利用gfp报告基因优化农杆菌介导的水稻遗传转化
农杆菌介导水稻遗传转化方法的优化研究
农杆菌介导水稻遗传转化方法的优化研究作者：周蕾陈晨来源：《农业与技术》2015年第17期摘要：目前人们对转基因方法的研究越来越多，其中，对农杆菌介导的转化方法研究较多，应用最广。
本实验对农杆菌介导水稻遗传转化的各重要因素进行了分析，研究讨论了光照、继代次数、菌液浓度、侵染时间、干燥情况等因素对遗传转化的影响。
研究结果表明，光照诱导愈伤比暗培养诱导缩短约一周的时间，菌液浓度过高易导致后期实验抑菌抑不住，侵染时间过长会导致愈伤软化，进而很难分化。
关键词：转基因；农杆菌；水稻；影响因素中图分类号：S511 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.2015093201120世纪80年代产生的转基因技术，可直接在基因水平改变植物的遗传物质，直接弥补了杂交育种在定向性和稳定性等方面的不足[1]。
自1988年首次获得可育的转基因水稻以来，基因工程技术在水稻品种改良上得到了广泛的应用，已选育了一系列转基因水稻品系。
许多学者在水稻转基因育种的研究上做了大量工作并取得了不菲的成绩，为水稻的遗传改良做出了巨大贡献[2]。
目前常用的水稻转化方法有PEG发[3]、电击法[4]、基因枪法[5]、花粉管通道法[6]和农杆菌介导法。
Chan等[7]首次通过农杆菌介导获得了转基因植株，随后，Hiei等[8]实现了对粳稻的高频转化，转化率达到28.6%，表明粳稻的农杆菌介导转化体系已基本建立起来。
农杆菌介导的遗传转化作为一种天然的植物基因转化系统，具有转化的外源DNA结构完整、转化机理清楚等优点，已成为植物转基因策略中的首选方法 [9]。
本文以粳稻（Oryza sativa）日本晴的成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料，对组织培养体系及影响遗传转化的因素进行优化研究。
1 材料与方法1.1 供试材料粳稻日本晴；农杆菌菌株为EHA1051.2 实验方法1.2.1 愈伤组织的诱导培养取成熟饱满的日本晴水稻种子，去颖壳。
在超净工作台上，先用75%酒精浸泡30s，再用50%NaClO处理对种子进行消毒，之后用灭菌水将种子清洗7～8次，并将种子置于无菌滤纸上吹干，最后将种子接种在诱导培养基上，进行28℃暗培养和28℃光照培养，每天观察愈伤的生长情况。
农杆菌介导的水稻和拟南芥转基因体系建立和转基因植株的分析_图重点
农杆菌介导的水稻和拟南芥转基因体系建立和转基因植株的分析细胞生物学：赵健亮中文摘要水稻是世界上主要的粮食作物之一，超过二分之一的人以其为主食。
随着水稻全基因组测序的完成，加上各种数据库的构建和公布，同时由于水稻具有较小的基因组与禾谷类作物的共线性，成熟的遗传转化体系，使其成为单子叶的模式植物。
因此其基因的功能及相互作用成为基础研究的热点和人类社会发展的要求。
气孔和表皮是研究细胞分化和植物发育的模式系统。
在拟南芥中，气孔和表皮的研究已经取得很大的成果，且日益白炽化，而水稻领域则方兴末艾。
水稻是重要的禾本科植物，是单子叶植物中的模式植物。
农杆菌介导的水稻转基因研究自1994 年以来得到不断地完善与发展。
本研究旨在建立农杆菌介导的水稻遗传转化体系，并研究拟南芥中的两个基因 TMM、FK 在水稻中超表达是否对水稻表型有影响，加深对这两个基因的了解。
AbstractRice is a main cereal crop and staple food for over half of the world population. Rice has also become a model system of monocotyledon plants for genomic studies because of its relative small genome, mature transformation technique, the published various databases and the completion of the genomic sequencing projects of both indica and japonica subspecies.Stomata and epidermal cells were both model systems for studying the cell differentiation and plant development. In Arabidopsis, the great achievements of stomatal and epidermal development have been made. However, there was less correlative advancement in rice.As an important grass, rice is a model plant in monocots. Since 1994, research of agrobacterium-mediated transgenic rice has been continuously improved and advanced. This study was designed to establish agrobacterium-mediated genetic transformation system of rice and to study whether the over-expression of TMM and FK in rice affect the phenotype of rice, and to further understand the functions of these two genes.