系孢子油水的含量，使细胞经受低温锻炼， 以有效提高组织活细胞的抗冻能力。 •在冰冻保存前的预培养时常在培养基中加入一些 可以提高材料抗冻能力的物质，如山梨酸醇、脱 落酸、脯氨酸、和二甲基亚砜（DMSO）等，最 常用的方法是增加培培养基中蔗糖的浓度。
• （1）种子保存 目前常用的种质保存方法有以下几类： 特点：传统的种质资源保存的主要方式 种子保存占用空间少，保存期较长 易干燥、包装和运输 因此种子在低温下长期保存是防止良种衰变的一条重 要途径。 但是，随着储藏时间的延长，种子生活力逐渐下降， 而且易受病虫鼠害侵袭。 此外，这种方法对于无性繁殖的种类等不适用。
•
10.2.3.2保护剂预处理
配制保护剂时，应该将其溶解在培养基里， 或是溶解在有糖或无糖的水中。为防止对细 胞的渗透冲击，保护剂应在30~60min内逐 渐加入，如用甘油则加入速度需更慢。由于 DMSO有一定毒性，所以预处理应该在0℃ 左右的低温下进行。处理时间也不能过长， 一般不宜超过1h。
怀山药气候品质认证
怀山药气候品质认证作者：张新刚来源：《现代农业科技》2018年第20期摘要怀山药是焦作市主导产业，结合怀山药生产实例，探索怀山药气候品质认证技术，对合理利用气候资源、增强怀山药市场竞争力具有重要意义。
关键词怀山药；气候；品质认证中图分类号 S162；S632.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）20-0097-01农产品气候品质认证主要是评定气候条件对农产品品质优劣等级的影响，并结合气候与农产品品质的关系，通过采集数据、实地调查、试验对比等技术手段，设置气候条件指标，建立认证模式，确定气候品质等级。
本文以焦作市怀山药为研究对象，构建怀山药气候品质评价指标体系，开展农产品气候品质评价，给怀山药贴上“气候品质”标识，链条式服务于生产。
1 气象资料来源研究资料为怀山药生育期观测资料和认证区域怀山药生长发育分布情况调查、气象观测资料。
选取焦作市气象观测站、示范园区1981—2010年平均气温、降水量、日照时数和相对湿度资料。
2 结果与分析2.1 认证作物生长特性怀山药喜温暖、耐高温、适应性较强，一般在年均气温10～15 ℃，且≥10 ℃积温在4 450 ℃以上的地区生长，最适宜生长温度20～30 ℃，若外界气温40 ℃均会造成生长发育受阻。
怀山药怕涝、耐旱，最适宜生长区年降水量500～700 mm，土壤湿度过大易造成烂根、烂茎，适宜相对湿度60%～70%。
怀山药属短日照植物，可在年均日照时数为1 300～1 600 h的地区生长，日照时数>6 h生长良好，适宜种植在海拔600～1 000 m的丘陵、排灌方便且避风向阳的田块或缓坡上[1-2]。
2.2 认证作物生育期分析怀山药生长发育经过幼苗期（从发芽、出苗至展叶，4月初至5月中旬）、盘根期（从展叶至现蕾，5月上中旬至6月中下旬）、根茎膨大期（从现蕾至根茎基本停止生长，7月上中旬至9月上中旬）、成熟期（10月底）、休眠期（地上部枯萎至翌年发芽）[3-4]。
淮山药种质资源收集鉴定及品种改良
淮山药种质资源收集鉴定及品种改良汤洁;戴兴临;涂玉琴;涂伟凤;王丽钦;张弢;张南峰【摘要】针对江西淮山药生产上品种结构较单一、品种退化严重、抗病和抗旱性较差、产量较低和品质差等问题，开展了种质、品种资源收集鉴定及改良利用研究，期望为这些鉴定资源和引进品种在江西生产上推广应用提供科学依据，以更好地满足人们对淮山药产品的消费需求，促进江西淮山药产业的发展。
%Aiming at several problems in the production of common yam rhizome in Jiangxi , such as relatively single variety structure, seriously degraded varieties, weak disease and drought resistance, low yield and poor quality, the author carried out the research on the collection, identification, improvement and utilization of yam germplasm and variety resources , in order to provide scientific basis for the popularization and utilization of these identified resources and introduced varieties , and to promote thede-velopment of yam industry in Jiangxi .