PCR法扩增钙激活酶激活蛋白cDNA
三种PCR技术
反义PCR的高敏感性： Noguchi用MVCI(多形上皮 粘蛋白的核心蛋白)作标志物,检测了15例乳腺癌的50 个腋窝淋巴结。免疫组化方法显示有9个淋巴结转移, 反义PCR也显示阳性。其余41个免疫组化检测阴性的 淋巴结中,有6个反义PCR法检测阳性。 反义PCR的特异性：Wang等用酪氨酸酶做标志物，检 测了29例处于Ⅰ期、Ⅱ期的恶性黑色素肿瘤患者，结 果显示病理学检测有11例淋巴结转移；反义PCR检 测则有19例淋巴结转移，其中包括病理检测的11例 阳性，既假阳性概率为0。 反义PCR要注意的问题：总RNA提取时,应防止RNA酶降 解RNA;防止样品，交叉污染;防止体细胞DNA混入样品。
反义PCR技术（RT-PCR）
RT-PCR：脱胎于经 典PCR技术,将有特 定基因序列mRNA表 达的组织中的总RNA 提取后,通过逆转录 酶作用,以mRNA为模 板反向合成cDNA,再 利用PCR技术将特定 序列进行扩增,最后 利用琼脂糖凝胶电 泳将扩增片段检出。 其逆转录引物与PCR 引物有共用性。
RNA提取：Trizol试剂方法提总RNA EV71和Cox.A16的鉴别诊断 RT-PCR
EV71肠道病毒VP1区全基因核苷酸序列扩增
DNA序列测定和分析
Trizol试剂方法提总RNA
取200μl反复冻融3次的病毒细胞培养液,加入 1ml Trizol提取液,混匀后室温放置20min,加200μl 氯仿,混匀,室温静置10min,4℃13000r/min离心10min; 转移上层水相到新的离心管中,并加入500μl异丙醇, 室温沉淀10min,4℃13000r/min离心10min;弃上清,沉 淀用75%乙醇洗2遍,室温干燥,加20μl纯水溶解 RNA,2μl RNA酶抑制剂(RNAsin)。提取的RNA立即进 行逆转录,或置-70℃保存备用。
钙蛋白酶系统研究进展_梅承君
钙蛋白酶系统研究进展梅承君1,庞辉2,康相涛1*,孙桂荣1(1.河南农业大学,河南郑州450000;2.河南省公安厅,河南郑州450000)摘要阐述了钙蛋白酶系统的分类、结构,并且综述钙蛋白酶系统的一般生物学功能及影响因素。
关键词钙蛋白酶;钙蛋白酶抑制蛋白;钙蛋白酶激活蛋白;嫩度中图分类号Q55文献标识码A文章编号0517-6611(2006)22-5774-03Research Adva nce in C alpain SystemMEI C heng-jun et al(Hen an Agricul tu ral University,Zhen gzh ou,Henan450000)Abstract This paper revie wed th e classi ficati on and structu re of cal pain sys tem,the general biological function and its affecting factors. Key w ords C alp ain;Cal pas tatin;Calpain activator;Tenderness钙蛋白酶是1964年由Guroff首次发现,1972年Bush等首先在骨骼肌中确认,1976年Da yton等对其进行纯化。
钙蛋白酶被鉴定、纯化后,其名称有钙活化中性蛋白酶(Calcium a ctiva te d ne utra l prote ase,Calcium ac tiva ted ne utral SH prote ase, c alpain)简写为CANP(EC,3,4,22,17)、钙激活酶(Ca2+-a ctiva t-ed enzy me)、钙激活中性蛋白酶(Calcium a ctiv ate d ne utral pro-te ase)等。
1983年Go ll等提出钙蛋白酶在骨骼肌肌丝蛋白降解过程中起关键作用[1]。
人乳铁蛋白cDNA基因的克隆
