农杆菌转化
1农杆菌转化法的原理是
1农杆菌转化法的原理是农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）转化法是一种重要的基因转化技术，广泛应用于植物基因工程研究和农业生产中。
其原理基于农杆菌与植物细胞间的相互作用，利用农杆菌外源DNA（T-DNA）的引导作用将目标基因嵌入到植物细胞的染色体中。
农杆菌转化法的主要步骤包括农杆菌培养、感染、共培养和筛选。
具体来说，其原理可分为农杆菌感染、T-DNA引导、T-DNA拼接和植物细胞接受等几个阶段。
首先，农杆菌感染是农杆菌与植物细胞发生接触的过程。
农杆菌通过外源的感染素（vir蛋白）介导，诱导植物细胞在感染部位生长出肿瘤组织，为转化提供了良好的环境。
感染素能够识别并结合到植物细胞的切伤部位，进而形成感染结构。
接着，T-DNA引导是农杆菌T-DNA（转座子DNA）与植物细胞染色体DNA 之间的互作过程。
农杆菌T-DNA原先位于质粒中，通过T-DNA上的边缘重复序列（LB和RB）以及其中的转移基因（transgenes）引导将T-DNA插入到植物细胞染色体中。
T-DNA在感染素作用下从质粒中剪切出来，再与植物细胞的染色体DNA发生重组，将T-DNA嵌入到染色体的随机位置。
随后，T-DNA拼接是指T-DNA与植物细胞染色体DNA发生重组并嵌入到染色体的过程。
T-DNA的LB和RB序列能够诱导农杆菌酶系统切割起始位点（nick sites），将T-DNA与染色体DNA连接起来。
然后，T-DNA和染色体DNA之间发生DNA重组，形成补充植物基因组的新构建（chimeric construct）。
这一过程具有较高的随机性，T-DNA可能嵌入到不同的染色体位点，并且还有可能发生多个T-DNA拼接。
最后，植物细胞接受是指植物细胞在T-DNA拼接完成后仍能够正常生长和分化。
当T-DNA成功嵌入植物细胞染色体后，植物细胞会通过自身的修复机制进行DNA修复，恢复正常的遗传信息。
如果T-DNA中存在目标基因，那么该基因就被整合到了植物细胞的染色体中，并能够在细胞分裂和再生的过程中被遗传和表达。
农杆菌转化法详细过程
农杆菌转化法详细过程
一、质粒的构建
1、结合胞外表达载体DNA片段：根据需要，挑选合适的质粒载体，通常是常用的pUC18或pUC19，然后从受体DNA片段中提取事先选择好的促进脱附酶及其他酶结合位；
2、PCR扩增：使用上述质粒模板进行PCR扩增，以获得清洁的受体片段；
3、克隆：把扩增片段和质粒模板克隆到同一质粒中，然后克隆到载体存储库中，以创建定向载体用于后续研究。
二、原核转化
1、准备转化粒菌：在装满氯化物的快速离心管中，将转化菌株(一般为质粒转录系) 用冰凉的悬浮液制成2X数量的悬淋液；
2、增加plasmid 质粒：在用有抗生素控制的细菌方法中，增加转换用材料，如plasmid质粒，磷酸二钙和CaC1₂，以及可能的其他试剂；
3、原核转化：将上述的悬浮液（AP出水液）添加到悬淋液中，然后加入CaC1₂和磷酸二钙，用低频超声处理混合液使其充分作用10分钟；
4、选择转化的细胞：将处理过的转化液投入加有抗生素的培养基中，然后将这些细胞培养到辅助抗生素中，以选择转化的细胞，在抗生素抑制剂中，该细胞会死亡；
5、筛选和鉴定：原核基因转换后，体外状态选择一般会获得若干转换抗性的菌株，最终进行PCR、测序或其他方法以鉴定突变体，以确定该菌株具有最终突变基因。
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，其原理是利用农杆菌在植物体内引起植物细胞的转化，使外源基因被导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。
这项技术在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用，为改良作物品种、提高农作物产量、抗病虫害等方面提供了有力的技术支持。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个关键步骤：1. 农杆菌感染植物细胞。
首先，将含有外源基因的质粒DNA导入到农杆菌的Ti质粒中，然后将农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
农杆菌通过其特殊的毛状附着器将Ti质粒转移到植物细胞内。
2. 植物细胞内基因导入。
农杆菌感染植物细胞后，Ti质粒中的外源基因会被转移到植物细胞内。
这些外源基因可以是对抗病虫害、提高产量或改良品质的基因，通过农杆菌的介导，成功导入到植物细胞内。
3. 外源基因整合到植物基因组。
一旦外源基因进入植物细胞内，它们会与植物细胞的染色体发生重组，将外源基因整合到植物基因组中。
这样，外源基因就成为植物细胞的一部分，可以被遗传到后代植物中。
4. 外源基因表达。
一旦外源基因整合到植物基因组中，它们就会开始在植物细胞内进行表达。
外源基因的表达可以使植物获得新的性状，比如抗病虫害、耐逆境等，从而实现对植物性状的改良。
农杆菌转化法的原理简单清晰，通过这种方法可以实现对植物基因的改造，为农业生产提供了重要的技术手段。
