实验：非发酵菌的鉴定
非发酵菌的测定实验报告
一、实验目的1. 掌握非发酵菌的基本概念及分类；2. 熟悉非发酵菌的鉴定方法；3. 提高实验室操作技能，培养科学思维和严谨的工作态度。
二、实验原理非发酵菌是一类不发酵或不分解糖类的革兰氏阴性杆菌，主要包括假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属等。
非发酵菌的鉴定主要通过观察菌落特征、进行生化试验、动力与鞭毛观察等手段。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）非发酵菌菌种：假单胞菌、不动杆菌、产碱杆菌、莫拉菌、黄杆菌等；（2）培养基：普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、动力半固体培养基、氧化酶试验培养基等；（3）试剂：葡萄糖、乳糖、酵母提取物、酚红指示剂、氧化酶试剂等；（4）实验仪器：恒温培养箱、显微镜、酒精灯、无菌操作台等。
2. 实验仪器：（1）显微镜：用于观察菌落特征；（2）恒温培养箱：用于培养菌种；（3）酒精灯：用于无菌操作；（4）无菌操作台：用于无菌操作。
四、实验方法与步骤1. 菌落观察（1）将菌种接种于普通琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，分别于30℃、37℃培养24小时；（2）观察菌落特征，如菌落大小、形状、颜色、边缘、表面、透明度等；（3）记录观察结果。
2. 动力与鞭毛观察（1）将菌种接种于动力半固体培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种在半固体培养基中的生长情况，如是否有鞭毛、菌落是否呈指状、螺旋状等；（3）记录观察结果。
3. 氧化酶试验（1）将菌种接种于氧化酶试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生氧化酶，即菌落周围是否出现绿色；（3）记录观察结果。
4. 氧化-发酵（O/F）试验（1）将菌种接种于氧化-发酵试验培养基，30℃培养24小时；（2）观察菌种是否产生酸，即菌落周围是否出现红色；（3）记录观察结果。
5. 麦康凯琼脂平板生长情况（1）将菌种接种于麦康凯琼脂平板，30℃培养24小时；（2）观察菌种在麦康凯琼脂平板上的生长情况，如是否生长、生长速度等；（3）记录观察结果。
非发酵革兰阴性杆菌的检验 微生物实验
1、贝多芬的童年尽管如是悲惨，他对这个时代和消磨这时代的地方，永远保持着一种温柔而凄凉的回忆。
2、社会永远处在这两条路的中间：真理或爱。
它通常的解决，往往是把真理和爱两者一齐牺牲了。
3、脸上的肌肉突然隆起，血管膨胀、犷野的眼睛变得倍加可怕；嘴巴发抖；仿佛一个魔术家召来了妖魔而反被妖魔制服一般。
4、我的信仰使人厌恶或阻碍别人，这是可能的。
但要更改它却不在我能力范围以内，好似我不能改变我的**一样。
我除了我所相信的以外不能相信别的，尤其在这个我将回到神那边去的时候。
5、也许是他作品中最深刻的，仿佛用血泪写成的，结果是一文都不曾拿到。
把贝多芬煎熬完的是，日常的窘况，无穷尽的讼案：或是要人家履行津贴的诺言，或是为争取侄儿的监护权，因为他的兄弟卡尔于一八一五年死于肺病，遗下一个儿子。
6、我称为英雄的，并非以思想强力称雄的人，而只是靠心灵而伟大的人。
7、没有伟大的人格，就没有伟大的人，甚至也没有伟大的艺术家，伟大的行动者；所有的只是些空虚的偶像，匹配下贱的群众的；时间会把他们一齐摧毁。
成败又有什么相干？主要是成为伟大，而非显得伟大。
8、宽大的鼻子又短又方，竟是狮子的相貌。
一张细腻的嘴巴，但下唇常有比上唇前突的倾向。
牙床结实得厉害，似乎可以磕破核桃。
左边的下巴有一个深陷的小窝，使他的脸显得古怪地不对称。
9、艺术家对于他的作品的爱是艺术的心灵。
没有爱便没有艺术作品。
10、在这些**的痛苦之上，再加另外一种痛苦。
韦格勒说他从没见过贝多芬不抱着一股剧烈的热情。
这些爱情似乎永远是非常纯洁的。
11、他甚至在一八二六年时在自己头上打了一枪。
然而他并不死，倒是贝多芬几乎因之送命：他为这件事情所受的难堪，永远无法摆脱。
