农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立
山东农业大学学士学位论文
水稻RS6基因反义表达载体的构建及遗传转化1999级生物技术专业 苏英华指 导 教 师: 张宪省 教授李兴国 副教授摘要：本实验旨在利用反义RNA技术对水稻种子特异基因RS6进行功能分析。
首先以RT-PCR技术克隆到RS6特异片段，然后将此特异片段反向插入表达载体Ubiquitin-1301中，构建起RS6反义表达载体Ubiquitin-1301-RS6。
利用农杆菌介导的方法转化水稻（Oryza sativa L.）的胚性愈伤组织。
通过抗性筛选，以期获得转基因植株，并通过对转基因植株的表型分析，确定RS6的功能。
目前已获得部分抗性愈伤组织。
关键词：水稻；反义RNA；表达载体；遗传转化Construction of expression vector with anti-RS6 and Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa L.)Biotechnology, 1999Ying hua SuDirectors:Xian sheng Zhang professorXing guo Li adjunct professor Abstract: The function of RS6, a gene expressed preferentially in rice（Oryza sativa L.）seed was characterized by antisense RNA technology. 3’ UTR of RS6 gene was cloned with RT-PCR and the antisense sequence was inserted into the Ubiquitin-1301 expression vector. The vector with antisense specific fragment of RS6 was constructed and named Ubiquitin-RS6. The antisense construct of RS6 was then introduced into rice (Oryza sativa cv. Zhong Hua 11) calli by means of an Agrobacterium-mediated transformation. According to the phenotype of transgenic plants, we can characterize its biological function. So far, we have got the transgenic calli successfully.Key words: Oryza sativa L.; antisense RNA; expression vector; transformation1.引言水稻是基因组较小的单子叶植物，也是第一大粮食作物，且已建立成熟的遗传转化系统，是研究禾本科作物以及单子叶植物发育、遗传和分子生物学的模式植物。
农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化及优化
农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化及优化蔡莹【摘要】通过用农杆菌介导法,以玉米自交系B73的种子培养成的黄化苗的茎尖作为转化的受体材料.将具有玉米C4-PEPC基因的植物表达载体pTCK303-P-ZF导入玉米自交系B73,根据载体上所带有的抗性基因,以潮霉素筛选获得抗性植株,进而为玉米遗传转化的相关研究打下坚实的基础.【期刊名称】《辽宁大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(042)002【总页数】4页(P186-189)【关键词】玉米;农杆菌;茎尖转化【作者】蔡莹【作者单位】中国医科大学基础医学院,辽宁沈阳110122【正文语种】中文【中图分类】Q37在植物的基因转化研究中，为了能使基因有效的转化，关键在于建立良好的转化体系.对于玉米来说，我们希望受体具有强的分化及再生能力，并且筛选方法要可靠、高效，进而获得稳定的转基因植株[1].目前，玉米的遗传转化方法主要有农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法、萌动胚法[2].研究表明，玉米愈伤组织的诱导及再生会受多种因素的影响，如生长季节时间因素会导致取材极其不便[3].总之，玉米植株再生不易、基因型依赖性较强、转化周期慢长、效率比较低等是目前制约玉米遗传转化的主要因素.因此，可以建立不受时间限制、转化周期短、转化效率高且不需要植物组织培养的植株再生体系，将会为玉米遗传转化的相关研究打下坚实的基础[4].那么，以茎尖分生组织作为受体系统，就具有以上特点.本研究通过用农杆菌介导法，以玉米自交系B73的种子培养成的黄化苗的茎尖作为此次转化的受体材料，比较了影响农杆菌介导转化玉米茎尖的各种因素，摸索优化了转化体系的条件.