在实际应用中，农杆菌转化法已经成功应用于多种作物，如水稻、小麦、玉米、大豆等，为作物的抗病虫害、耐逆境等性状的改良提供了有效途径。
总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，其原理清晰，操作简单，成功率高，因此在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和完善，相信农杆菌转化法将会为农业生产和作物改良带来更多的机遇和挑战。
农杆菌转化法花序的原理
农杆菌转化法花序的原理1. 引言说到花序，大家脑海中是不是会浮现出那些五彩缤纷的花儿？花开得多好看啊！可这些美丽的花儿背后，可不仅仅是花瓣那么简单，尤其是它们的遗传背景，真是一个复杂而有趣的故事。
今天，我们就来聊聊一个科学名词——农杆菌转化法，它可不是高深莫测的黑科技，而是帮助我们理解和改良植物的重要工具。
听起来有点儿神秘，其实就像魔法一样，咱们慢慢揭开它的面纱！2. 农杆菌的角色2.1 什么是农杆菌？农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）听上去像是某种外星生物，其实它是一种土壤细菌。
别小看它，这家伙在植物界可是个“大人物”。
它有个本事，就是能通过“感染”植物，植入自己的DNA。
这就像在花儿的基因里放入了一个小小的“升级包”，使得植物能够产生新的特性。
就拿苹果树来说，经过农杆菌转化的苹果，可能会更抗病、更耐旱，这可真是科学的力量！2.2 农杆菌的工作原理你可能会想，农杆菌到底是怎么做到的？其实，它有个“绝招”。
当农杆菌接触到植物时，会分泌出一种叫做“转移DNA”（TDNA）的东西。
这东西就像是小偷闯入了植物细胞的家，悄悄地把自己的遗传物质植入进去。
于是，植物的细胞就开始按照农杆菌的指示，进行各种新鲜的改变。
这就像是植物被赋予了超能力，真是妙不可言！3. 转化方法的步骤3.1 转化的准备工作我们要让花儿变得更美，首先得做好准备工作。
通常，科学家会从植物上取下花序，这些花序就像是植物的“小试验田”。
接下来，把这些花序浸泡在含有农杆菌的溶液里，就像是在给植物喝“营养汤”。
这一过程非常关键，因为这时植物细胞就有机会被农杆菌感染。
3.2 转化的实施在浸泡过后，科学家会把花序放在特定的培养基上，给它们创造一个舒适的生长环境。
此时，农杆菌就开始它的“工作”，向植物细胞传递TDNA。
经过一段时间，科学家会观察到花序中有细胞开始发生变化，这时就说明转化成功了！接下来，还需要经过筛选和培养，最终培育出新的植物品种。
农杆菌转化鉴定
农杆菌转化鉴定引言：农杆菌转化鉴定是一种常用的基因转化技术，被广泛应用于植物基因工程领域。
本文将从农杆菌转化的原理、操作步骤、鉴定方法以及应用前景等方面进行介绍。
一、农杆菌转化原理农杆菌转化是一种通过农杆菌（Agrobacterium）将外源基因转移到植物细胞中的技术。
农杆菌是一种土壤中常见的细菌，具有天然的基因传递机制。
具体而言，农杆菌通过一种称为T-DNA的群体转座子将外源基因插入到植物细胞的染色体中。
二、农杆菌转化操作步骤农杆菌转化的操作主要包括以下几个步骤：1. 构建转化载体：将外源基因插入到农杆菌的转化载体中，并在其中加入适当的选择标记基因。
2. 转化菌的培养：将构建好的转化载体导入到农杆菌中，并通过培养使其大量增殖。
3. 植物材料处理：将目标植物材料进行预处理，如组织培养、愈伤组织的诱导等，为后续的转化提供条件。
4. 植物细胞转化：将培养好的农杆菌与植物材料进行共培养，使农杆菌中的T-DNA转移到植物细胞中。
5. 选择转化植株：通过添加适当的筛选剂，筛选出含有外源基因的转化植株。
6. 验证转化效果：通过PCR、Southern blot等分子生物学技术鉴定转化植株中是否存在外源基因。
三、农杆菌转化鉴定方法农杆菌转化鉴定是为了确认转化植株中是否成功引入了外源基因。
常用的农杆菌转化鉴定方法包括以下几种：1. PCR鉴定：通过设计特异引物，进行PCR扩增，根据扩增产物的大小和序列，判断是否存在外源基因。
2. Southern blot鉴定：将转化植株的基因组DNA进行限制性酶切，然后通过Southern blot检测外源基因的特异序列。
3. 荧光显微镜观察：通过将外源基因与荧光标记基因结合，利用荧光显微镜观察植物组织中的荧光信号，以确认外源基因的存在。
4. RT-PCR鉴定：通过逆转录PCR技术，检测转化植株中外源基因的表达情况。
5. Western blot鉴定：通过Western blot技术检测转化植株中外源蛋白的表达情况。
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
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实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
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学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