12、贝多芬的心灵里多少有些清教徒气息；粗野的谈吐与思想，他是厌恶的：他对于爱情的神圣抱着毫无假借的观念。
13、竭力为善，爱自由甚于一切，即使为了王座，也永勿欺妄真理。
14、有时候，人生的现象与痛苦是那么悲惨，对于我们的爱是一种打击，那时，为了拯救这爱，拯救这信念，我们不得不把它超临人世之上，以致它有和人世脱离一切关系的危险。
非发酵菌特征及鉴定思路课件
微生物质谱分析
利用质谱技术对微生物细胞壁进行分 析，获取菌株的分子量信息，进行鉴 定。
03
非发酵菌的鉴定步骤
菌落形态观察
观察菌落大小、形状、边缘、表面和透明度
非发酵菌的菌落形态多样，大小、形状、边缘、表面和透明度等特征有助于初步 鉴别。
观察菌落颜色
非发酵菌的菌落颜色多样，包括白色、黄色、橙色、红色等，不同颜色可能代表 不同的菌种。
确的分类和鉴定。
分类依据
根据基因序列相似性、进化关系 等因素，将非发酵菌分为不同的 分类单元，如属、种、亚种等。
分类标准
根据国际微生物分类学界的共识 和标准，结合形态学、生理生化 特征和分子生物学数据，确定非
发酵菌的分类地位。
系统发育分析
方法
通过构建系统发育树，分析非发酵菌在进化过程 中的位置和亲缘关系。
数据来源
利用多基因序列分析、宏基因组学等方法，获取 非发酵菌的系统发育数据。
树形结构
根据系统发育数据，绘制出非发酵菌的系统发育 树，明确各菌种之间的亲缘关系和进化路径。
05
非发酵菌的致病性与临床意义
非发酵菌的感染途径与症状
感染途径
非发酵菌主要通过呼吸道、皮肤或接 触等途径感染人体。
症状表现
非发酵菌感染的症状多样，常见的有 发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难等，严 重时可导致败血症、感染性休克等。
生化试验
通过测定菌株对不同碳源、 氮源的利用以及在特定环 境下的生长情况，了解菌 株的生理生化特性。
血清学试验
利用特异性抗体与抗原的 结合反应，对菌株进行特 异性鉴定。
分子生物学鉴定方法
16S rRNA基因测序
通过对菌株16S rRNA基因的测序，进行系统发育学分析，确定菌 株在分类学上的位置。
非发酵菌群的分类鉴定
• 该菌的生长特性、营养要求、及其它生物 学性状与铜绿假单胞菌极为相似，所不同 的是氧化酶阴性，这是与假单胞菌属相区 别的重要特性；此外，该菌一端具有3根以 上丛鞭毛，运动活泼，可与氧化酶阴性的 不动杆菌属和副百日咳鲍特氏菌相鉴别。
3、鼻疽（类鼻疽）伯克霍尔德菌
• 鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia mallei） 和类鼻疽伯克霍尔德菌（ Burkholderia pseudomallei）是鼻疽与类鼻疽的病原菌， 属假单胞菌属rRNA同源群的第二群；2000 年被NCCLS/CLSI（National Committee
脑膜炎败血黄杆菌在血琼脂平板和营养琼脂平板上的菌落特征（37℃，18—24h）
• 黄杆菌属目前共分为8个种和4个未命名 的生物群。它们分别是：
• 脑膜炎败血黄杆菌、芳香黄杆菌、短小黄 杆菌、水田黄杆菌、嗜醇黄杆菌、嗜糖黄 杆菌、嗜温黄杆菌、薮内黄杆菌及黄杆菌 Ⅱb、Ⅱe、Ⅱh、Ⅱi群。其中脑膜炎败血 黄杆菌、芳香黄杆菌、短小黄杆菌和黄杆 菌Ⅱb群可引起人类疾病。
支气管腐败 鲍特氏菌
+ — + +
+ +
鲍特氏菌属
鞭毛染色
脂、巧克力色血琼脂及兔血琼脂上均不能生长。
副百日咳鲍特氏菌和支气管腐败鲍特氏菌营养 要求不高，在上述培养基上均能生长。
• 3、该菌属细菌不分解糖类。其它生化反应见 下表。
鉴别要点
鞭毛 动力 37℃
18—24℃ 尿素酶 硝酸盐还原 氧化酶
百日咳 鲍特氏菌
— — — — —
+
副百日咳 鲍特氏菌
—
— — + — —
铜绿假单胞菌镜下形态和在血平板上的菌落特征
铜绿假单胞菌在普通琼脂培养基上的菌落特征
不发酵菌的生化鉴定
一、精氨酸鸟氨酸赖氨酸（1）氨基酸脱羧酶试验原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱，使培养基中的溴甲酚紫指示剂变紫色。