将具有构建的玉米C4-PEPC[5，6]基因的植物表达载体pTCK303-P-ZF导入玉米自交系B73，经潮霉素筛选获得抗性植株，进而为玉米遗传转化的相关研究奠定基础.玉米自交系B73、沈单16和辽单565由崔震海老师提供.主要试剂： DNAMarker、TaqDNA聚合酶，其他各试剂均为国产分析纯.菌种：农杆菌(EHA105)；载体：pTCK303-P-ZF对2到3 叶期的并没有转基因的玉米B73植株材料(各浓度100 株、共600株)用不同浓度的潮霉素涂抹叶片，观察植株叶片褐化变黄情况，适当选取潮霉素筛选浓度.选取比较饱满，并且很整齐的玉米自交系的干净种子.在超净台进行以下的操作，先使用浓度为70% 的酒精灭菌10 分钟左右、然后用0.1% HgCl2水溶液再深度灭菌10分钟、时间不宜过长或过短，最后用无菌水洗涤共5 次，灭菌期间要充分晃动种子.再将灭过菌的种子倒入灭菌的底部铺双层纱布的饭盒中并加适量无菌水，放置于温度达28℃ 的培养室中，室内要求黑暗条件，让种子自然的萌发大概三天，直至种子发出芽.种子发芽以后，将其转移到准备好的萌发培养基上，放在黑暗条件下28℃ 的温室中继续进行培养，当它生长一直长到小芽长为4~6 cm的时侯，在超净工作台上剥离它的胚芽鞘和幼叶，让其显露出处于茎尖的小生长点，用小手术刀尖一定力度与角度轻微的划伤茎尖，以便用于后续转化；之后，再把茎尖泡在重悬菌液中，然后利用真空泵干燥器，加上一定的压力，共同浸泡侵染十分钟到二十分钟；侵染结束后用无菌滤纸吸净种子上残余的菌液，然后把芽移入萌发培养基内，为了不染菌，我们可以移到一个新的瓶中，培养室内23℃ 暗培养三天，一直到它重新长出新叶.1)花盆准备：花盆中放入的土量最好控制在距离花盆边缘1到2 厘米处，用自来水浇透土壤，然后要覆盖上一层大约1到2 厘米的蛭石，蛭石也要用自来水浇透；2)清洗：共培养结束以后，室温下用自来水温和冲洗长出了新叶的转化苗，目的是除去的培养基和残余菌体；3)移芽：将茎尖移栽到事先准备好的花盆中，芽尖在摆放时需要整齐些；4)生长：2到3周以后，使转化苗自然生长到3 叶期，注意观察与浇水；5)筛选：3 叶期后，用一定筛选浓度的Hyg涂抹在玉米叶片上进行有效筛选；6)观察：观察筛选植株，我们会发现有部分植株的叶片发生明显的褐化，而部分植株叶片并没有变化，最后要将叶片没有任何变化的植株在温室条件下继续进行培养. 以常规方法提取的转化叶DNA为模板，用NOS基因的引物，以载体质粒DNA为阳性对照、正常同品种玉米叶片基因组DNA做阴性对照、ddH2O做空白对照进行PCR检测.检测的引物为:f:5’-CGATGCCATAAAGAG-3’ r:5’-TTGAACCACGAACTGC-3’预期扩增片段大小为200bp左右的NOS 部分基因片段，用1% 琼脂糖凝胶电泳检测.对2到3叶期的B73未转化植株用不同浓度的潮霉素涂抹叶片，每天观察植株叶片产生褐变的情况，一个星期以后记录并统计结果.我们观察到随着潮霉素浓度的升高、时间的不断延长，玉米叶片从没有变化到有不同程度的褐化情况.用300mg/L的潮霉素处理12天后涂叶部分基本全部褐化，用400 mg/L的潮霉素处理9天后涂叶部分全部褐化.由于转化苗比较脆弱，所以综合考虑，选用了350 mg/L 的潮霉素浓度对转化的玉米叶片进行筛选，然后对通过了筛选，存活的植株进行PCR 扩增检测.综上，选择的抗性筛选浓度为350 mg/L.因为这样既可以使抗性植株能够正常的生长和发育，又可以大力避免再生出假阳性植株.对经Hyg筛选后的所得到的抗性玉米植株的基因组DNA，我们采用CTAB方法提取，并根据检测引物，进行PCR 扩增检测，PCR结果显示得到一目的条带(图1).建立了玉米B73芽尖转化优化体系，初步筛选获得了19株玉米抗性植株，该体系为进一步玉米遗传转化研究奠定了基础.即利用实验摸索优化后的体系用农杆菌介导的玉米茎尖转化方法共转化了750 个B73玉米茎尖.那由于切芽尖的过程或移栽过程所造成的损失，最终获得451 株转化植株，在玉米3到5 叶期经350 mg/L Hyg涂抹，约2周后得到19 株抗性苗，抗性率4.21%，但PCR 检测得到一株阳性植株.有研究者也利用农杆菌介导进行外源基因的玉米转化，并以玉米茎尖为受体材料，得到的转化率达6 %[7]和8.57 %[8]，而我们的实验结果没有如此高的转化率，分析其原因可能是：外界因素—实验室内的温度及光照等培养条件不是很理想，导致小苗生长空间有限，导致成苗率降低；设计因素—菌株及载体的选择、目的片段的长短不合适都会对转化效率产生一定的影响.也有研究报道显示转化的阳性率较低，我们分析原因可能是：从玉米品种基因型角度来说，玉米B73种子自身萌发出的幼苗虽然直，但较为细弱，这就使得茎尖操作难度较大，因为它的茎尖很小，所以转化后幼苗的生活力不高.为了提高转化率，就需要我们要求在操作具有娴熟的经验，并且需要较大的工作量.但是这种方法的优势也很明显，实验不受材料和季节限制，一年四季可以长期开展.所以，在后续的研究中要注意操作稳定，并适当增加实验材料的数量，通过这种方法我们期待得到更多稳定的阳性转化植株.【相关文献】[1] Gould J,Devey M,Hasegawa,et al.Transformation of Zea mays ing Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex[J].plantphysiology,1991,95:6-34.