人乳铁蛋白cDNA基因的克隆嵇雅茹;王雅楠;张宏波;张学明【摘要】目的:克隆人乳铁蛋白cDNA基因,进而为重组人乳铁蛋白的制备奠定基础.方法:从人静脉血中性粒细胞中提取得总RNA,RT-PCR法扩增人乳铁蛋白cDNA基因后,将其插入到克隆载体pJET1.2,DNA测序法鉴定基因序列.结果:从人静脉血中性粒细胞中分离获得了总RNA,RT-PCR法克隆了人乳铁蛋白cDNA基因,经过DNA测序分析鉴定,其结果与GeneBank中序列完全一致.结论:成功从人静脉血中性粒细胞中克隆扩增了人乳铁蛋白cDNA基因,为重组人乳铁蛋白的制备奠定基础.【期刊名称】《包头医学院学报》【年(卷),期】2018(034)003【总页数】3页(P114-116)【关键词】人乳铁蛋白基因;反转录;PCR技术【作者】嵇雅茹;王雅楠;张宏波;张学明【作者单位】内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古包头014060;内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古包头014060;内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古包头014060;内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古包头014060【正文语种】中文乳铁蛋白(lactoferrin,LF)为铁离子结合糖蛋白，是转铁蛋白(transferrin,TF)家族的成员之一，在乳汁中含量较高[1]，1960年从人乳汁中成功分离出此蛋白[2]。
除乳汁外，乳铁蛋白也存在于血液﹑眼泪、胆汁、唾液等[3-5]。
人乳铁蛋白基因位于人的第3号染色体q21～q23的位置，全长约35 kb，共有17个外显子，内含子的大小不等，在300 bp～3.3 kb之间[6]，人乳铁蛋白编码区长为2136 bp，成熟的人乳铁蛋白由692个氨基酸组成，分子量约为80 kDa[7]。
人乳铁蛋白理化性质独特，具有抗氧化[8]、抗病毒[9-10]、抗癌[11]、广谱抑菌[12]、免疫调节[13]等诸多生物学功能。
利用人乳铁蛋白的抗氧化能力，添加在各种肉馅饼和其他肉类产品中延长食物的保质期，是很好的化学防腐剂替代品；乳铁蛋白广谱抑菌﹑参与免疫调节作用，目前在一些国家用于婴儿的配方奶粉，且无不利影响的记录，1986年日本第1次出现含有乳铁蛋白的婴儿配方奶粉。
钙激活氯通道蛋白TMEM16A在小鼠心肌组织的表达
cDNA全场扩增
RACE的应用
三、RACE可用于克隆同源基因的同源 片段，为寻找同源基因提供了一种手段。 总之,随着RACE技术的不断改进和完 善,优化PCR扩增的条件以提高扩增的效率 和忠实性，RACE技术必将在基因克隆以及 基因家族和基因表达变化等研究中发挥极 大的作用。
RACE的基本概念
cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分 cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为 Frohman在1985年首次报道。
3’RACE 和5’RACE
常用的RACE试剂盒
Oligo capping 法
碱性磷酸酶
烟草酸性焦 磷酸酶
Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东 京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。 目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）
Ambion（FirstChoice® RLM-RACE Kit） Invitrogen（GeneRacerTM Kit） TaKaRa（3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 and 5’Full RACE kit ） Clontech（SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit）
引物设计
可以根据数据库中已有数据设计特异性引物或基因不同物种 中的保守结构域设计兼并引物 一般引物的长度为18-30bp，常用的长度为20-24bp，过长或 过短都不合适。 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反 应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所对应模板序列的Tm值最好在50-70℃之间，当然由于 模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据 具体情况灵活运用。
(完整版)现代分子生物学试题答案
