生物固氮测定方法研究进展word
人工合成微生物固氮技术的研究现状
人工合成微生物固氮技术的研究现状随着人类社会的不断发展，人们对于农业生产和粮食安全的需求也日益增加。
其中，农作物的氮素需求量尤为关键。
于是，人们开始探究一种新的方法——微生物固氮技术。
微生物固氮技术是什么？微生物固氮技术是指利用一些可以独立生存的微生物，将氮态氮固定成大分子化合物，以提供农作物的氮素营养。
这一技术的核心是细菌通过转化生物大分子，将空气氮气转化为可供植物利用的氨态氮、亚硝酸态氮和硝酸态氮，从而达到提高作物产量的目的。
人工合成微生物固氮技术的研究现状当前，人工合成微生物固氮技术已经成为了固氮领域的一个重要研究方向。
国内外不少科研机构都在开展相关的研究工作。
首先就是在前沿科技领域——合成生物学领域，不断涌现着具有微生物固氮能力的新型生物。
例如，美国农业部2018年曾发表一篇论文介绍了一种新型的光合细菌——Rhodobacter sphaeroides，它在细菌界中具有很强的氮固定能力。
然而，这种细菌的分离和培养非常困难，因此，科学家们经过多年的探究，利用基因编辑技术和基因拼接技术，成功合成了带有Rhodobacter sphaeroides关键氮固定基因的新型微生物，从而形成了一项全新的微生物固氮技术。
其次，很多国内外大学都在开展微生物固氮的新型研究。
例如，中国农业大学生命科学学院的蒲龙教授团队一直在从事微生物固氮、根瘤菌与大豆互作等领域的研究。
他们也成功构建了一些新型的微生物固氮功能模块，并进行了一系列的检测和验证工作。
不仅如此，还有很多与微生物固氮技术相关的领域也在紧锣密鼓地开展着相关研究。
例如，一些光合细菌的应用研究、土壤微生物种群结构与功能变化的研究等等，都具备着推动微生物固氮技术实现更大突破的潜力。
微生物固氮技术的应用前景由于微生物固氮技术具有很高的氮转化效率、高附加值和环境友好度等优点，因此其在土地修复、农业生产等领域的应用可谓是无限广阔。
首先，微生物固氮技术能够辅助农业进行有机化生产。
生物固氮的研究进展及发展趋势
生物固氮的研究进展及发展趋势
生物固氮是一种自然界中重要的氮循环过程，其在农业和生态系统中具有重要的意义。
研究生物固氮的进展以及未来的发展趋势，对于提高农作物产量、节约化肥资源、增加土壤肥力以及保护环境都具有重大意义。
近年来，生物固氮的研究取得了一系列重要的进展。
首先，对于固氮微生物群落结构和功能的理解不断深化。
通过使用分子生物学技术，可以快速检测和鉴定土壤和根际中的固氮微生物，了解它们的多样性和分布情况。
此外，通过基因组学和转录组学等方法，可以深入研究固氮微生物的基因表达和代谢途径，进一步揭示其固氮机制。
其次，关于如何提高固氮效率的研究也取得了进展。
通过选择性培育具有高效固氮能力的微生物或植物品种，可以显著提高固氮效率。
同时，研究表明，与其他生物有机肥料和化学肥料的联合使用可以进一步提高固氮效率。
此外，通过调控固氮微生物与宿主植物的共生关系，可以提高植物对固氮微生物的利用效率。
在生物固氮的未来发展中，一方面，研究人员将继续深入探索固氮微生物的多样性和功能，通过开展元基因组学和功能基因组学研究，预期会发现更多新的固氮微生物。
另一方面，研究人员将努力开发新的技术和方法，以提高固氮效率。
例如，通过基因编辑和代谢工程等手段，改良固氮微生物的代谢途径和固氮酶的催化效率。
此外，研究人员还将关注固氮微生物与植物之间的信号交流和共生调控机制，以更好地控制和利用生物固氮过程。
综上所述，生物固氮研究取得了不少进展，并且未来的发展趋势也比较明确。
通过深入研究固氮微生物群落结构和功能，以及努力提高固氮效率，我们有望实现更加可持续和高效的氮肥利用，在农业生产和环境保护中发挥重要作用。
生物固氮测定方法研究进展word
生物固氮测定方法研究进展2016051848 黄鹏摘要:对生物固氮测定的方法乙炔还原法(A R A)、15N同位素稀释法(I D)、、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法进行综述,并评述了其引起误差的因素和测定结果的准确性。