缩略词表CTAB Cetrimonium Bromide 十六烷基三甲基溴化铵dNTP Deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 GMC Guard mother cell 保卫细胞母细胞IPTG Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷LB Luria-BertaniPCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 X-gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷ZH 11 Zhonghua 11 中花11GMC gurd cell mother cell 保卫细胞母细胞 GC gurd cell 保卫细胞GL glome like 类颖体第一部分前言1、水稻基因组研究现状及意义水稻(0ryza.sativa是世界上主要的粮食作物之一，全球近一半的人以大米为主食(主要集中在亚洲、非洲和南美。
水稻基因遗传转化方法研究进展
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2023, 44(6): 843-853DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202307001郭涛, 沈任佳, 王加峰. 水稻基因遗传转化方法研究进展[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(6): 843-853.GUO Tao, SHEN Renjia, WANG Jiafeng. Research progress on genetic transformation methods of rice[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(6): 843-853.特约综述水稻基因遗传转化方法研究进展郭 涛 ，沈任佳，王加峰(华南农业大学 农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东 广州 510642)摘要: 介绍水稻遗传转化方法的发展历程和科研成果，为水稻遗传转化体系的研究和应用提供借鉴。
从生物介导转化法和非生物介导转化法2类方法出发，介绍各种转化方法在水稻上的首次报道和重要进展并进行了展望。
生物介导转化法中，农杆菌Agrobacterium介导转化法通过侵染种胚、稻穗、愈伤组织和茎尖进行转化，种胚及其诱导的愈伤组织作为材料的转化体系较为成熟，稻穗和茎尖转化法则操作简便、转化再生周期短；此外，有研究尝试用根瘤菌Sinorhizobium和Rhizobium以及附着剑菌Ensifer adhaerens转化水稻。
非生物介导转化法中，物理方法转化法(基因枪法、电击法、花粉管通道法和显微注射法)是较为传统的转化方法，基因枪法应用较为成熟，花粉管通道法则取得较多育种成果；介质介导转化法中，纳米材料的应用正逐步成为研究热点。
水稻遗传转化体系的发展可从转化材料的筛选和优化介导转化的载体入手，同时将转化体系和DNA-free、单倍体诱导等技术结合起来，以提高转化效率和安全性，缩短转化再生周期。
植物双荧光素酶报告基因实验步骤
植物双荧光素酶报告基因实验步骤植物双荧光素酶报告基因实验是一种常用的遗传工程技术，用于研究植物生长和发育过程中的基因表达。
本文将介绍植物双荧光素酶报告基因实验的步骤，包括实验材料的准备、实验过程和数据分析。
希望通过本文的介绍，读者能够了解植物双荧光素酶报告基因实验的基本原理和操作步骤，从而在实验中取得良好的结果。
实验材料的准备1.植物基因表达载体：选择适合植物的基因表达载体，通常是含有CaMV 35S启动子的质粒载体。
2.双荧光素酶基因：选择适合植物的双荧光素酶基因，通常是含有GFP和RFP标记的基因。
3.植物材料：选择要进行基因表达研究的植物材料，通常是拟南芥或番茄等模式植物。
4.转化试剂：选择合适的转化试剂，例如农杆菌或利用基因枪进行转化。
实验过程1.构建双荧光素酶报告基因表达载体：首先将选择的双荧光素酶基因插入到基因表达载体中，通常采用限制酶切和连接酶切方法进行构建。
2.转化植物细胞：将构建好的基因表达载体转化到植物细胞中，可以采用农杆菌介导的转化方法或利用基因枪进行转化。
3.筛选转化植株：筛选转化后的植株，通常通过抗生素筛选或基因标记筛选的方法确定转化植株。