加石蜡油是为了造成一个厌氧环境．因为只有在厌氧环境下生成的胺才稳定．（2）培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基（对照培养基不加氨基酸）。
（3）方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油（氨基酸类反应要与空气隔绝），于35℃培养1～4d，每日观察结果（4）结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。
阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。
对照管应为黄色。
若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。
（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。
志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴制法除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。
L－氨基酸按0.5%加入，DL－氨基酸按1%加入。
再行校正pH至6.8。
对照培养基不加氨基酸。
分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。
试验方法：从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36±1℃培养18～24h，观察结果。
氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。
二、枸橼酸盐利用试验(1)原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。
(2)方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35℃孵育1~4d，逐日观察结果。
(3)结果：若用溴麝香草酚兰（ph6.0以下黄色，ph7.6以上蓝色）指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落生长，培养基绿色为阴性。
非发酵菌的检验(实验)
成都医学院 临床微生物学教研室
目的
❖ 1.掌握非发酵菌的形态、染色性和菌落特征。 ❖ 2.熟悉非发酵菌的主要生化反应。
器材
❖ 接种环、酒精灯、显微镜等
试剂
❖ 革兰染液、氧化酶试剂、非发酵菌编码生化 鉴定管及相关试剂、生理盐水等
标本
❖ 1#标本和2#标本
操作
❖ 1.标本涂片染色镜检 ❖ 2.接种、培养 ❖ 3.生化试验 ❖ （1）氧化酶试验 ❖ （2）非发酵菌编码生化鉴定管
1组 O-F试验 厌需 氧氧
01
2组 氧枸 麦 化橼 芽 酶酸 糖
42 1
3组 精甘木 氨露糖 酸醇
421
4组
硝D乙酸N酰盐 还Fra bibliotekA 酶
胺 酶
原
421
非发酵菌群的分类鉴定
产碱杆菌属
莫拉氏菌属
无色杆菌属
土壤杆菌属
黄色素
.
+
13
—
黄杆菌属
莫拉氏菌属
假单胞菌属 产碱杆菌属
无色杆菌属 土壤杆菌属
鞭毛染色
端毛菌
周毛菌
假单胞菌属
产碱杆菌属，无色杆菌属，土壤杆菌属
O型
O/F —
无色杆菌属，土壤杆菌属
还原硝酸盐后产气
+
—
产碱杆菌属
土壤杆菌属
无色杆菌属
.
14
第四节、非发酵菌群的属内鉴别
支气管败血鲍特氏菌，金氏杆菌属，无色杆菌属，
莫拉氏菌属，艾肯氏菌属，土壤杆菌属。
触酶
+
—
假单胞菌属，产碱杆菌属，黄杆菌属，
金氏杆菌属，
支气管败血鲍特氏菌，无色杆菌属，
艾肯氏菌属
莫拉氏菌属，土壤杆菌属
O/F
动力
弱F
—
37℃
18—24 ℃
金氏杆菌属
艾肯氏菌属
—
+
—
+
+
—
支气管败血 假单胞菌属
黄杆菌属
鲍特氏菌
.
20
铜绿假单胞菌鉴别要点：
（1）、铜绿假单胞菌在普通琼脂培养基上能 产生水溶性绿色素，使整个培养基变为绿色。
（2）、在血平板上经35—37℃，18—24h培 养可表现为：菌落灰绿色、半透明、大而扁 平、表面湿润、边缘不齐；有金属光泽；有 生姜样芳香气味；菌落周围有宽大的兰绿色 透明溶血环。
.