1． SD序列：开端密码子AUG上游 5-10 个核苷酸处，有一段可与核糖体16S rRNA 配对联合的、富含嘌呤的3-9 个核苷酸的共同序列，一般为AGGA(也有说是AGGAGG)，此序列称SD 序列 (Shine-Dalgarno sequence)2．顺式作用元件： cis-acting element 是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活性只影响与其自己同处于一个DNA 分子上的基因3．核小体 nucleosome 构成真核染色质的一种重复珠状构造，是由大概200 bp 的 DNA 区段和多个组蛋白构成的大分子复合体。
此中大概146 bp 的 DNA 区段与八聚体 (H2A、H2B、H3 和 H4 各两分子 )的组蛋白构成核小体的中心颗粒，中心颗粒间经过一个组蛋白H1 的连结区DNA 相互相连。
基因产生一条多肽链或功能RNA 所必要的所有核苷酸序列。
冈崎片段 Okazaki fragment在DNA不连续复制过程中，沿着后随链的模板链合成的新DNA片段，模板链 DNA 双链中其序列与编码链或信使核糖核酸互补的那条链。
在DNA复制或转录过程中，作为模板指导新核苷酸链合成的亲代核苷酸链。
基因家族真核生物的基因组中有好多根源同样、构造相像、功能有关的基因，将这些基因称为基因家族蛋白质内含子其 DNA序列与外显子一同转录和翻译，产生一条多肽链，而后从肽链中切除与内含子对应的aa 序列，再把与外显子对应的氨基酸序列连结起来，成为有功能的蛋白质。
翻译内含子mRNA中存在与内含子对应的核苷酸序列，在翻译过程中这一序列被“跳跃”过去，所以产生的多肽链不含有内含子对应的氨基酸序列Northern blot过电泳的方法将不一样的RNA 分子依照其分子量大小加以划分，而后经过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段Sorthern blot蛋白激酶 C protein kinase 丝氨酸 / 苏氨酸激酶的家族成员。
分子生物学课后习题答案终结版
第7章、基因操作1.PCR过程中的DNA模板变性、模板与引物退火、引物延伸3步的温度设置一般大致是多少？要考虑的主要因素是什么？DNA模板变性(denature)：95℃左右高温使模板DNA完全变性。
单链DNA模板与引物退火(annealing)：55℃左右引物与模板形成复合物的几率>>DNA分子自身的复性。
引物的延伸(extension)：72℃左右耐热DNA聚合酶在最适温度下催化DNA合成反应。
2.衡量PCR好坏的参数主要有哪些？一般来说好的结果如何体现？特异性Specificity:最好只有目的DNA带。
真实性Fidelity:DNA序列正确。
产量Quantity:DNA带明亮。
3. 以TaqMan技术为例，简述实时荧光PCR的原理。
PCR扩增时，Taq酶的5’- 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号；每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
4. 用于核酸探针标记的32P ATP有几种，DNA切口平移标记法、随机引物标记法和5′末端标记分别应该用哪种？为什么？2种：r-32P ATP、a-32P A TP(1) DNA切口平移标记法：[α-32P]-dCTP(2) DNA随机引物标记法：[α-32P]-dCTP(3) DNA的5’末端标记法：[γ-32P]-ATP(4) DNA的3’末端标记法: [α-32P]-dCTP32P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度极高；特异性极高；对各种酶促反应无任何影响,也不会影响碱基配对的特异性与稳定性和杂交性质。
5. 简述采用Biotin标记探针进行North-South杂交原理和操作流程。
①DNA电泳,转膜，紫外交联固定②洗膜封闭(地高辛标记)③杂交：生物素标记的探针与靶DNA结合③杂交：Dig标记的探针与靶DNA结合④HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合④HRP/AP标记抗体与Dig结合⑤底物在HRP催化下,反应发光⑤底物与抗体-HRP/AP反应, 显色或发光6.简述蛋白质印迹技术Western Blotting间接法操作流程。
基因工程中目的基因的检测pcr法
