农杆菌转化原理及技术
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，其原理是利用农杆菌在植物体内引起植物细胞的转化，使外源基因被导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。
这项技术在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用，为改良作物品种、提高农作物产量、抗病虫害等方面提供了有力的技术支持。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个关键步骤：1. 农杆菌感染植物细胞。
首先，将含有外源基因的质粒DNA导入到农杆菌的Ti质粒中，然后将农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
农杆菌通过其特殊的毛状附着器将Ti质粒转移到植物细胞内。
2. 植物细胞内基因导入。
农杆菌感染植物细胞后，Ti质粒中的外源基因会被转移到植物细胞内。
这些外源基因可以是对抗病虫害、提高产量或改良品质的基因，通过农杆菌的介导，成功导入到植物细胞内。
3. 外源基因整合到植物基因组。
一旦外源基因进入植物细胞内，它们会与植物细胞的染色体发生重组，将外源基因整合到植物基因组中。
这样，外源基因就成为植物细胞的一部分，可以被遗传到后代植物中。
4. 外源基因表达。
一旦外源基因整合到植物基因组中，它们就会开始在植物细胞内进行表达。
外源基因的表达可以使植物获得新的性状，比如抗病虫害、耐逆境等，从而实现对植物性状的改良。
农杆菌转化法的原理简单清晰，通过这种方法可以实现对植物基因的改造，为农业生产提供了重要的技术手段。
在实际应用中，农杆菌转化法已经成功应用于多种作物，如水稻、小麦、玉米、大豆等，为作物的抗病虫害、耐逆境等性状的改良提供了有效途径。
总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，其原理清晰，操作简单，成功率高，因此在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和完善，相信农杆菌转化法将会为农业生产和作物改良带来更多的机遇和挑战。
农杆菌转化法操作流程
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农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素1.农杆菌感染：农杆菌通过其特有的类纤毛附着剂蛋白(T4SS)结构与植物细胞进行初步接触和附着。
2. 感染信号传递：在与植物细胞接触后，农杆菌释放并传递一系列感染信号，包括有效异常淋巴细胞(QvrAB)的诱导、拟南芥(Ca2+)离子内涵物的释放、脑心肌炎物质(AHL)的转运和细胞壁酶的活化等。
3.感染信号诱导细胞凋亡：感染信号的诱导会引起植物细胞凋亡，从而产生切伤的部位或孔洞，在这些切伤或孔洞中形成转化DNA理论允许进入的环境。
4.DNA传递：农杆菌通过T4SS释放线性转化DNA，并借助激发剂打开DNA链，并且该辅助剂经常与T-DNA共同转移到植物细胞总群落中。
5. 植物细胞再生：经过切伤或孔洞进入植物细胞的转化DNA在细胞质中被转录，转录本通过RNA splicing进一步处理并通过核孔复合物进入细胞核。
在细胞核中，转录本通过与受体蛋白结合而在柏氏体中形成mRNA。
mRNA会进一步被转录为蛋白质，这些蛋白质会促进植物细胞再生。
1.植物物种：不同植物物种对于农杆菌的感染和转化效率具有差异。
有些植物对农杆菌的感染和转化具有天然的耐受性或敏感性。
2.植物组织类型：不同植物的不同组织对于农杆菌的感染和转化效率也有所差异。
例如，幼嫩的愈伤组织对于农杆菌的感染和转化效率通常较高。
3.农杆菌菌株：不同菌株具有不同的亲和力和感染能力。
有些农杆菌菌株能够高效地感染和转化植物细胞，而有些菌株效率较低。
4.结构改造：农杆菌通过改造表面酶结构以增加其细胞壁附着能力，从而提高农杆菌感染和转化效率。
5.切伤或孔洞大小：适当的切伤或孔洞大小能够促进农杆菌介导植物转化的效率。
切伤或孔洞过小会限制转化DNA进入细胞，而切伤或孔洞过大则会增加细菌感染的难度。
总之，农杆菌介导植物转化是一种复杂的生物学过程，其效率受到多个因素的影响。
进一步研究和优化这些因素可以提高农杆菌介导植物转化的效率，为植物遗传工程提供更多的可能性。
农杆菌转化的原理
农杆菌转化的原理
农杆菌转化是一种常见的基因转移技术，通过这种技术可以将外源基因导入到目标细胞中并实现有效表达。
农杆菌转化的原理主要包括以下几个方面：
1. 农杆菌的识别和结合。
农杆菌具有一种特殊的异丙基酰胺酶（VirD2），其可以通过特定的DNA序列（T-DNA）与植物细胞的DNA 结合，并导入到细胞内部。
2. T-DNA的切割和导入。
在T-DNA与农杆菌结合后，VirD1和VirD2会共同作用，使T-DNA在某些特定位点上被切割。
接着，VirD2会导入T-DNA到目标细胞的细胞质内。
3. T-DNA的插入和整合。
T-DNA一旦导入到目标细胞的细胞质内，就会通过非同源重组的方式插入到宿主细胞染色体中。
随后，T-DNA 会被宿主细胞的DNA修复系统修复，形成稳定的整合体。
4. 外源基因的表达。
一旦T-DNA被整合到宿主细胞染色体中，外源基因就可以被宿主细胞的机制所表达。