关键词:生物固氮;固氮量;测定;方法目前,固氮测定技术对于生物固氮研究是十分重要的。
随着研究的深入,固氮测定技术也不断地向准确、可靠、操作简便的方向发展。
生物固氮测定方法主要有乙炔还原法、、15N同位素稀释法、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法等。
为便于更好研究生物固氮, 本文主要介绍常用的几种测定方法以及它们的优缺点,以供参考。
1乙炔还原法始于20世纪60 年代, 目前被广泛应用,根据固氮酶具有还原分子氮或利用其他底物的能力,使乙炔还原为乙烯,作为固氮的间接测定。
从植物根际分离的纯培养物分别接种于盛有无氮半固体培养基的血清小瓶中,置于28 ～30 ℃培养箱中培养48 h ,将血清小瓶瓶盖在无菌条件下换成橡胶塞,用无菌注射器抽出10 %的气体, 每瓶注1 mL C2H4,,再置于28 ～30 ℃下培养24 ～48 h。
用无菌注射器从瓶种抽取混合气体0 .2 m L 注入气相色谱仪(GC)进样柱中, 测定C2H4含量。
其中,以不接种菌注有C2H2的血清小瓶为对照, 重复 3 次。
从显示屏上C2H2、C2H4峰值判定有无C2H4的产生以确定其固氮性能, 按下式计算其固氮酶活性大小。
A RA =（实际C2H4峰面积×标准气含量×血清小瓶容积∕（标准气峰面积×进样量×培养时间×样品量）。
主要仪器：SP一02型气相色谱仪和氢离子化鉴定器。
该方法优点是灵敏度高,操作较简单,速度快、费用较低,可快速确认固氮作用的存在与否。
并通过还原乙炔活性的强弱，推算出植物——— 固氮菌联合体的固氮量、适应范围广,可以离体,也可以整株活体连续测定或原位测定。
生物固氮的研究进展
可形成联合固氮体系 并且形成联合固氮体系的高 产生自身固氮能力 从而可节约生产氮肥投资的 ９０
梁根量增加 ２９ 根体积增加 ３９ 籽粒增产 １８％［１１］
以上［１４］
李季伦等对从我国土壤中分离出来巴西固氮螺菌
目前 对固氮根瘤菌及其宿主植物的基因组
Ｙｕ６２ 进行了多方面研究［１２］ 铵对该菌固氮酶活性的 功能基因组和蛋白质组研究工作正在蓬勃开展 在
Research Progress on Biological Nitrogen Fixation Ci En, Gao Ming
(College of resource and environment, Southwest Agricultural University, Chongqing, 400716, China)
氮效率的基因工程根瘤菌肥而投放到国际市场 与
目前对联合固氮菌研究的重点 一方面是对菌株 粮食作物联合固氮的固氮螺菌的固氮调控机制研究
进行遗传改造 筛选出具有高细胞密度 同时又能 也已逐步明朗 为构建铵阻遏条件下也能固氮的基
大量分泌 ＮＨ４＋的联合固氮菌，使之能与外界环境抗 因工程菌株打下了理论基础 最近 对以苜蓿根瘤
原核微生物（细菌和蓝藻） 微生物学中的基因重组
ＮＯ４０ 多糖芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ｓｐ．）和根 和细胞融合等遗传操作新技术为改造生物提供了强
瘤菌后 功能叶中氮 磷 叶绿素含量以及生物学 有力的手段 对于固氮微生物来说 固氮基因 ｎｉｆ
产量均明显提高
操纵和调节固氮酶 Ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ 的合成 从而使
对生物固氮调控有重要意义 也是对基因表达调控 转移 底物结合与还原 铁蛋白－２ＭｇＡＤＰ 复合物与钼
生物固氮研究报告
生物固氮研究报告
标题：生物固氮研究报告
摘要：
本研究报告探讨了生物固氮的过程、机制以及其在农业生产中的应用。
生物固氮是指一种过程，通过该过程，某些生物能够将大气中的氮气转化为可供植物利用的形式，从而满足植物的氮营养需求。
这一过程对于生态系统的氮循环具有重要意义，也对农业生产的可持续发展起到了至关重要的作用。
研究方法：
本研究使用田间实验方法，选择了几种生物固氮相关的微生物和植物进行观察和研究。