5
因此在临床上真正能分离出来且 有临床意义的非发酵菌群有：
假单胞菌属、寡氧单胞菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、 鲍特氏菌属（百日咳鲍特氏菌除外）、金氏杆菌属、不 动杆菌属、无色杆菌属、莫拉氏菌属、艾肯氏菌属、土 壤杆菌属。
实验九：非发酵菌
• 思考题：鞭毛染色法的原理？
小结
非发酵菌的鉴定要点，尤其是铜绿假单胞菌的鉴定。 1、培养特点及菌落特征：在普通琼脂平板上产生特征性的 蓝绿色水溶性绿脓素和黄绿色青脓素，血平板上形成大而 扁平，湿润，边缘不齐，有金属光泽，有生姜气味的灰绿 色菌落，并形成透明溶血环 最适生长温度35℃，4℃不生长，42℃可生长 2、95%以上的铜绿假单胞菌可通过观察以下几个特征而得 到鉴定： • 氧化酶阳性（10秒内）。 • 菌落较大，生姜样气味。 • 绿脓素产生。 • 少数铜绿假单胞菌可产生其他颜色色素，如红脓素（红 色），黑脓素（棕色到黑色），青脓素（黄色）。
非发酵菌生化编码鉴定管
• 原理：该系列鉴定共有9种生化培养基，共10项试验，参 照下述方法，将试验结果换算成4位数字，加以数值化后 查表。 • 例：某一分离菌株，具有下列鉴定结果，数值化后为1734， 查表得知：可能为施氏假单胞菌和洋葱单胞菌，再按表中 要求做硝酸盐产气补充实验区分。 • 1组 2组 3组 4组 O-F 氧化酶4分 精氨酸4分 硝还4分 厌氧2分 枸橼酸2分 甘露醇2分 DNA酶2分 需氧1分 麦芽糖1分 木糖1分 乙酰胺1分 结果：需氧 + + + - + + + - 得分： 1 7 3 4
实验九：非发酵菌
实验目的
• 掌握非发酵菌的基本特征和鉴定程序 • 掌握非发酵菌分类的鉴别试验
不发酵革兰阴性杆菌
• 假单胞菌属：铜绿假单胞菌 • 不动杆菌属：硝酸盐不动杆菌 • 产碱杆菌属：粪产碱杆菌
不发酵革兰阴性杆菌鉴定程序
• 见检验程序
实验内容
• 一、ＧＳ、氧化酶试验 • 二、接种非发酵菌生化编码鉴定管 • 三、鞭毛染色
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不动杆菌属主要菌种间的鉴别
醋酸钙 葡萄糖氧化 木糖氧化 乳糖氧化 精氨酸双水解酶 + － ＋ ＋ 鲍曼 + ＋ ＋ ＋ 溶血 琼氏 约翰逊 洛菲 － － ＋ －/＋ － － ＋ － +/－ － +/－ － － ＋ ＋ ＋
鸟氨酸脱羧酶
枸椽酸盐利用 明胶液化 生长温度: 37℃ 41℃ 42℃
实验：非发酵菌的鉴定
实验目的
1.掌握常见非发酵菌的形态、染色特性、生 化反应及鉴定依据； 2.熟悉常见的几种非发酵菌的鉴定程序及鉴 别方法。
器材和试剂
1.菌种：假单胞菌属细菌、不动杆菌属细菌 和窄食单胞菌属细菌； 2.鉴定试验：双糖管，葡萄糖OF管，枸椽 酸盐琼脂，尿素，鸟氨酸、精氨酸、赖氨 酸，明胶、七叶苷，DNA酶，硝酸盐，木 糖，乳糖，蔗糖。
方法：
1.形态观察； 2.菌落观察； 3.生化反应。
常见非发酵菌的鉴定依据
1.铜绿假单胞菌：
＋ ＋ ＋ － ＋/－ 97 97 98 0 85
单端鞭毛（三根以下） 动 力 氧化分解（O-F培养基） 葡萄糖 乳糖、蔗糖 木 糖
氧化酶
赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶
＋
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100
0 99
鸟氨酸脱羧酶
＋
＋ － ＋ － －
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＋ － ＋ ＋ ＋
－
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－ － － －
－
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嗜麦芽窄食单胞菌
氧化酶 动力 明胶 42ﾟC 七叶苷 赖氨酸 – + + +/+ +
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