这种表达方式通常是受到T-DNA插入位点的影响的，并且会受到其他因素的调控。
综上所述，农杆菌转化的原理是通过农杆菌的识别、切割和导入T-DNA，然后T-DNA插入到宿主细胞染色体中并实现稳定整合，最终外源基因得以表达。
- 1 -。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素农杆菌介导植物转化是一种常用的基因转化技术，利用农杆菌转化DNA进入植物细胞，使其表达目的基因。
在这个过程中，农杆菌的外源DNA会被单胞菌分泌物（Vir）基因编码的蛋白质工具分子T-DNA结合酶（VirD2）切割成目标T-DNA片段，然后T-DNA和Vir蛋白质工具分子挤进被切开的植物细胞，最终整合入植物细胞的染色体中。
1.农杆菌菌株：农杆菌菌株的选择对转化效率有重要影响。
通常选择具有较高转化效率的农杆菌菌株，如LBA4404、GV3101等。
不同的菌株对于不同的植物种类和品种可能有不同的适应性，因此需要根据具体情况进行选择。
2.感受性植物：不同植物对农杆菌介导植物转化的感受性各不相同，高度感受性的植物容易进行转化。
除了感受性外，植物的再生能力也是影响转化效率的因素之一、通常来说，拥有较高再生能力的植物对转化更加容易。
3.T-DNA载体：T-DNA载体是构建农杆菌介导植物转化载体的关键。
在农杆菌介导植物转化过程中，目标基因的载体必须经过农杆菌系统与植物细胞进行相应的介导，进而整合到植物细胞基因组中。
选择合适的T-DNA载体进行构建，可以提高转化效率。
此外，T-DNA载体中导入基因的拷贝数、插入位点的选择等也会对转化效率产生影响。
4.辅助物质：除了基础的转化体系以外，辅助物质也是影响转化效率的一个重要因素。
辅助物质主要包括感受性缓解物质、抗生素等。
感受性缓解物质主要用于保护不同类型的植物细胞免受农杆菌侵染造成的伤害，提高细胞存活率；抗生素主要用于抑制农杆菌菌落的生长，避免菌落过度生长对植物细胞的负面影响。
辅助物质的添加可以有效增加转化效率。
5.转化条件：转化温度、菌液浓度、转化时间等转化条件也会对转化效率产生影响。
具体条件需要根据植物种类和品种的特点进行优化。
总之，农杆菌介导植物转化主要是通过农杆菌菌株和植物的相互作用引发变化，其转化效率受多个因素的综合影响。
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法是一种利用外源DNA和农杆菌介导的在细胞内表达的方法。
该方法最早由美国生物化学家Herbert Boyer于1973年提出，并于1977年被用于创造第一个基因突变植物。
自此，农杆菌转化技术在分子生物学、分子遗传学、细胞生物学等领域取得了巨大成功，成为近十几年来生物技术发展中最重要的技术之一。
农杆菌转化法的原理是将外源DNA片段植入特定的农杆菌中，然后让农杆菌介导将外源DNA片段植入到宿主细胞中，以达到改变宿主基因的目的。
具体而言，首先需要在细胞中引入一种叫做“质粒”的载体，它可以携带外源DNA片段，然后在细胞中的特定位置，利用农杆菌提供的一些促进基因转移的酶将质粒植入细胞中。
农杆菌转化法为研究植物基因组提供了一种灵活、可靠、快速且高效的方法，可以用来改变植物的遗传特性，控制植物的生长发育状态，以及提高植物的产量和质量。
而且，农杆菌转化技术还可以用来为研究人员提供精确的模型，以更好地理解植物的基因表达和调控机制。
此外，农杆菌转化法还可以用于制造生物材料和医药，以及制造其他用途的产品。
因此，农杆菌转化法在生物技术领域具有重要的应用价值，是生物技术发展中最重要的技术之一。
农杆菌转化的原理
农杆菌转化的原理农杆菌转化是利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体将外源基因导入植物细胞的一种生物技术。
农杆菌转化的原理主要是由于农杆菌能够侵入植物细胞并将其特定DNA片段（Ti质粒）导入到植物细胞中。
农杆菌转化技术主要有两种，包括：有细胞壁组织的植物的整体组织转化和无细胞壁组织的植物的单细胞转化。
1. 整体植物组织转化整体植物组织转化是将植物芽的组织脱离植物本体，并在含有农杆菌的营养液中分化培养，使之获得外源基因之后，再将其重新接种到富含植物激素的培养基上生长。
在培养的过程中，细胞会产生突变，使得植物具有新的花色、形态等改变。
整体植物组织转化主要是利用农杆菌特定的质粒（Ti质粒），其中含有内生基因（T-DNA），这些内生基因经调节作用，可以进入植物细胞，并在转化后整合到目标植物细胞的基因组中。
2. 单细胞转化单细胞转化是将农杆菌侵入植物菌落的单细胞中，通过合适的培养条件将其转化为整株植物。
农杆菌转化的基本操作步骤包括：选择适合农杆菌转化的植物细胞，在压滴培养基上培养植物细胞，调节菌落的密度和浓度，将农杆菌和外源基因DNA共同渗透进入细胞内，并通过特定的转运蛋白将外源基因导入到植物细胞中。
该方法的优点是转化效率较高，可以在短期内获得多条转化株，是现在主要的转基因植物育种技术。
农杆菌转化技术虽然早已在实践中被广泛应用，但它仍存在着一些困难，如在转化过程中植物组织的内源抗菌物质会阻碍农杆菌人工导入外源基因。
相关研究显示，采用基因炮技术或利用激光微刻等技术进行基因导入也是可以实现植物基因转化的，但农杆菌转化技术仍是当前基因转化领域中被广泛采用的一种技术。
农杆菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌转化法的基本原理和操作步骤。
2. 将抗虫基因导入植物细胞，观察转化效果。