【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2016(028)010【总页数】4页(P15-18)【关键词】淮山药;种质资源;收集鉴定;改良利用【作者】汤洁;戴兴临;涂玉琴;涂伟凤;王丽钦;张弢;张南峰【作者单位】江西省农业科学院作物研究所，江西南昌 330200;江西省农业科学院作物研究所，江西南昌 330200;江西省农业科学院作物研究所，江西南昌330200;江西省农业科学院，江西南昌 330200;江西省农业科学院，江西南昌330200;江西省农业科学院作物研究所，江西南昌 330200;江西省农业科学院作物研究所，江西南昌 330200【正文语种】中文【中图分类】S632.1淮山药为薯蓣科薯蓣属作物，为广布于热带和亚热带地区的一年生或多年生缠绕性藤本植物[1]，大多具有可食用的地下块茎，因生长区域不同而别名有所区分，有山薯(D. fordii Prain et Burk.，广东淮山)、褐苞薯蓣(D. persimilis Prmn et Burk.，广西淮山)、日本薯蓣(D. japonica Thunb.，土淮山)[2]。
山药种质资源整理研究
山药种质资源整理研究山药（Dioscorea opposita Thunb.）是一种古老的根茎作物，也是中医药学中常用的药材之一。
山药富含多种营养物质，如淀粉、蛋白质、维生素和矿物质，具有健脾益肺、滋阴养颜、补益气血等功效，被广泛用于食品、药物和保健品等领域。
山药作为一种重要的农作物，其种质资源的整理研究对于野生品种保护、良种选育和资源利用具有重要意义。
本文将就山药种质资源的分类和整理方法、种质资源的特点与利用价值以及种质资源的保护与利用举行探讨。
一、山药种质资源的分类和整理方法山药的种质资源主要包括野生种质和栽培种质两大类。
野生种质是指在自然环境下生长发育的山药植株，具有较强的适应性和遗传多样性。
栽培种质是指在人工条件下栽培的山药植株，具有高产性和良好的品质特点。
对山药种质资源进行分类的方法有多种，常见的包括遗传特征分类、形态特征分类和地理分布分类等。
遗传特征分类是根据山药植株的遗传变异程度进行分类，可以通过核酸序列分析、同工酶分析和RAPD等分子标记技术来确定山药的遗传多样性。
形态特征分类是根据山药植株的形态特征和农艺性状进行分类，可以通过田间观察和实验室测定来确定山药的品种特性。
地理分布分类是根据山药植株的地理分布情况进行分类，可以通过实地调查和文献资料的整理来确定山药的分布范围和区域差异。
整理山药种质资源的方法主要包括野外调查、采集标本、建立种质园和种子库等。
野外调查是指对山药种质资源的野外生长环境和分布情况进行实地调查，通过收集样本和记录相关数据来获取种质资源信息。
采集标本是指对山药植株进行采集和保存，通常采用干燥法、冷冻法和液态氮保存法等方法，以保持种质资源的完整性和可持续利用性。
建立种质园和种子库是指将采集到的山药种质资源进行繁殖和栽培，使其可以更好地保存和利用。
二、山药种质资源的特点与利用价值山药种质资源具有丰富的遗传变异和良好的适应性，是改良山药品种和培育新品种的重要基础。
野生种质资源在适应性和抗逆性方面具有优势，可以为山药的遗传改良和生态适应性研究提供重要的基因资源。
9 第九讲2 超低温保存技术
1.4 逐步冰冻法 此法是制备不同等级温度的冰浴如-20℃、50℃、-70℃、-100℃或-10℃、-15℃、-23℃、 -35℃、-40℃等使植物材料经保护剂在0℃预处 理后，逐渐适应这些温度，材料在每级温度上停 留一定时间(4～6min)，使细胞达到保护性脱水， 然后投入液氮中. 殷晓辉通过对几种野生稻愈伤组织冰冻保存 研究，得出的降温程序是：（1）0→-10℃速度 是1℃.min-1停留15min；（2）-10→-40℃速度 是1℃.min-1 ，停留60min；（3）-40→-196℃。
对于单细胞来说常规超低温保存中的胞外冰晶几乎是不具有伤害性的但对于整个器官或组织来说所谓的胞外冰晶仍然是在细胞的间隙中仍会对细胞产生伤现在玻璃化法冻存采取完全玻璃化法即胞内胞外同时为玻璃化状态在器官和组织水平保存
超低温保存技术
超低温保存 ： 概念：在液氮（LN）（-196℃）中使保存的生物 材料的物质代谢和生长活动几乎完全停止，而细胞活力 和形态发生的潜能仍保存。 这样有利于保存和抢救物种，尽可能避免组织细胞 培养及自然界中积累性突变等的发生，便于国际间的种 质交换。经过超低温保存后的再生植株，有可能产生高 抗寒性的新材料。 超低温保存正成为长期稳定地保存植物种质资源及 珍贵实验材料的一个重要方法。
2.2 包埋玻璃化法(encapsulationvitrification) 其基本操作程序：预培养和包埋→玻璃化溶 液脱水→液氮保存→化冻→恢复培养。 这种方法实质上是将包埋脱水法的包埋和玻 璃化法结合在一起，它减少了脱水的时间，简化 了冻存程序，且比包埋脱水法有更高的成芽率。 但是对某些植物而言，包埋玻璃化法不一定 是最适合的，这可能与基因型有关。辣根包埋玻 璃化法冻存3天后，成活率为60%，用包埋脱水法 保存成活率大于90%。
植物种质资源的离体保存
种质库要定期检查，保持清洁，及时清除污染材料，并注 意积累资料。
第三节 植物种质资源的超低温保存
超低温保存也叫冷冻保存，一般以液N2为冷源，使保存 温度维持在-196℃。
超低温保存1949年成功的应用于动物细胞的保存。20 世纪70年代以来，应用于植物材料保存，目前已经有不 少成功的例子。