4.观察基因表达：观察转化植株中双荧光素酶基因的表达情况，通常通过荧光显微镜观察GFP和RFP的荧光表达情况。
5.分析基因表达：对双荧光素酶基因的表达进行定量分析，通过荧光素酶酶活性测定或荧光强度测定等方法进行分析。
数据分析1.统计分析：对实验得到的数据进行统计分析，包括双荧光素酶基因的表达比例、荧光强度等指标进行统计。
2.图表分析：将统计分析的结果用图表的形式进行展示，包括柱状图、折线图等形式，直观地展示基因表达的情况。
3.结果解读：根据统计分析和图表分析的结果，对双荧光素酶基因在植物中的表达情况进行解读，探讨其在植物生长和发育过程中的作用。
通过以上步骤，可以完成植物双荧光素酶报告基因实验，研究植物生长和发育过程中的基因表达情况，为了解植物生物学和遗传学提供重要的实验数据。
以GFP为报告基因优化农杆菌介导海岛棉转基因体系的研究
摘 要 ： 为 了进 一 步 建 立 优 化 的根 癌 农 杆 菌 介 导 海 岛 棉 外 源 基 因 转 化 体 系 ， 高 海 岛 棉 外 源 基 因 转 化 率 。 以 生 提 理 状 态 基 本 一 致 的海 岛棉 新 海 ３ ０号 的 胚 性 愈 伤 组 织 为 受 体 材 料 ， 绿 色 荧 光 蛋 白基 因 （ Ｐ 为 报 告 基 因 ， 浸 染 以 ＧＦ ） 将 时 间和 共 培 养 时 间作 为试 验要 素 ， 选 适 宜 的浸 染 时 间 和 共 培 养 时 间 。结 果 表 明 ， 癌 农 杆 菌 介 导 的 海 岛 棉 外 源 筛 根 基 因转 化 体 系 的最 佳 浸 泡 时 间 为 １ ｉ， 培 养 时 间 为 ２ 。 ５ｒ ｎ 共 ａ ４ｈ 关 键 词 ： 海 岛 棉 ； Ｐ基 因 ； 传 转 化 ； Ｃ ＧＦ 遗 ＰＲ
合 ， Ｐ就 可 以作为 棉花 遗传 转 化 体 系 中 的报 告 分 ＧＦ
子， 最大 的优 点是 检测 极为 方便 。此 外 ， 如果 转基 因 植物 中有 较 高水平 的 ＧＦ Ｐ转 录子 时 ， 可使 用长 波 紫 外灯 进 行检测 ， 在手 提式 紫外 灯 的直接 照射 下 ［ 。 如 ２ ］
入 棉花 ， 而为该 转 化 方 法 提 供 新 的证 据 。有关 海 从 岛棉 农 杆菌介 导 的转 基 因体 系 研 究少 有 报 道 ， 因此 利 用 ＧＦ Ｐ做 为报告 基 因 ， 筛选 海 岛棉最 佳转 化体 系
具 有重 要意 义 。
ＧＦ Ｐ用 于水 稻［ 、 麦［ 、 米 ＿ 、 蔗［ 等 作 物 的 ３小 ］ ４玉 ］ ５甘 ］ ６
一
将 已经 预培 养 的新海 ３ ０的胚 性愈 伤 ， 入经 活 放
化 的菌 液 中 ， 液 Ｏ 值 为 ０ ３ ． ， 染 菌 液 设 菌 Ｄ ． ～０ ５ 浸 计 ４个 时 间梯度 ， 掉菌 液 ， 无 菌水 冲洗 ２ ３遍 ， 倒 用 － 用 灭菌 的滤 纸吸 干 残余 菌液 ， 均匀 分 布 于 垫 有 滤 纸
农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展
基金项目上海市科技兴农项目（沪农科推字〔2021〕第1-3号）；安徽省科技重大专项（201903a06020011）。
作者简介陈思（1997—），女，安徽安庆人，助理农艺师，从事水稻遗传育种工作。
*通信作者收稿日期2022-06-17农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展陈思张从合*王慧吴浩然杨力黄艳玲管昌红（安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交稻新品种创制重点实验室，安徽合肥230088）摘要在水稻遗传转化过程中，农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多，比如转入的外源DNA 结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等，已被广泛应用于转基因技术中。
本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述，并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。
关键词水稻；根癌农杆菌；农杆菌介导转化法；遗传转化中图分类号S511文献标识码A文章编号1007-5739（2023）05-0001-04DOI ：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.05.001开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Research Progress on Influencing Factors of Agrobacterium-mediated GeneticTransformation of Rice and Its ApplicationCHEN SiZHANG Conghe *WANG HuiWU HaoranYANG LiHUANG YanlingGUAN Changhong(Anhui Win-all