二、实验原理农杆菌转化法是一种将目的基因导入植物细胞的方法。
该方法利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）将目的基因转移到植物细胞中，并整合到植物细胞染色体DNA上，从而实现目的基因的遗传表达。
三、实验材料1. 植物材料：拟南芥种子、生长培养基、诱导培养基、选择培养基。
2. 农杆菌：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
3. 抗虫基因：Bt基因。
4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶。
5. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素、CaCl2、DNA标记染料等。
四、实验步骤1. 目的基因克隆（1）设计引物：根据Bt基因序列设计一对引物，用于扩增Bt基因。
（2）PCR扩增：以Bt基因的DNA为模板，进行PCR扩增。
（3）克隆：将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
2. 农杆菌工程（1）制备感受态农杆菌：将根癌农杆菌接种于LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例接种于新鲜的LB液体培养基，37℃培养3小时，加入IPTG和CaCl2，使农杆菌进入感受态。
（2）目的基因转化：将克隆有Bt基因的载体与感受态农杆菌混合，在冰浴中孵育30分钟，然后将混合液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
3. 植物转化（1）种子处理：将拟南芥种子用70%酒精消毒后，用无菌水冲洗干净。
（2）农杆菌感染：将处理好的种子接种于含有农杆菌的培养基上，28℃恒温培养3天。
（3）筛选转化植株：将感染后的种子接种于选择培养基上，筛选出转化植株。
4. 抗虫鉴定（1）PCR检测：提取转化植株的DNA，进行Bt基因的PCR检测。
（2）生物测定：将转化植株与抗虫性差的拟南芥进行抗虫性比较，观察转化植株的抗虫效果。
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农杆菌介导的水稻遗传 转化原理及技术
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水稻遗传转化已成为水稻分子生物学
研究和遗传改良的重要技术基础
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几种常用植物基因转化方法的比较
转化方法 受体材料
农杆菌法 PEG法 电击法 微针注射法 基因枪法 花粉管通道法 完整细胞 原生质体 原生质体 原生质体 完整细胞 卵细胞
宿主范围
有
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农杆菌介导遗传转化的原理
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❖ 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为发根农杆菌 （导致毛状根的发生）和根癌农杆菌（导致冠瘿瘤， 冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱）。
❖ 根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒 （Ti质粒）。
❖ 根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区（Vir区）、结合区 （Con区）、复制起始区（Ori区）和T-DNA区四个部分， 其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。
钠溶液中振荡灭菌25min，于超净工作台中无菌水
冲洗3-5次，将消毒后种子的幼胚挑出并接种于诱
导培养基中，每皿约30粒，于28℃暗培养7d，切
除胚根，继续培养7d，待愈伤长大后进行继代培
养。从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于
农杆菌转化。
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胚性愈伤
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三、农杆菌介导转化水稻
❖ 1. 愈伤组织的预培养
30-50 mg·L-1 ，pH 5.8-5.9。
❖ 5.分化培养基：NB+KT10mg·L-1+ NAA0.4 mg·L-1；pH 5.8-5.9。 ❖ 6.生根培养基：1/2MS ；pH 5.8-5.9。
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二、胚性愈伤组织的诱导及继代
❖ 取水稻授粉后15-20d的未成熟穗，将未成熟种子
剥壳，用75%乙醇浸泡1min，再转入25％的次氯酸
Ti plasm id w ith the new gene
+
cell’s DNA
A g ro b a cteriu m
Plant cell
Transform ation