自然保护区
◆非原生境保存（ex situ conservation）是指种质保存于该植物 原生态生长地以外的地方，包括异地保存（ 种质圃或植物园保存）、种质库（种子）保 存、离体（试管）保存等。
植物园
种质库
种质资源保存的意义
①保持生物多样性的需要 防止资源灭绝。
②植物育种工作的基础 节约人力、物力，便于交流。
离体种质保存的缺点：
①对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继 代培养。 ②易受微生物污染或发生人为差错。 ③多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料的分化 和再生能力的丧失。
超低温保存可在一定程度上避免这些问题。
种质资源 离体保存
常温限制 生长保存
低温保存
超低温保存
第一节 植物种质资源的常温限制 生长保存
低温保存的基本特征是保存材料的定期继代培养，不断繁 殖更新；基本措施是控制保存材料所处的温度和光照。一 般，5—10℃适宜保存温带起源植物的试管苗，15— 18℃可用于热带植物试管苗的保存。除了温度的控制之 外，适当缩短光照时间，降低光照强度，也能减缓材料的 生长速度，延长保存时间。延缓保存材料生长速度的另一 项措施是改变培养基的成分。
保存原理：
低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结 构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物材料 在超低温条件下之所以可以长期保存并能在离开保存环境 后正常进行细胞分裂和分化就是在冰冻过程中避免了细胞 内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰 而达到植物材料保存目的。 植物细胞含水量大，冰冻保存难度大，投放液N2中 易引起组织和细胞死亡，故须借助于冷冻防护剂，防止细 胞冰冻或解冻时引起过度脱水而遭到破坏，保护细胞。
怀黄菊微滴玻璃化超低温保存再生植株的生理和同工酶分析
怀黄菊微滴玻璃化超低温保存再生植株的生理和同工酶分析赵喜亭;蒋丽微;宋萍萍;朱玉婷;田莹;张文芳;李明军【摘要】为了验证前期建立的微滴玻璃化法超低温保存技术是怀黄菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.‘Huaihuang’)种质资源保存的一种有效方法,对微滴玻璃化法超低温保存后怀黄菊再生植株叶片的膜脂过氧化相关指标及过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)同工酶进行了分析.结果表明:与常温保存植株相比,供试怀黄菊再生植株叶片的相对电导率、超氧阴离子(O2.-)和丙二醛(MDA)含量均显著降低,保护酶系统除了POD活性稍有增强外,SOD、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性均显著增强;保存后再生植株叶片中SOD和POD同工酶的条带数目没有改变,但有些谱带的亮度增强.研究结果不仅从生理水平验证了怀黄菊经微滴玻璃化超低温保存后的再生植株增强了抗膜脂过氧化的能力,而且从POD、SOD同工酶水平验证了其遗传稳定性的保持,从而说明微滴玻璃化法超低温保存技术是保存怀黄菊种质资源的理想方法.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2016(045)005【总页数】5页(P111-114,120)【关键词】怀黄菊;微滴玻璃化;超低温保存;膜脂过氧化;同工酶;遗传稳定性【作者】赵喜亭;蒋丽微;宋萍萍;朱玉婷;田莹;张文芳;李明军【作者单位】河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心,河南新乡453007;绿色药材生物技术河南省工程实验室,河南新乡453007;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心,河南新乡453007;绿色药材生物技术河南省工程实验室,河南新乡453007【正文语种】中文【中图分类】S682.1+1怀黄菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.‘Huaihuang’)是怀菊花中的主栽优良品种，系菊科多年生宿根性草本植物，主产于河南省的武陟、温县等地(古怀庆府所辖)，是我国著名的“四大怀药”之一，具有清热、明目、疏风、解毒之功效[1]。
焦作市山药种质资源及开发利用研究