基因工程中目的基因的检测pcr法基因工程中目的基因的检测PCR法在现代生物技术领域，基因工程扮演着至关重要的角色。
它涉及到对生物体的基因进行精确的修改和调控，以实现特定的科学或商业目标。
在基因工程的过程中，检测目的基因的存在和表达是至关重要的一步。
聚合酶链反应（PCR）作为一种高效、灵敏的基因检测技术，已被广泛应用于这一领域。
PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶在特定条件下，对目标DNA 序列进行指数级扩增。
这一过程涉及到几个关键步骤：变性、退火和延伸。
通过高温将双链DNA变性为单链，然后通过降温使引物与目标序列特异性结合，在适宜的温度下，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链。
通过这一系列的循环，目标DNA序列得以在短时间内大量复制，从而便于检测和分析。
在基因工程中，PCR技术被用于多种目的。
它可以用于验证目的基因是否已成功导入宿主细胞。
通过设计特异性的引物，可以扩增出导入的基因片段，并通过凝胶电泳等方法进行检测。
PCR还可以用于检测目的基因的表达水平。
通过逆转录PCR（RTPCR）技术，可以将RNA转录为cDNA，然后通过PCR扩增，从而间接检测基因的表达量。
为了确保PCR检测的准确性和可靠性，必须严格控制实验条件。
引物的设计至关重要。
引物需要与目标序列完全匹配，并且具有适当的长度和GC含量，以确保高效性和特异性。
实验中的温度控制、试剂浓度和循环次数等参数也需要精确调控。
任何微小的偏差都可能导致结果的误判。
在应用PCR技术进行基因检测时，还需要考虑到可能存在的假阳性或假阴性结果。
假阳性通常是由于交叉污染或非特异性扩增引起的，而假阴性可能是由于模板量不足或扩增条件不适宜导致的。
因此，在实验设计中，应采取适当的对照和重复实验，以验证结果的可靠性。
随着PCR技术的不断发展，出现了许多基于PCR的衍生技术，如定量PCR（qPCR）、多重PCR和高通量PCR等。
这些技术不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还实现了对多个基因的同时检测，大大提高了实验效率。
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001963 J.S hanxi Agric .Un i v .学报收稿日期:2004-04-20 修回日期:2004-05-17作者简介:常 泓(1968-),女(汉),山西榆次人,副教授,博士,主要从事分子生物学及生物技术的研究。
基金项目:国家自然科学基金资助课题(30271003);山西省科技攻关项目(011030);山西省青年基金项目(20021038)文章编号:1671-8151(2005)01-0064-04PCR 法扩增钙激活酶激活蛋白c DNA常 泓1,南庆贤2,岳文斌3(1.山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801; 2.中国农业大学食品学院,北京100094;3.山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801)摘 要:钙激活酶激活蛋白是钙激活酶的激活蛋白,可以促进钙激活酶活性的发挥,从而促进肉的嫩化。
采用PCR 技术,以山羊肝脏cDNA 为模板经扩增得到钙激活酶激活蛋白(ca l pa i n activator)基因,并进行了序列测定。
该片段长1017bp ,5 端非翻译区长39bp ,3 端非翻译区长567bp 。
编码区长411bp ,编码一个长137个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子量为14298D a 。
与Edon M e llon i 等(1998)报道的从牛脑中提取纯化的钙激活酶激活蛋白的氨基酸序列相比发现,二者仅有五个位点不同。