Hi-tech Seed Co.,Ltd./National Key Laboratory for New Variety Development of Hybrid Rice of Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Hefei Anhui 230088)AbstractIn the process of rice genetic transformation,agrobacterium-mediated transformation method has manyadvantages compared with other methods,such as the complete structure and relatively stable expression of the transferred exogenous DNA,simple operation and high transformation rate.It has been widely used in transgenic technology.This paper reviewed the principles of rice genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens and the factorsaffecting genetic transformation,and discussed the application prospects of agrobacterium-mediated methods.Keywordsrice;Agrobacterium tumefaciens ;agrobacterium mediated transformation method;genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物之一，是全球1/2以上人口的主食，也已经成为植物基因组学研究的重要对象[1]。
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。
通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。
实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。
实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。
同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。
结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。
农杆菌转化原理及技术
农杆菌介导遗传转化的原理
❖ 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为发根农杆菌 （导致毛状根的发生）和根癌农杆菌（导致冠瘿瘤， 冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱）。
❖ 根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒 （Ti质粒）。
❖ 根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区（Vir区）、结合区 （Con区）、复制起始区（Ori区）和T-DNA区四个部 分，其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。
Bacterial T-plasmid produces receptors for acetosyringone
Plant wound produces acetosyringone
Produce callus transform callus stimulate shooting by cytokinin addition
复杂
复杂
简单
无
嵌合体比例
有
无
无
无
多
无
操作复杂性 简单
简单
复杂
复杂
复杂
简单
设备要求
便宜
便宜
昂贵
昂贵
ห้องสมุดไป่ตู้
昂贵
便宜
工作效率
高
低
低
低
高
低
单子叶植物
少
应用
可行
可行
可行
广泛
广泛
农杆菌介导法的优点
❖ 操作简便 ❖ 外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝 ❖ 转移DNA片段明确 ❖ 可转移大片段DNA ❖ 可直接用不同的植物组织进行基因转移
胚性愈伤
三、农杆菌介导转化水稻
❖ 1. 愈伤组织的预培养
❖ 选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒 状愈伤，转接到预培养培养基中，置于27℃暗培养 4天。