焦作市山药种质资源及开发利用研究权玉萍;郑东方;王育水;辛泽华;姬生栋【摘要】怀山药为著名的“四大怀药”之首,又是药食同源之精品；焦作市具有悠久的种植山药历史,种质资源十分丰富.经过多年调查征集,已经收集了具有较好特性与经济性状的若干个山药本地品种和引进品种,开展了山药种质资源初步研究,阐述了山药化学成分的研究成果,总结了山药的药用价值、食用价值,分析了焦作市山药资源开发利用的现状,为焦作市山药产业加快良种快繁、种质资源保存与评价、种质资源创新与新品种选育、规范化种植等提供了技术保障,这对于焦作市区域经济发展具有重要指导意义.%As the head of famous "four major huai-medicine",Dioscorea opposite Thunb.was both high-quality food and medicine.Jiaozuo city has a long history of planting D.opposite,the germplasm resources were very rich.After many years of investigation and collection,several local and introducing D.opposite varieties with good properties had been collected.Investigation of D.opposite germplasm resources was preliminary carried out.The research progress of D.opposite chemical composition was described; meanwhile,the medicinal and edible value of D.opposite was summarized.The development and utilization situation of D.opposite in Jiaozuo city was analyzed to provide technological guarantee for speeding up the rapid propagation,germplasm preservation and evaluation,germplasm innovation and breeding of new varieties,standardized production of D.opposite,etc.,which had important directive significance for regional economic development in Jiaozuo city.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2013(052)002【总页数】6页(P368-373)【关键词】山药;种质资源;开发;利用;焦作市【作者】权玉萍;郑东方;王育水;辛泽华;姬生栋【作者单位】焦作师范高等专科学校,河南焦作454002;焦作师范高等专科学校,河南焦作454002;焦作师范高等专科学校,河南焦作454002;焦作师范高等专科学校,河南焦作454002;河南师范大学生命科学学院,河南新乡453002【正文语种】中文【中图分类】S632.1;S602.4;F303.4(613JZ)山药又名薯蓣（Dioscorea opposita Thunb.），为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea L.）藤本植物［1，2］。
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脱水 ：用玻璃化保护剂(30% Gly+15%乙二醇 (EG)+10% DMSO+15%聚乙二醇(PEG)+0.4 mol·L–1Suc)在0°C下脱水60分钟。 冷冻保存 ：每10个处理过的包埋珠放入1个冻存 管中, 滴加新的玻璃化保护剂, 然后将冻存管迅速 置于液氮中保存24小时。
包埋玻璃化法
包埋玻璃化法是在玻璃化法和包埋脱水 法基础上发展起来的超低温保存植物种 质的新技术。它具有能同时处理大量材 料,处理后恢复生长快,对材料的毒害作 用较小及成芽率高等优点,已成功地用 于辣根、山嵛菜等20余种植物,在植物 种质资源的保存上显示出了巨大的应用 潜力
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包埋玻璃化法超低温保存基本操 作程序
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化冻温度对超低温保存的影响
从表3可以看出, 化冻温度显著影响超低温保存后 材料的成活率。随着化冻温度的提高, 冻存后材料 的成活率也有显著提高。其中化冻温度为40°C 时, 成活率达到最高值。低于或高于40°C时, 成 活率均下降。
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表4 不同基因型对怀山药带芽茎段包埋玻 璃化超低温保存的影响
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玻璃化法