[2] 孙毅,王景雪,刘少翔,等.农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法.发明专利：中国,CN1302900A[P].[3] 张艳贞,王是,季静,等.农杆菌介导的玉米遗传转化研究进展、问题与分析[J].东北农业大学学报,2003,34(l):109-113.2001.[4] Smith R,Hood EE.Agrobacterium tumefaciens transformation of monocotyledons[J].Crop Science,1995,35:301-309.[5] Matsuoka M,Minami plete structure of the gene for phosphoenolpyruvate carboxylase from maize.Eur [J].J Biochem,1989,181(3):593-598.[6] KU M S,Cho D,Ranade U,et al.Photosynthetic performance of transgenic rice plants overexpressing maize C4 photosynthesis enrymes.[M].//Sheehy J E,Mitchell P L,Hardy B.Redesigning of rice photosynthesis to increase yield.Amsterdam,Netherlands:Elsvier Science Publishers,2000:193-204.[7] 巩健,杨芳.单子叶植物表达载体的构建及农杆菌介导的玉米遗传转化的研究[J].生物术,2007,17(3):2-5.[8] 孙传波,曲文利,姜志磊,等.农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1 基因的初步研究[J].玉米科学,2009,17(6):32-34.。
水稻基因遗传转化方法研究进展
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2023, 44(6): 843-853DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202307001郭涛, 沈任佳, 王加峰. 水稻基因遗传转化方法研究进展[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(6): 843-853.GUO Tao, SHEN Renjia, WANG Jiafeng. Research progress on genetic transformation methods of rice[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(6): 843-853.特约综述水稻基因遗传转化方法研究进展郭 涛 ，沈任佳，王加峰(华南农业大学 农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东 广州 510642)摘要: 介绍水稻遗传转化方法的发展历程和科研成果，为水稻遗传转化体系的研究和应用提供借鉴。
从生物介导转化法和非生物介导转化法2类方法出发，介绍各种转化方法在水稻上的首次报道和重要进展并进行了展望。
生物介导转化法中，农杆菌Agrobacterium介导转化法通过侵染种胚、稻穗、愈伤组织和茎尖进行转化，种胚及其诱导的愈伤组织作为材料的转化体系较为成熟，稻穗和茎尖转化法则操作简便、转化再生周期短；此外，有研究尝试用根瘤菌Sinorhizobium和Rhizobium以及附着剑菌Ensifer adhaerens转化水稻。
非生物介导转化法中，物理方法转化法(基因枪法、电击法、花粉管通道法和显微注射法)是较为传统的转化方法，基因枪法应用较为成熟，花粉管通道法则取得较多育种成果；介质介导转化法中，纳米材料的应用正逐步成为研究热点。
水稻遗传转化体系的发展可从转化材料的筛选和优化介导转化的载体入手，同时将转化体系和DNA-free、单倍体诱导等技术结合起来，以提高转化效率和安全性，缩短转化再生周期。
生物(16+5)-2025年1月“八省联考”考前猜想卷
2025年1月“八省联考”考前猜想卷生物（考试时间：75分钟试卷满分：100分）注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、考生号等填写在答题卡和试卷指定位置上。
2．回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡对应题目的答案标号涂黑。
如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。
回答非选择题时，将答案写在答题卡上。
写在本试卷上无效。
3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题：本部分共16题，每题3分，共48分。
在每题列出的四个选项中，选出最符合题目要求的一项。
1．高密度脂蛋白（HDL）为血清蛋白之一，是由载脂蛋白、磷脂和胆固醇酯等组成，可将血液中多余的胆固醇转运到肝脏处进行分解排泄。