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利用gfp报告基因优化农杆菌介导的水稻遗传转化唐甜甜;李浩;段永波;李莉;陆徐忠;梁永亚;杨剑波【摘要】To improve the Agrobacterium-mediated transformation frequency of Japonica rice Wanjing 97, an orthogonal experiment L9 (33 ) was designed to optimize the factors regulating rice genetic transformation, and the impacts of innoculum OD600 , coculture temperature and coculture duration on transformation using gfp gene to monitor the expression of target gene were analyzed. Results showed that the optimal conditions for Agrobacterium-mediated transformation of Wanjing 97 were determined to be innoculum OD660 of 0. 1, cocultured at 21℃ -23 t dark for 72 h. Under this condition, the rate of gfp-positive calli was up to 70. 9% . The results suggested that gfp could be used as an effective reporter gene to improve rice genetic transformation.%为提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率,以晚粳97为转化材料,绿色荧光蛋白gfp基因为报告基因,采用正交试验L9(33)对影响农杆菌介导水稻的遗传转化因子进行优化.通过观察愈伤组织荧光表达情况,分析菌液浓度、共培养温度与共培养时间对农杆菌转化水稻的影响.结果表明,在OD660值为0.1、共培养21℃～23℃黑暗条件下,农杆菌与水稻愈伤共培养72 h,最有利于水稻的遗传转化,该条件下晚粳97 愈伤组织荧光表达率达到70.9%.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)001【总页数】4页(P88-91)【关键词】水稻;农杆菌;愈伤组织;绿色荧光蛋白基因;遗传转化【作者】唐甜甜;李浩;段永波;李莉;陆徐忠;梁永亚;杨剑波【作者单位】安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031【正文语种】中文【中图分类】S511;Q943.2水稻作为重要的粮食作物和遗传学研究的模式植物，其遗传改良一直受到人们的高度重视。
转基因技术是实现水稻品种定向改良的重要手段。
自1988年Zhang等［1］转化水稻原生质体获得成功以来，水稻转基因技术不断发展。
Hiei等［2］建立了农杆菌介导的水稻遗传转化体系，使水稻转基因技术更加趋于成熟和完善。
目前，农杆菌介导的转基因已作为水稻遗传转化的主要方法被广泛地应用到水稻的遗传研究和性状改良的实践中［3－9］。
在植物遗传转化过程中，通常采用报告基因来监测转化效率、跟踪外源基因在植物细胞中的表达情况。
目前使用的报告基因主要有荧光素酶基因(luc)［10］和β-葡萄糖苷酶基因(gus)［11］两类。
检测LUC表达时需要向试验材料内渗入荧光素;GUS组织化学检测时，需要昂贵的反应底物4－甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc);另外，这两种检测方法对植物材料都有破坏性，因此，在活体中的检测受到一定的限制，难以做到实时动态追踪［12］。
克隆于海洋动物水母体内的绿色荧光基因(gfp)是一种检测方便、适于活体观察、又不需要外源底物或辅助因子的报告基因。
Shimomure等［13］首先从多管水母中分离出荧光蛋白，Prasher等［14］成功地克隆了gfp基因，随后的研究指出:由于GFP含有特殊的六肽生色基团，可以在长波紫外灯下发出荧光，便于活体检测和显微观察。
gfp作为报告基因用于植物的遗传转化研究更是方兴未艾［15－17］。
本研究利用gfp作为报告基因，用农杆菌介导法对水稻品种晚粳97的成熟胚愈伤组织进行转化实验。
探索农杆菌菌液浓度、共培养温度与共培养时间等对水稻遗传转化的影响。
1 材料与方法1.1 材料粳型水稻品种晚粳97种子由安徽省农业科学院水稻研究所繁殖并保存。
用于组织培养及主要生化试剂购自Sigma公司。
1.2 质粒与菌株植物转化载体p35S∶∶bar-pUbi∶∶gfp-pRact1∶∶pmi由先正达生物科技(中国)有限责任公司惠赠。
农杆菌菌株为EHA105。