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等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
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将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。
农杆菌转化法的过程
农杆菌转化法的过程
农杆菌转化法是一种基因工程技术，可以被用于将外源基因引入生物体中，这种方法大大简化了基因转换的步骤，使得实现基因转换更加容易。
农杆菌转化法的过程主要包括以下几步：
1. 样本处理：处理待转换的样本，例如细胞分离、DNA提取等。
2. 农杆菌菌种培养：在特定的培养基中培养农杆菌菌种，并选择合适的载体。
3. 载体DNA插入：使用质粒或其他载体将外源DNA插入到农杆菌的DNA 中。
4. 转化：将质粒插入的农杆菌接种到特定的培养基中，使其吸收外源DNA，从而实现基因转换。
5. 筛选：根据所需目标，对质粒转化产生的农杆菌进行筛选，以确定成功转化的株系。
6. 验证：进行PCR、Southern Blot等技术，以验证转换效果。
农杆菌转化法操作流程
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植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml 或10mg/ml）。
3）质粒酶切或PCR鉴定。
6、三亲交配法：参考一：1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养；3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养；4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养；5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜；6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28℃培养至长出单菌落；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养；9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。
10）将阳性单菌落再次划线纯化。
三亲交配法：参考二：1)从保存根癌农杆菌LBA4404的平板上挑取一个单菌落，接种于10m1不含抗生素的LB液体培养基中，28℃, 200rpm培养24h;2)从保存中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养约8h;3)从保存辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm培养约8h;4)分别取以上三种细菌培养物50u1于1.5m1离心管中混匀，取100u!涂布于无抗生素的LB平板上，28℃培养过夜;5)用接种环将长出的菌落转接到含有Kan 50ug/ml,Str 25ug/ml和Rif 25ug/ml的LB平板上，28℃培养过夜;同时各取1, 2, 3步骤中的菌液100u}分别涂布于含有三种抗生素的LB平板上，作为对照。
注意一、农杆菌提取质粒，拷贝数较低，很难用酶切鉴定的方法鉴别。
因此一般用PCR鉴定。
（PCR鉴定时要做好阴性对照。
一般以未带有目的基因的空载体和未经转化的空农杆菌做对照）。
另外，未完善起见，可做回转化：即将农杆菌中提取的质粒电泳和PCR鉴定后，再将其回转到大肠杆菌中，再提取质粒酶切鉴定。
注意二、LBA4404为利福平和链霉素抗性，EHA105为利福平抗性，pRK2013为Kan抗性注意三、1）、利福平，溶于甲醇或氢氧化钠溶解后无菌蒸馏水定容，贮液20mg/ml，-20保存三个月，使用浓度50~100L。
2）、利福平(Rif)先用少量无水乙醇溶解，最后用无菌水配成50mg/ml的母液，过滤灭菌。
3）、利福平用甲醇配成浓度为20mg/ml，于－20度保存。
工作浓度50ug/ml4）、链霉素用水融解至浓度为10 mg/ml后于－20度保存。
工作浓度50ug/ml5）、溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