通过收集土壤样本和植物根系样本，并进行实验室分析，以评估这些微生物在土壤中固氮的能力以及它们与植物的共生关系。
同时，也进行了田间试验，观察不同固氮微生物对作物生长和氮肥利用的影响。
研究结果：
研究表明，生物固氮的能力在不同微生物和植物之间存在差异。
一些固氮微生物，如根瘤菌和蓝绿藻，能够与植物建立共生关系，并通过将氮气固定为植物可利用的铵态氮来提供植物所需的氮营养。
这对于减少对化学氮肥的依赖，提高土壤质量和农产品质量具有重大意义。
此外，研究还发现，通过优化固氮微生物的应用方式和施肥管理措施，能够进一步提高生物固氮的效果。
结论：
生物固氮是一种可行的方法，用于实现农业生产的可持续发展。
通过建立良好的共生关系，利用固氮微生物将大气中的氮转化为植物可利用的形式，可以减少对化学氮肥的需求，减少对环境的负面影响，提高土壤质量，并提高农产品的产量和品质。
未来的研究应进一步深入了解生物固氮的机制，并探索更有效的固氮微生物应用方式。
微生物固氮及其应用研究
微生物固氮及其应用研究随着环境污染和气候变化的加剧，农业生产面临着极大的压力。
为了提升粮食产量和生态环境的可持续性，农业科学家们不断探索新的技术和方法。
其中，微生物固氮技术被认为是一种非常有前途的技术。
本文将介绍微生物固氮的基本概念、机制及其应用研究。
一、微生物固氮的基本概念与机制微生物固氮是指一些特定的微生物能够利用氮气（N2）和氢气（H2）在高压和高温条件下生成氨（NH3）。
其中，氮气起到了提供N原子的作用，而氢气则是还原剂。
微生物固氮的机制可以概括为以下三个步骤：1. 氢化：氢气通过费托合成反应与氮气结合成亚氨基化合物（NH2）。
N2 + 3H2 → 2NH32. 还原：亚氨基化合物经过还原生成氨。
NH2 + H2 → NH3 + H2N3. 电子转移：负电荷的氢离子（H-）通过电子传递从一种还原物质转移到另一种还原物质。
NH3 + H2N → NH4+微生物固氮的机制非常复杂，其不同微生物之间的固氮能力也存在差异。
比如，霍乱弧菌能够利用氮气固氮，但是其固氮能力相对较低。
相反，一些根瘤菌具有良好的固氮能力。
二、微生物固氮的应用研究微生物固氮技术在农业生产中有着广阔的应用前景。
一方面，它可以作为农业生产的重要手段，提高农作物的产量和品质；另一方面，它还可为环境保护、可持续发展等领域提供支持。
1. 农业生产微生物固氮可以为农作物提供充足的氮素，进而提高作物品质和产量。
一些根瘤菌被广泛应用于豆科作物的生产中，如大豆、豌豆、菜豆等。
比如，在大豆生产中，根瘤菌能够促进大豆的根系生长，提高土壤中氮素的利用率，增加大豆产量并改善其品质。
2. 生态环境保护微生物固氮技术还可以改善土壤质量。
由于目前大量使用化肥等农业生产方式对土地造成了严重的污染，因此采用微生物固氮技术可以减少农业生产对土地的污染。
此外，微生物固氮还可以固定空气中的氮气，并将其转化为有机氮，补充土壤中的氮素，从而减少了对化肥和农药的依赖。
3. 可持续发展微生物固氮技术支持可持续农业发展。
海洋蓝细菌生物固氮的研究进展
第20卷第3期2005年3月地球科学进展ADVANCES I N E ART H SC I ENCEVol.20 No.3Mar.,2005文章编号:100128166(2005)0320312208海洋蓝细菌生物固氮的研究进展3侯建军1,2,黄邦钦1(1.近海海洋环境科学国家重点实验室,厦门大学环境科学研究中心,福建 厦门 361005;2.湖北民族学院医学生物化学教研室,湖北 恩施 445000)摘 要:海洋生物固氮是海洋中氮循环的重要过程,其对海洋吸收CO2有着重要的影响。
海洋固氮蓝细菌的种类和数量也有待进一步探明。
现今的研究已表明,蓝细菌对海洋的氮平衡和生物生产有着重要的贡献。
从海洋生物固氮的研究现状和研究方法着手,阐述了海洋生物固氮的意义,并重点对影响海洋生物固氮的因素、海洋蓝细菌生物固氮的生物化学和分子生物学机制等研究方面做了细致的综述,在此基础上提出了海洋生物固氮方面有待深入研究的科学问题,旨在为海洋生物固氮及氮的生物地球化学研究提供基础资料。