表1 水稻转化过程中所用的培养配方Table 1 Media and their compositionsfor rice transformation培养基成分(mg/L)诱导培养基 NB(N6 macro，B5 micro，B5 vitamins)+CH 300+Pro 500+Gln 500+2，4－D 2.0+sucrose3%+agar 0.8%，pH值5.8悬浮培养基 NB+2，4－D 2.0+As 39.6+CH300+sucrose3%，pH值5.2共培养基 NB+2，4－D 2.0+CH 300+Pro500+Gln 500+As 39.6+sucrose 3%+agar 0.8%，pH值5.8恢复培养基 NB+2，4－D 2.0+CH300+pro500+Gln 500+sucrose 3%+ agar0.8%+Carb250+Cefo200+KT1，pH值5.8筛选培养基 NB+CH3 00+Pro500+Gln 500+2，4－D 2.0+PPT 4.0+sucrose 3%+agar0.8%+Carb250+Cefo200+KT1，pH值5.8分化培养基 NB+CH300+Pro500+Gln 500+6－BA2.0+KT0.5+PPT2.0+sucrose 3%+Agar0.8%+Carb150+Trans-ZT1+IAA0.5，pH值5.8生根培养基 1/2 MS+NAA0.4+sucrose 3%+agar0.8%，pH值5.81.3 农杆菌介导水稻的转化1.3.1 外植体准备选取晚粳97成熟种子(饱满且无病斑)，去除颖壳后，用70%乙醇消毒1.5 min，再用25%次氯酸钠溶液(每100 mL加1滴Tween-20)消毒40 min，无菌水冲洗，滤纸吸干糙米表面的水迹，接种到诱导培养基(表1)上，每皿20粒，32℃光照培养7 d。
1.3.2 农杆菌菌液准备从冰箱取出冻存菌株，在YEP培养基(含10 mg/L利福平，100 mg/L壮观霉素)上划板，28℃暗培养2 d。
挑选单菌斑，再次划板，28℃暗培养，2 d后刮下菌斑至悬浮培养基中重悬分散，将菌液浓度调至OD660值0.1、0.2、0.3，分别用于愈伤组织的侵染实验。
1.3.3 共培养利用正交助手II V 3.1进行试验设计L9(33)，以农杆菌菌液浓度、共培养温度及共培养时间为因素，每个因素设置3个不同水平(表2)，3次重复。
挑选生长状态较好的愈伤组织，分别用不同浓度的农杆菌菌液侵染30 min，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面菌液，接种到铺有一层干燥滤纸的共培养培养基上，分别放置在19℃、21℃、23℃ 下共培养，共培养时间为24 h、48 h、72 h不等。
表2 正交试验设计［L9(33)］Table 2 Design of orthogonal experimental［L9(33)］实验组菌液浓度OD660 培养温度(℃) 共培养时间(h) 1 0.1 19 24 20.1 21 48 3 0.1 23 72 4 0.2 19 48 5 0.2 21 72 6 0.2 23 24 7 0.3 19 72 8 0.3 21 24 9 0.3 23 481.3.4 筛选将农杆菌侵染的愈伤组织转接到恢复培养基上，28℃暗培养5 d后，转到含有PPT的筛选培养基上，28℃下筛选培养(暗)28 d。
1.3.5 分化、生根挑取筛选到的抗性愈伤组织转到分化培养基上，28℃暗培养14 d后，移到30℃下光照培养(16 h光/8 h暗，强度4 000 lux)。
待分化幼苗长到2 cm左右，转至生根培养基上进行生根培养。
1.4 绿色荧光表达检测取农杆菌侵染后的不同时期的水稻材料(如抗性愈伤组织、分化再生苗等)，在荧光显微镜(Olympus-BX61)下(采用 Image-Pro Plus 6.0图像分析软件)统计观察gfp 基因的表达情况。
1.5 转化植株的PCR鉴定用CTAB法提取再生水稻植株叶片基因组DNA，用bar基因引物(序列为Forward:5'-ACAAGCACGGTCAACTTCC-3';Reverse:5'-ACTCGGCCGTCCAGTCGTA-3')进行PCR扩增检测，扩增反应程序为:95℃5 min; 94℃ 1 min，58℃1 min，72℃1 min，35个循环;72℃5 min。
1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，目的片段为175 bp。
2 结果与分析2.1 愈伤组织诱导水稻成熟种子在接入诱导培养基上32℃光照培养2 d后，种胚部位开始膨大，并有淡黄色的愈伤组织产生。
7 d后，有两种类型的愈伤组织产生，一种质地较硬，生长慢，呈浅黄色;另外一种质地较松散，颗粒状，鲜黄有光泽，生长状态良好。
挑选后者作为转化受体材料(图1)。
2.2 转化过程中对绿色荧光蛋白基因的实时检测愈伤组织和农杆菌共培养数小时后，在荧光显微镜下就看到微量荧光点，表明已有gfp基因进入水稻细胞瞬间表达。
愈伤组织转到恢复培养基后，荧光范围扩大。
愈伤筛选14 d至28 d在荧光显微镜下能明显观察到绿色荧光，而且随着时间的增加，绿色荧光的范围逐渐扩大(图2、3)。
将抗性愈伤组织转入分化生根培养基后，获得的转化幼苗在荧光显微镜下也激发出绿色的荧光(图4)，这说明gfp基因稳定转化了水稻细胞，并实现了组成性表达。