玻璃化法是Luyet 于1937年提出的。20世纪80年代 中后期才在动植物的种质保存中取得了突破性进展。 Sakai 等于 1990 年建立了玻璃化冻存的简单高效的 技术体系：在材料冰冻之前用高浓度冰冻保护剂 (plant vitrifica-tion solution，PVS)处理，再投入196 ℃液氮，使脱水样品玻璃化而没有冰的产生。 此法具有设备简单，材料处理简单，效果和重演性 好等优点。 由于PVS 保护剂浓度很高，对材料毒害性极大，因 而需严格控制脱水过程及冰冻保护剂的渗透性。此 外，该法较难在同一时间内处理大量材料。
低温锻炼时间对包埋玻璃化超低温保存后 材料的成活率有重要影响，这可能于低温 锻炼提高了植物体内脯氨酸和多胺的含量 以及胞液的渗透势，从而增加了植物的抗 冻性。 装载时用较低浓度的玻璃化保护剂浸润细 胞, 可促进玻璃化保护剂的渗透效果, 并能 防止将细胞直接投入高浓度的玻璃化保护 剂时造成的渗透伤害。
Genotypes of Dioscorea opposita Survival rate (%) D. opposita ‘Tiegun’ 64.29 ± 9.52 aA D. opposita ‘Taigu’ 49.21 ± 3.86 abB D. opposita ‘Huaiqing No.1’ 13.11 ± 7.92 cD D. opposita ‘No.B’ 39.81 ± 9.71 bcC 不同小写字母表示差异显著(P<0.05); 不同大写字母表示差异 极显著(P<0.01)
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应用——怀山药种质资源的包埋 怀山药种质资源的包埋 应用 玻璃化超低温保存
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怀山药
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操作步骤：
材料选取 低温锻炼
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预培养
包埋 装载 脱水 冷冻保存 化冻洗涤
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恢复培养
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材料选取：供试材料为铁棍山药、太谷山药、怀 庆1号山药和B号山药4种基因型怀山药继代培养 60天的试管苗。 低温锻炼 ：怀山药试管苗于低温下分别炼苗0、3、 5、7、15和30天。 预培养： 在无菌条件下, 切取带芽茎段, 放入含 MS+0.1 mol·L–1蔗糖(Suc)+0.1 mol·L–1甘油(Gly) 培养基中, 低温下预培养3天。
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表2 不同装载液对怀山药带芽茎段包埋玻璃化超 低温保存的影响
The composition of loading solution Survival rate (%) MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L–1Gly 41.82 ± 4.69 bB MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L–1Gly+30 g·L–1Man 41.48 ± 2.25 bB MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L–1Gly+50 g·L–1 DMSO 54.75 ± 7.52 aA 不同小写字母表示差异显著(P<0.05); 不同大写字母表示差异 极显著(P<0.01)。Suc: 蔗糖; Gly: 甘油; Man: 甘露醇; DMSO:
预 培 养 和 包 埋 水 脱 液 存 溶 保 化 氮 冻 培 养 璃 液 化 复 玻 恢
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预培养
目的：提高植物抗冻能力及渗透忍耐力， 减少或避免冷冻伤害 预培养方式： 1、在添加高渗物质的培养基中预培养 将材料在含蔗糖(或山梨醇、脯氨酸、甘露醇、 海藻糖)等渗透剂的培养基(通常是用于培养 该材料的培养基)上， 常温条件下预培养数 日，以减少细胞内自由水含量，增强组织细 胞抗寒能力，增加其保护性物质含量。 2、 零上低温冷驯化 将小的试管苗置于 正常培养基上，在零上低温、黑暗条件下冷 驯化一段时间(3~5天)， 以形成保护性物质