动脉造影检测证明，高密度脂蛋白含量与动脉管腔狭窄程度呈显著的负相关。
下列有关叙述错误的是（）A．载脂蛋白是一种能与脂质结合的含有氢键的蛋白质B．磷脂分子具有亲水性的“尾部”和疏水性的“头部”C．HDL是由多种化合物组成，其含有C、H、O、N、P元素D．高水平的HDL可降低高胆固醇引起的心脑血管疾病的风险2．在偏碱性的土壤中Fe3+通常以不溶于水的Fe（OH）3形式存在，溶解度低，难以被植物吸收。
在长期的进化过程中，某植物形成了如图所示的铁吸收机制。
据图分析，下列说法正确的是（）A．ATPase具有运输功能但不具有催化作用B．H+的外排有利于铁化合物的溶解和吸收C．Fe2+的吸收为无氧呼吸，则降低土壤中氧气含量，植物对铁的吸收增强D．缺铁胁迫下，图中膜蛋白合成量会下降3．蔬菜或水果收获后一段时间内细胞仍进行细胞呼吸。
某研究小组探究了温度、O2浓度对储存苹果的影响，实验结果如图所示。
下列相关叙述正确的是（）A．该实验的自变量是温度，因变量是CO2相对生成量B．温度影响细胞呼吸的每个阶段，O2浓度会影响有氧呼吸的第三阶段C．3℃时苹果细胞只能进行无氧呼吸，其他实验温度下可以进行有氧呼吸和无氧呼吸D．根据实验结果可知，低温和无氧环境最适合储藏苹果4．演艺圈的女明星，有些为了保持年轻貌美，不惜重金到医疗机构非法注射人体胎盘素（可能携带梅毒等病原体）。
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。
2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。
9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。
农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展
基金项目上海市科技兴农项目（沪农科推字〔2021〕第1-3号）；安徽省科技重大专项（201903a06020011）。
作者简介陈思（1997—），女，安徽安庆人，助理农艺师，从事水稻遗传育种工作。
*通信作者收稿日期2022-06-17农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展陈思张从合*王慧吴浩然杨力黄艳玲管昌红（安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交稻新品种创制重点实验室，安徽合肥230088）摘要在水稻遗传转化过程中，农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多，比如转入的外源DNA 结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等，已被广泛应用于转基因技术中。
本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述，并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。
关键词水稻；根癌农杆菌；农杆菌介导转化法；遗传转化中图分类号S511文献标识码A文章编号1007-5739（2023）05-0001-04DOI ：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.05.001开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Research Progress on Influencing Factors of Agrobacterium-mediated GeneticTransformation of Rice and Its ApplicationCHEN SiZHANG Conghe *WANG HuiWU HaoranYANG LiHUANG YanlingGUAN Changhong(Anhui Win-all Hi-tech Seed Co.,Ltd./National Key Laboratory for New Variety Development of Hybrid Rice of Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Hefei Anhui 230088)AbstractIn the process of rice genetic transformation,agrobacterium-mediated transformation method has manyadvantages compared with other methods,such as the complete structure and relatively stable expression of the transferred exogenous DNA,simple operation and high transformation rate.It has been widely used in transgenic technology.This paper reviewed