关键词:钙激活酶激活蛋白;cDNA 文库;聚合酶链式反应中图分类号:S81 文献标识码:AAm plificati o n of C al p ain A ctivat or c DNA usi n g PCR CHANG Hong et a.l(C olle ge of L i f e S cience ,Shanx i Agr icultural Universit y,T ai gu Shanx i 030801,China )Abstract :T he c DNA o f ca l pa i n activator ,a prote i n that can ac tivate calpa i n ,w as a m plified by po l ym erase chain reacti on(PCR )w it h te m plate of cDNA of goat li ve r .T he a mp lified frag m ent w as c l oned and sequenced .The c DNA,cons i sti ng o f 1017bp ,had a 5 un translated reg ion of 39bp and 3 untranslated reg i on o f 567bp .The cod i ng reg i on w as 411bp i n s i ze and encoded a pepti de o f 137a m i no ac i d resi dues w ith a theoretical m olecu lar m ass o f 14298D a .Compar i ng w ith t he resu lt o f Edon M ell on i e t .al (1998),there w ere fi ve d ifferen t site o f a m i no acid .K ey word s :Ca l pa i n acti va t o r ;c DNA library ;PCR最新的研究表明,钙激活酶激活蛋白(cal pa i n activator )[1]是钙激活酶(calpa i n EC 3 4 22 17)活性的主要调节者,对活体组织中钙激活酶活性的发挥起着主要的激活作用。
钙激活酶激活蛋白是钙激活酶系统中除钙激活酶抑制蛋白(cal p astati n )[2]外的另一个调节者,钙激活酶激活蛋白是钙激活酶系统的一个新成员。
钙激活酶系统是高度可调的、依赖于C a 2+的蛋白质水解酶系统,参与细胞内一系列变化。
[2~5]在活体肌肉组织中,钙激活酶是导致肌纤维蛋白降解的主要因素[2,4]。
试验研究还表明,钙激活酶同样是宰后肌肉成熟过程中肌原纤维降解的主要因素,直接关系到肉的嫩化程度,而嫩度是影响肉品质的关键因素[6]。
促进肉嫩化,提高肉的嫩度是畜牧业和食品工业面临的一个很重要的问题。
但是,活体组织中钙激活酶是如何被激活的一直是个迷,如何激活钙激活酶而促进肉嫩化更无法实现。
近年来,许多科学家分析[7],在钙激活酶系统中存在一个钙激活酶活性的直接调节者,它可以增强钙激活酶在生理条件下对Ca 2+的亲和性,促进C a 2+与钙激活酶在C a 2+结合位点结合,从而促进钙激活酶活性的发挥。
首次发现钙激活酶激活蛋白的是美国Texas 健康科学中心大学生理和药理系D e M arti n o 等人[1]。
1998年以来[8~10],意大利热那瓦大学生化研究所的Pontre m o li 和M ellon i 等人对钙激活酶激活蛋白的研究较多。
目前已知其氨基酸序列和c DNA 序列。
钙激活酶激活蛋白是一个分子量为30KD 的二聚体,对热稳定,可耐93!的高温,作用最适p H 为7 0~7 1。
其氨基酸顺序与山羊肝脏蛋白UK114几乎一样;与小鼠HR12蛋白很相似;与流感嗜血杆菌(H ae m oph il u s i n fl u enzae)和枯草芽孢杆菌(B ac illus subtillis)获得的Y J GF 和YABG 两种热稳定蛋白有很大的相似点[11]。
目前有关钙激活酶激活蛋白的研究正在兴起,但国内尚未见此类报道。
本研究根据GenBank 中UK 114的c DNA 序列克隆得到钙激活酶激活蛋白c DNA 序列,并进行了序列分析。
1 材料与方法1 1 材 料山羊肝脏购自河北省大厂县韦子庄村。
大肠杆菌BL 21(DE 3)宿主菌购自鼎国生物技术中心。
1 2 试 剂山羊肝脏c DNA 文库构建所用试剂盒:mR NA 的提取:Qu ick Prep TMM icro Purification K it 安发玛西亚生物技术公司(Am ersha m Phar m ac i aB iotech .)产品;cDNA 的合成:T i m e Saver TMc D NA synthesis k it 安发玛西亚生物技术公司(Am er sha m Phar m ac ia B iotech .)产品;噬菌体的包装及转染:Pr o m ega 公司Packagene La m da DNA packing syste m 。