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包埋 ：将材料切成2 mm左右的带芽茎段, 室温下 与含3%海藻酸钠和0.2 mol·L–1Suc的MS培养基 混合, 将混合液滴入含有0.5 mol·L–1CaCl2和0.2 mol·L–1Suc的MS培养基中进行包埋, 获得球形包 埋珠。 每个包埋珠含1个材料。 装载： 将包埋珠分别放入3种不同的装载液中, 装 3 , 载液配比分别为MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L–1 Gly、MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L–1 Gly+30 g·L–1甘露醇(Man)和MS+0.2 mol·L–1 Suc+2 mol·L–1Gly+50 g·L–1二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)。于 化冻温度对怀山药带芽茎段包埋玻璃化超低 温保存的影响
Thawing temperature (°C) Survival rate (%) 37 6.93 ± 2.16 cC 39 31.31 ± 7.70 bB 40 48.41 ± 3.70 aA 42 4.41 ± 2.07 cC 不同小写字母表示差异显著(P<0.05); 不同大写字母表示差异 极显著(P<0.01)
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玻璃化溶液脱水
包埋后的材料投入高浓度冰冻保护剂中， 之后在冰浴条件下处理一定时间。 高浓度的冰冻保护剂(PVS)，又称玻璃化溶 液，可以降低冰点，提高玻璃化消失点， 增强溶液粘滞性，阻止冰晶生长，防止细 胞因脱水而瓦解。水与大分子的亲水位点 形成氢键，维持大分子物质的结构，能减 轻因冰晶形成而产生的电解质浓度增加造 成的伤害。
二甲基亚砜
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装载液对超低温保存的影响
从表2可以看出, 装载液成分显著影响保存材料的 成活率。用配比为MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L– 1Gly+50 g·L–1 DMSO的装载液装载, 成活率最高; 而用配比为MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L–1Gly和 MS+0.2 mol·L–1Suc+2 mol·L–1 Gly+30 g·L– 1Man的装载液装载, 成活率较低且效果相似。
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实验结果及分析
表1 低温锻炼时间对怀山药带芽茎段包埋玻璃 化超低温保存的影响
Cold-hardening time (d) 0 3 5 7 15 30 Survival rate (%) 0 ± 0 dC 4.35 ± 2.90 cC 31.59 ± 4.40 bB 52.17 ± 3.04 aA 50.57 ± 5.68 aA 49.28 ± 3.51 aA
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怀山药种质资源的包埋玻璃化 超低温保存与植株再生
成员：黄涛、刘林飞、吕翼、鲁文斌、江志霞、 卢燏瑾、毛贤兰、倪静婷、廖银香、欧阳厚婷
学习内容
超低温保存
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重点理解：包埋玻璃化法
植株再生
应用——怀山药种质资源保存
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超低温保存
超低温保存是指在－ 80℃以下的超低温中 保存种质资源的一整 套生物学技术，通常 也称为液氮保存。 。 在液氮中几乎所有的 细胞代谢活动、生长 都停止了，因而排除 了遗传的性状的变异， 同时保存了细胞的活 力和形态发生潜能。
不同小写字母表示差异显著(P<0.05); 不同大写字母表示差异 极显著(P<0.01)
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低温锻炼时间对超低温保存的影响
从表1可以看出, 经过一定时间的低温锻炼, 成活 率有显著提高。低温锻炼时间较短时, 随着低温锻 炼时间的延长, 成活率逐渐增高。低温锻炼时间为 7天时, 成活率达到最大值。超过7天, 成活率基本 保持不变, 虽稍有下降, 但未达到显著水平。可见, 适当的低温锻炼有利于提高超低温保存后材料的 成活率。
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化冻洗涤 ：从液氮中取出冻存管, 分别放入温度 为37°C、38°C、40°C和42°C的水浴中化冻, 化冻时间为1–3分钟。解冻后, 用含0.5 mol·L– 1Suc的洗涤液洗涤包埋珠2次, 每次洗涤10分钟。 恢复培养 ：将包埋珠转入再生培养基(MS+ 2 mg·L–1 KT + 0.02 mg·L–1 NAA)中, 先暗培养14 天, 再转到光下培养。 培养温度为(25±2)°C, 光 照时间为每天14小时。 记录成活率及恢复生长的 时间。 成活率=(包埋玻璃化超低温保存后成活的 茎段数)/(保存的总茎段数)× 100%。