关 键 词:蓝细菌;固氮;氮循环;检测方法;影响因子中图分类号:Q178153 文献标识码:A 生命的维持和延续不仅需要能量,而且还必需各种物质,其中,蛋白质和核酸是构成生物体的主要成分,而氮是构成蛋白质和核酸的重要元素[1]。
生态系统的氮循环是气体型的生物地球化学循环(bi ogeoche m ical cycle),固氮是其重要过程[2]。
迄今已知的能固氮的生物多属于原核生物,固氮生物分为2大类:①能独立生存的自生型固氮微生物,分为细菌和蓝藻两类;②与其他植物或动物共生的共生型固氮微生物。
陆生和水生植物以氨和硝酸盐的形式吸收氮,将它转化为氨基酸或核酸,然后又转化为消费者动物的相关成分[1,2]。
氮循环在生态系统中是一个相当完全的自我调节系统,形成动态平衡[2～4]。
溶解在海水中的氮如何被生物体利用的问题曾困扰海洋学家达数十年之久。
科学家发现了一些海洋细菌可以固定大气中的氮。
微生物固氮机制的研究现状和新进展
微生物固氮机制的研究现状和新进展微生物的固氮能力是构建土壤氮素循环的关键，也是维持生态平衡的重要组成部分。
微生物通过各自的固氮途径将空气中的氮气转化成化学物质，为植物提供必要的营养素。
随着科技的不断进步，对微生物固氮机制的研究也取得了一些重要的发现和进展。
近年来，单细胞生物氮素转化机制的研究成为了固氮领域的热点。
以著名的单细胞固氮菌为例，其通过形成分裂小体的方式实现了分子固氮。
该过程过程中，由ATP酶驱动，集中在夹层腔中的谷氨酸合酶将加入氢原子的氢气与植物活塞内的电荷负载原子氮相结合，形成氨基基团后输出。
而其他的单细胞生物固氮菌则采用了不同的机制。
在多细胞生物领域，共生关系的研究成为了新的热点。
一些微生物通过与植物的共生关系，在植物根际创建适宜的微环境，为氮固定提供优越的条件。
同时，这些微生物还可通过其他途径来获得生存空间、水、光和其他营养物质等。
此外，一些研究也表明固氮能力可以通过基因改造来提高。
科学家通过人工合成新的代谢途径和调节代谢路径，成功地创建了一些高效型固氮细菌，使微生物的固氮能力得到了大大提升。
这项技术的应用在很大程度上为农业生产和生态保护带来了新的机遇。
但是同时，我们也不能忽视微生物固氮机制研究所面临的众多挑战。
除了单细胞生物和共生关系的研究，还有很多与微生物固氮相关的基因、生理和环境条件等等都需要深入探讨，以更好地理解微生物固氮机制的本质。
迄今为止，微生物固氮机制的研究没有结束，而是不断在进化和创新中发展。
对微生物固氮机制的深入探索不仅能够为理解生态系统提供基础知识，同时还将有益于开发新的农业技术和环境保护方法。
中国生物固氮研究现状和展望
中国生物固氮研究现状和展望沈世华荆玉祥*(中国科学院植物研究所中国科学院光合作用和环境分子生理学重点实验室, 北京100093. *联系人, E-mail: yxjing@ )摘要生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一, 它在生产实际中发挥着重要作用: 为植物特别是粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少水土污染和疾病、防治土地荒漠化、建立生态平衡和促进农业可持续发展. 本文在介绍国际生物固氮研究进展的同时, 着重叙述了生物固氮研究取得的重大进展和成果: 收集了根瘤菌资源, 建立了最大的数据库, 修正和发展了国际上对根瘤菌的分类; 发现了固氮基因, 证实了克氏杆菌固氮基因操纵子的连锁性及正调控基因的调节机制和对氧、温度的敏感性; 发现苜蓿根瘤菌结瘤调控基因nodD3的产物对结瘤基因表达的启动不受宿主类黄酮的作用; 发现苜蓿根瘤菌的碳利用基因和固氮生物氮代射和碳代谢基因表达及其调节的偶联作用; 化学合成了根瘤菌的结瘤因子; 在固氮基因表达调节基础上, 构建了固氮基因工程菌株, 并在生产中得到应用; 提出了化学模拟固氮酶的结构和功能, 固氮酶活性中心的模型和合成了模型化合物, 受到了国际高度评价. 