DNA 的快速纯化/回收试剂盒:购自北京鼎国生物技术公司。
1 3 方 法1 3 1 山羊肝脏c DNA 文库的构建根据试剂盒说明,采用cDNA 的快速构建法。
1 3 2 山羊肝脏c DNA 文库 噬菌体DNA 的提取平板裂解法。
1 3 3 PCR 扩增calpai n acti v ator c DNA 序列引物1:5 gacca tggca tgtcg tcttt ggtca ga 3 ,引物2:5 gagga tccaa tctgc atgct atttc a tttc ca 3 。
PCR 反应体系:每个反应总体积50 L ,其中dd H 2O 37 L ,d NTP (10mM )1 L ,10∀buffer 5 L ,模板( 噬菌体)2 L ,引物1和引物2各2 L ,Taq pl u s 酶(2U / L)1 L ,各组分混匀后加50 L 石蜡油,在美国M J Research 公司PTC 200型PCR 仪上进行反应:94!预变性2m i n ;94!变性50Sec ,55!复性50Sec ,72! 延伸50Sec ,经35个循环,再72!延伸加时10m in 。
琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果:配制2%琼脂糖凝胶,取10 L 扩增产物电泳。
保持电流40mA 。
电泳结束后,用EB 染色15m in ,紫外灯下观察结果。
1 3 4 DNA 片段的回收根据c DNA 纯化/回收试剂盒进行1 3 5 PCR 产物与pGE M T 载体的连接T 载体DNA 的回收:(10 L 体系:T 载体5 L ,PCR 产物3 L,T 4DNA 连接酶1 L)4!过夜。
转化:-80!冻存感受态菌BL 21(DE3),溶化后取100 L,加入上述连接产物,冰浴放置30m in ,42!,90s ,加入500 LLB 培养基,37!振摇培养2小时,铺于IPTG LB 平板,两板均有白色菌落生长。
1 3 6序列测定应用Sanger 双脱氧核苷酸链终止,在AB I 377型全自动测序仪进行序列分析。
2 结果和讨论2 1 山羊肝脏c DNA 的建立该文库滴度为5 2∀106pf u /mL ,经推算得到的克隆数为1 3∀106,理论上可以从该文库中筛选到所要的目的基因。
2 2 钙激活酶激活蛋白c DNA 的PCR 扩增采用平板裂解法对所构建的山羊肝脏cDNA 文库中进行筛选,所得产物经纯化和回收后,设计引物1:5 gacca tggca tg tcg tcttt gg tca ga 3 和引物2:5 gagga tccaa tctgc atgct atttc atttc ca 3 进行PCR 基因扩增,所得片段为长约1kb 的产物,根据文献报道分析该产物即为所需的钙激活酶激活蛋白的基因序列(图1)。
1.DNA 标准2.PCR 产物3.对照1.M arker 2.PCR product 3.Negati ve control图1 钙激活酶激活蛋白编码区基因PCR 扩增图Fig .1 The PCR fragm ent o f ca l pain acti vato r genecod i ng reg ion652005 常 泓等:PCR 法扩增钙激活酶激活蛋白cDNA2 3 钙激活酶激活蛋白基因编码区序列分析对克隆到的约1kb DNA 片段进行了序列分析(图2),该片段长1017bp ,5 端非翻译区长39bp ,3 端非翻译区长567bp 。
TGA 位于第30个bp 处,起始密码子ATG 位于第40个bp 处。
紧接着ATG,是一个411bp 的阅读框,编码137个氨基酸,其理论分子量为14298D a 。
与Ir m aCo lo m o 等(1998)[11]报道的UK114的c DNA 序列相比二者在编码区仅有2个bp 不同,且此不同不影响其氨基酸的种类。
图2 钙激活酶激活蛋白编码区的核苷酸序列及氨基酸序列Fig .2The nucleoti de and deduced am ino ac i d sequence o f calpa i n activator3 结 论本研究应用PC R 法扩增了钙激活酶激活蛋白c DNA 片段,该片段长1017bp ,5 端非翻译区长39bp,3 端非翻译区长567bp 。