the principles of rice genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens and the factorsaffecting genetic transformation,and discussed the application prospects of agrobacterium-mediated methods.Keywordsrice;Agrobacterium tumefaciens ;agrobacterium mediated transformation method;genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物之一，是全球1/2以上人口的主食，也已经成为植物基因组学研究的重要对象[1]。
水稻农杆菌转化体系中共培养方法的优化
ｆ １徐恒永， 实． １ ２ 赵君 高产冬 小麦的冠层光合能力及不 同器官的贡献 『． 学报， ９（ ： ４ ２９ Ｊ作物 ］ １ ５ ）０—０ ． ９ ２２ 【３ ｌ】程式华， 现代 中国水稻【】 李建． Ｍ ． 金 盾 出版社， ０． 北京： ２ ７ ０
（ 责任 编辑
张志 转 ）
参考 文献 … 裴Fra bibliotek中有， １ 孙守钧， 李玲， 农杆 菌介 导粳稻 高效转化体 系的研 究ｆ． 等． Ｊ １
华 北 农 学 报，０ ５２ （１ ０ １ ． ２ ０ ，Ｏ３： — ３ １
３ 讨 论
共 培 养 阶段 是 农 杆 菌 介 导 遗传 转 化 的关 键 时 期 ， 杆 菌 对 愈 伤 组 织 的 侵 染 过程 ， 是 农 杆 菌 携 农 也
ｓ ｌ ｃ ｉｎ ｏ ｇ ａ ｎ ｅ ｇ ｔ ｎ ｗｏ ｅ ｅ ｔｏ ｆ ｒ ｒ ｉ ｗ ｉ ｈ ｉ ｔ ｍａｚ ｐ ｐ ｌ ｔ ｎ ｉｅ ｏ ｕ ａ ｉ ｓ ｏ ．Ｃｒ ｐ ｏ
Ｓ ｉｎ ｅ １ ９ ，３ ：５ ９ ４ ｃｅ ｃ ， ９ １ １９ ９— ６ ．
［６ １］中国科学院． 小麦的 密植 和深耕． 农业丰 产研 究丛 书第 １集ｆ ＿ Ｍｌ 北 京： 学 出版 社 ．９０１ ８ ． 科 １６ ： ６ － ［７ １］何 贤芳 ， 赵莉 ， 朱昭进 ， 小麦品种 （ 籽 粒产量与其他 若干性 等． 系） 状 关系初探［ｌ Ｊｌ 安徽农业科学， １ ， （７：００ — ０ ０ ． ２ ３ １） ２４ １２ ６ ０１９ １ ［８ １］方先文， 曾阳， 熊恩 惠， 影响小麦 生物学产量和 收获指数 的性 等． 状 分析『Ｉ Ｊ． 江苏农 业科 学，９ ４４ １９ ，． 【 】宋荷仙， １ ９ 李跃建， 成， 小麦收获指数和源 、 冯君 等． 库性状 的遗传 研 究ｆ． Ｊ 中国农业科学， ９ ， （ ：１２ ． ］ １ ３ ６ ） —６ ９ ２ ３２
OsRPK1基因过表达和RNA干涉对水稻苗期耐盐性的影响
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2020, 46(8): 1217 1224 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@本研究由国家自然科学基金项目(30900104)和河北省自然科学基金项目(C2016205158)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30900104) and the Hebei Provincial Natural Science Foun-dation (C2016205158).*通信作者(Corresponding author): 葛荣朝, E-mail: grcgp@ **同等贡献(Contributed equally to this work)第一作者联系方式: 李晶岚, E-mail: 83494429@; 陈鑫欣, E-mail: 1046433763@Received (收稿日期): 2019-11-25; Accepted (接受日期): 2020-03-24; Published online (网络出版日期): 2020-04-21. URL: /kcms/detail/11.1809.s.20200421.1254.004.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.92060OsRPK1基因过表达和RNA 干涉对水稻苗期耐盐性的影响李晶岚** 陈鑫欣** 石翠翠 刘方惠 孙 静 葛荣朝*河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄 050024摘 要: 水稻OsRPK1基因属于富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶, 在盐胁迫下其表达量暂时升高后出现明显下降。
前期研究表明, OsRPK1基因过表达会造成拟南芥非生物胁迫耐受性明显降低。
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农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立：以质粒PBI121和gfp作为外源DNA转化农杆菌EHA105，通过对EHA105生长状态的测定，并对重悬液Cacl浓度，速冻时间和热处理温度等实验条件逐一进行筛2选，以确定EHA105的最优转化条件。