抗生素储存液工作浓度浓度(mg/ml) 保存条件严紧型质粒(μg/ml)松弛型质粒(μg/ml)氨苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60羧苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60氯霉素 34 (溶于乙醇) -20℃ 25 170卡那霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50链霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50四环素 5 (溶于乙醇) -20℃ 10 507、水稻胚性愈伤组织的诱导取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min（或75％酒精浸泡1min），再于0.1%升汞中浸泡15min（或再转入20％的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min），超净工作台中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上，每个皿约放35粒，28℃暗培养4－5d，切除胚根，继续培养12-15d，待愈伤长大后进行继代培养，每两周继代一次，共继代2-3次；成熟胚去壳，用镊子将有胚的一半切下，经上述方法消毒后，置于诱导培养基上。
28℃暗培养至长出愈伤组织。
选用培养或预（第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化）培养4天的愈伤组织作为转化材料。
8、根癌农杆菌的培养平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中（pEmu载体：50μg"ml -1AMP ＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str），28℃摇床过夜，再按1%接种量转接入50mL同样培养基中（含相应抗生素）培养8小时左右至OD600为0.5左右。
4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。
然后用5mL含100 uM AS的AAM液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含100uM AS的AAM液培中，28℃摇床上培养至OD600=0.5。
9、愈伤组织的预培养取生长旺盛的胚性愈伤组织（从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的2－3mm的胚性愈伤颗粒）转接到预培养培养基，27℃暗培养3－4天。
生长旺盛的愈伤用于农杆菌转化。
10、愈伤组织与根癌农杆菌的共培养取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织（预培养4d的水稻幼胚去掉胚芽或继代2-3周后2-3mm 的愈伤颗粒转入新鲜培养基中预培养4d），置于灭菌培养皿中，浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液（含100uM AS）中10-15min后将幼胚取出，中间轻缓晃动数次，倒掉菌液，将愈伤于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到共培养培养基上，于28℃（或25℃）暗培养2－3天。
11、洗除农杆菌共培养2－3天后，即农杆菌生长至可见愈伤下有少量菌斑时，挑取共培养的愈伤置于无菌三角瓶中，用（含有250mg"L-1羧苄青霉素的）无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中看不到丝状菌体。
最后一次清洗时静止1小时，让黏附于愈伤上的农杆菌充分扩散到水中。
最后，加入含500mg/L的羧苄青霉素的无菌水，静止30－50min，期间振荡几次，倒掉液体，置愈伤于无菌滤纸上凉干，然后转移到筛选培养基上，置25℃培养箱内暗培养。
11、抗性愈伤的筛选将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接1次。
培养4－8周，多数愈伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。
挑选这些抗性愈伤继续在选择培养基上暗培养2次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。
（并转入筛选培养基N6-S1中，进行选择培养。
两周后挑选出幼胚盾片处新长出的愈伤组织，转到N6-S2筛选培养基上继续筛选2-3代，2周/代）。
（N6 -S1：N6，100mg"L-1G418，250mg"L-1羧苄青霉素）（N6 -S2：N6，50mg"L-1G418，125mg"L-1羧苄青霉素）12、抗性愈伤的分化培养经抗生素筛选长出的抗性愈伤，PCR初步鉴定后，转入分化培养基中继续培养，26℃暗培养1周，然后转入25℃光照培养（12h光照，12h黑暗）。
13、转基因植株的再生及幼苗移栽转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。
（筛选4周后，选择生长旺盛，色泽淡黄的抗性愈伤组织，转移到分化培养基进行分化出苗，光照24h/d，再生的小苗长至2-3cm左右时）将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待苗高7~10cm时，打开瓶盖于温室中炼苗5~7天，待小苗生长健壮后，移出培养瓶，洗净跟上的培养基，移至温室盆栽（铁盘中）。