The new gene
Transgenic plant
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C ell division
农杆菌介导转化水稻的方法
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水稻（籼稻）根癌农杆菌转化技术流程
❖ 选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒状 愈伤，转接到预培养培养基中，置于27℃暗培养4天。
一、 培养基
❖ 基本培养基为NB培养基，愈伤诱导、转化及分化等 培养基配方如下：
❖ 1.诱导培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 2.预培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 3.共培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 +AS100 µM·L-1 ；pH 5.2。 ❖ 4.选择培养基：NB+2,4-D 2mg·L-1 + 羧苄青霉素 250mg·L-1 + Hyg
愈伤诱导
NB培养基为基本 培养基加入相应 植物生长调节剂
共培养
整个操作过 程约需8天
第一天（预培养） 第三天（划菌） 第五天（侵染、共培养) 第八天（脱菌、筛选）
抗性愈伤的筛选与 再生成完整植株
技术关键：诱导与培养“状态良好”的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继 代次数不超过8代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效 去除农杆菌或者抑制农杆菌生长（合精适品的课抗件生素及其浓度）；快速筛选（2-3次 筛选）；迅速分化再生。
❖ T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素;
❖ 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因(ocs),该 基因启动合成各种酶,分解植物细胞产生的冠瘿碱作为惟 一的碳源和氮源;
❖ 冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti质粒的 接合转移,扩大侵染范围
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根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基 因导入植物细胞并整合到核DNA上。
Produce callus transform callus stimulate shooting by cytokinin
addition
+ cytokinin
This procedure is easy for dicotyledone plants
(legumes etc)
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Agrobacterium tum efaciens
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❖ T-DNA区左右边界各有25bp的重复序列，其中14bp是核 心，分10bp（CAGGAATATAT)和4bp（GTAA)不连续的两 组，是完全保守的。
❖ Vir区为30Kb,由 VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、 VirH等七个操纵子共24个基因起共调控作用。
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无
无
无
无 有性繁殖植物
组培条件
简单
复杂
复杂
复杂
简单
无
嵌合体比例
有
无
无
无
多
无
操作复杂性 简单
简单
复杂
复杂
复杂
简单
设备要求
便宜
便宜
昂贵
昂贵
昂贵
便宜
工作效率
高
低
低
低
高
低
单子叶植物
少
应用
可行
可行
可行
广泛
广泛
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农杆菌介导法的优点
❖ 操作简便 ❖ 外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝 ❖ 转移DNA片段明确 ❖ 可转移大片段DNA ❖ 可直接用不同的植物组织进行基因转移
Ti质粒结构示意图
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农杆菌侵染过程
❖ 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;
❖ 这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和 virG 基因,再诱导Vir区的其他基因;
❖ Vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移;
❖ T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上;