然后，分别用被转化的农杆菌侵染水稻愈伤组织。
结果表明，农杆菌 OD值接近0.6经过20mmol/L Cacl2重悬细胞，液氮速冻5600分钟后于28?处理5分钟，农杆菌的转化效率最高。
愈伤组织经GUS染色或荧光观察，外源基因已经转入水稻种子中。
农杆菌；水稻愈伤组织；遗传转化: Agrobacterium tumefaciens EHA105 was transformed by the plasmid PBI121 and gfp. To difine the best experimental conditions for transformationof A.tumefaciens the growth rate of the A.tumefaciens EHA105 was measured ,andthe concentration of resuspension solution,freezing time and the thawingtemperature were tested. And then infected mature rice in order to inducecallus with Agrobacterium tumefaciens respective .Result: By resuspended inCaclbuffer, frozen in liquid nitrogen for 5 min and thawed in 28? for 5 2min, the efficiency of transformation was the best. The callus was dyed byGUS or seen by fluorescence, which can testify that exterior gene has beentransferred into rice.Agrobacterium tumefaciens; rice callus; Genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物，并已为分子生物学研究的模式作物之一。
因此，遗传转化已成为水稻分子生物学研究和基因工程的必需手段。
虽然已有一些方法（如基因枪法.PEG法.电极法等）可得到转基因植物（刘明华等1995，Christou等1992，Peng等1992），但由于这些方法有操作复杂.外源基因插入的多拷贝性和不完整性以及较高比例的不育植株等缺点（Potrykus 1990,Finnegan和McElroy1994）,所以人们一直试图寻找一种更为有效的转化方法。
鉴于农杆菌介导的基因转移是双子叶植物中运用最为广泛而有效的遗传转化系统，因此有许多学者尝试将这一体系用于水稻的基因转化（李宝健等1990，Li等1992，Chan等1993）。
Raineri等（1990）曾报告用农杆菌转化水稻得到转基因细胞并证明了T-DNA上的NPT?基因和GUS基因在受体细胞中的整合与表达。
Chen等（1993）利用农杆菌法获得了一些转基因水稻植株，Southern杂交证明T-DNA上的基因传递给了后代。
由于当时转化效率还很低，加之一些报告缺乏必要的分子证据或分析数据，因此人们对农杆菌转化法尚有疑问（Potrykus 1990）。
近年来，在根瘤农杆菌转化单子叶植物方面取得了长足的进步。
水稻是单子叶植物基因组研究的模式植物,近年来水稻基因组研究取得了很大进展, 构建了遗传图谱和物理图谱, 完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测序, 以及第1 号和第4 号染色体的精细测序, 并对第10 号染色体的结构进行了详细分析。
Hiei等（1994）报告利用根瘤农杆菌转化粳稻得到大量转基因植株,并提供了详细的分子生物学证据；Rashid等.dong等.Aldemita hodges以及Ishida等于1996年利用Hiei(1994)的转化体系分别在籼稻.爪哇稻.籼粳稻和玉米上获得转基因植株,再次证明根瘤农杆菌介导转化水稻的可行性和有效性。
本研究利用农杆菌LBA105为测试菌，通过改进和优化冷冻法转化条件，并结合氯化钙法或TSS法制备感受态细胞，通过分析比较细胞生长状态，重悬液浓度，冻融时间，热处理温度等条件对农杆菌转化效率的影响，筛选出了方法简单.步骤简便。
易操作，并具有较高转化率的实验方案。
最后将携带有报告基因质粒PBI121和GFP外源O ry z a sativa L. ssp. jap 基因的农杆菌EHA105转入以水稻基因组测序品种日本晴()水稻中，探索建立起水稻的遗传转化体系。
onica大肠杆菌DH5α，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105, 质粒GFP（携带绿色荧光蛋白基因GFP）和质粒PBI121（携带β - 葡萄糖苷酸酶基因GUS）均由本实验室保存。
PEG4000 分析纯；DMSO，分析纯；Cacl2, 分析纯 ;Mgcl2, 分析纯;Nacl 分析纯;j均为西安化学试剂厂产品。
利福平（Rif）:工作浓度为50mg/L,卡那霉素(kan):工作浓度为50mg/L，均为Sigma产品。
台式高速离心机（Eppendorf）,Centrifuge 6900 型离心机,数显振荡培养厢，TU-1800型紫外可见光分光光度计（北京美菱），超净工作台（江苏），WD-9403型紫外分析仪， KUBOTA Corpora2 tion Japan ;PCR仪,PCR System 270 型,Singapore ;电泳仪（北京鼎国1100型）,GeneGenuis 型GYNGENE ,UK。
1.1.4.1 溶液TE: Tris-HCL 10mmol/L,1mmol/L EDTA,PH8.3。
. 2STE: 0.1mol/L NaCL,10mmol/L Tris PH8.0, 1mmol/L EDTA PH8.0。
. 溶液?：50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCL(PH0.8),10mmol/L EDTA(PH0.8),用前TSS： 10％PEG，5％DMSO,20mmol/LMgcl配制，各成分配成母液，灭菌保存。
溶液?：0.2mol/L NaOH(10mol/l 贮存液),1?SDS,用前配制。
溶液?：5mol/L KAc 60ML ,冰醋酸11.5Ml，加蒸馏水定容至100mL，所配制溶液含3mol/L K?,5mol/L Ac?。
1.1.4.2 培养基愈伤诱导培养基（Callus induction medium）M S 基本培养基（工作浓度mg/L）：PH5.8KNO 上微) 1900 MnSO.2HO 16.9 Cocl.6HO 0.0234222大量元同5 NHNO 1635 43素微量有MgSO 370 ZnSO.7HO 8.6 Gly 2.0 442元机素元KHPO 170 HBO 6.2 维生素B1 0.1 2433素钙盐 CaclHO440 KI 0.83 维生素B6 0.5 2.2Fe盐 Na-EDTA 37.3 NaMoO.2HO 0.25 烟酸 0.5 242FeSO.4HO 27.8 CuSO.5HO 0.025 肌醇 100 4242N6D基本培养基（工作浓度mg/L）：250ml PH5.8(NH)SO 2.5ml MgSO 2.5ml Vitamin 2.5ml 4244KHPO 2.5ml Fe?-EDTA 2.5ml Nomin stock 2.5ml 242solution Cacl 2.5ml 肌醇 2.5ml 2,4-D(mg/mg) 0.625ml 2KNO 0.71g Sucrose 7.5g Pro 0.2g 3)SO0.5ml Vitamin 1 ml 水解物 0.03 g 424 水解物 0.075g phytagel 0.75g KH1/2N6D基本培养基：100ml PH5.2 PO 0.5 ml No min stock 0.5 ml phytagel 0.3 g 24solution (NHCacl 0.5 ml 2,4-D(mg/ml) 0.25 mg 葡萄糖 1 g 2MgSO 0.5 ml KNO 0.142g AS(ul) 100 g 43Fe?-EDTA 1 ml Sucrose 2 g 2肌醇 1 ml Pro 0.2 g LB培养基： 1L PH7.0胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g Nacl 10g YEB培养基：PH7.0胰蛋白胨 5g/L Sucrose 5 g/L 酵母提取物 1 g/L MgSO0.5 g/L 4水稻愈伤组织的诱导参照H iei等[ 7 ]的方法。
将日本晴水稻(Ory za sa tiva L.ssp.jap on ica)种子脱去内颖和外颖,每200 粒种子为1个处理,用蒸馏水清洗3次，然后用体积分数75%乙醇浸泡2分钟再用蒸馏水清洗3次，0.15?Hgcl清洗20分钟。
之2后在无菌工作台上打开盛放种子的离心管倒出Hgcl,并用蒸馏水清洗4-5次，再将种2子倒在灭过菌的滤纸上，吹干（1h）。
接种到不含激素的诱导培养基上28 ?避光培养,30d后将愈伤组织进行继代培养。
然后，7-8天进行一次继代培养。
观察诱导的愈伤，一般长的能自行脱落的样子就可以剥下来进行继代培养。
除去胚乳，胚芽，将愈伤转入新的N6D，培养。
如果剥下来的愈伤比较大，可以在这一步用镊子将之剥小。
（注意：培养基倒平板后在无菌台上吹1小时以上，同时转入的愈伤应在无菌滤纸上吸干，保证继代时愈伤和培养基间无水膜。
将继代的愈伤重新转一次培养基即可，也应保证培养基吹干和愈伤的干燥。
一般3-4天就可以用于感染。
(注：培养基PH5.6）1.2.1.1大肠杆菌感受态细胞的制备1．将大肠杆菌DH5α的饱和菌液1ml加入100ml LB液体培养基中，装于用500ml锥形瓶中，然后于37?下摇床培养，每过1小时测其OD值，止OD0.421时取出，将菌液立即置于冰上15分钟。
2．将菌液分装于1.5ml的离心管中，每管1.4ml。
然后于4?下，4000g/min,离心10分钟。
3．弃上清，在无菌滤纸上倒置1分钟,使培养基流尽。
溶液重悬细胞。
2 4．向小离心管中加入1ml冰冷的0.1M Cacl5．冰浴30分钟。