根据国际上研究的趋势并结合国内的研究进展, 提出了生物固氮研究的发展方向, 建议在联合(内生)固氮菌固氮基因调控及其提供氮素的作用, 根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮的信号传递和分子相互作用, 氮、碳代谢和固氮与光合作用的偶联与共生结瘤固氮中功能基因组学等方面展开积极研究.关键词固氮生物固氮酶基因表达化学模拟微生物与植物相互作用功能基因组空气中约80%的氮气不能被植物直接利用, 只有固氮微生物具有将氮气转化成氨的能力, 人们称为生物固氮. 据联合国粮农组织(FAO)1995年粗略估计, 全球每年由生物固定的氮量已近2 × 106t(相当于4 × 108 t尿素), 约占全球植物需氮量的3/4. 所以, 生物固氮是地球上最大规模的天然氮肥工厂. 但是, 迄今为止所发现的绝大多数固氮微生物均不能在粮食作物水稻、小麦、玉米以及多种果树、蔬菜上固氮, 即使少数可以的话, 其固氮量也很少, 所以这些植物的高产不得不依赖化学氮肥. 30年后我国人口将达到16亿, 年需粮食6.4 × 108 t, 总计需尿素64 × 108 t. 按此需要, 至少还要新建很多氮肥厂, 投资上千亿元. 一方面, 适量使用化学氮肥可使粮食高产; 另一方面, 生产化学氮肥要大量消耗能源, 加重大气污染和温室效应. 大量施用化肥, 不仅提高农业生产成本, 而且导致水土污染, 影响健康和破坏生态平衡. 对于提高农业产量, 降低化肥用量和农业生产成本, 减少水土污染和疾病, 治理占我国国土面积约27%的荒漠化地区, 发展可持续农业, 生物固氮将起重要作用.研究生物固氮的作用机制有3个目的: (1) 提高固氮效率, 在理论上阐明影响固氮效率的原因, 在生产实际中提出有效措施; (2) 在研究根瘤菌与豆科植物相互作用和共生固氮的基础上, 扩大根瘤菌的宿主范围, 使其能在非豆科植物, 特别是主要粮食作物上固氮, 或将固氮基因转移到非豆科植物上, 实现其自主固氮; (3) 在研究固氮酶结构与功能的基础上, 进一步探讨化学模拟固氮酶作用机制, 发展化学催化理论, 改革目前合成氨工艺, 提供廉价氮肥.生物固氮是生命科学的重大问题之一, 是跨世纪的研究课题. 在当前生命科学的发展中由于基因组学和功能基因组学的建立和高新技术的创新, 又赋予生物固氮研究新的内涵和研究策略, 为实现固氮研究的目标增添了新的动力.本文叙述生物固氮的研究现状和发展, 着重介绍我国的研究概况和取得的成果, 并结合当前生命科学的进展, 展望生物固氮研究的前景.1生物固氮的研究现状当前, 国内外生物固氮研究已进入一个新阶段, 其特点是多学科交叉, 将基础研究和应用前景相结合, 开拓了思路. 当前生物固氮研究正在分子和原子水平上开展, 如: 固氮基因表达的铵阻遏和氧敏感机制; 共生结瘤固氮中植物与微生物相互关系的基因表达和调控; 根瘤菌结瘤因子的结构和生物合成; 根瘤菌及其宿主植物的基因组学、转录组学和蛋白质组学; 固氮酶的结构和功能及其化学模拟; 固氮效率的提高及其在农业和环境保护中的应用等. 这些研究要求生物学、农学、化学和物理学等学科的交叉和结合, 引入新概念和新技术, 综合进行.1.1固氮资源的发掘和应用生物固氮系统分为根瘤菌与豆科植物的共生结瘤固氮系统、联合(包括内生)固氮系统和自生固氮系统. 在共生固氮系统方面, 世界上有豆科植物19700种, 其中已知可以结瘤固氮的有2800多种, 占15%, 而对其共生固氮体系进行过研究的只占0.5%[1]. 不少国家, 特别是美洲和非洲国家, 积极发展种植大豆或其他豆科植物(美国大豆播种面积约占30%), 以发挥生物固氮作用, 减少化学氮肥用量, 取得了明显的经济效益. 在对联合(内生)固氮系统的研究中, 发现禾本科植物甘蔗内有内生固氮菌, 以光合产物为能源进行固氮, 可为甘蔗提供60%的氮素[2]. 这一发现为进一步开发联合(内生)固氮体系提供了突破空间和潜在的应用前景. 在自生固氮体系中, 发现一株嗜热放线菌(Streptomyces thermoautotrophicus)有耐氧的固氮酶[3], 为最终通过转基因手段实现非豆科植物自主固氮提供了可能的突破点.我国传统农业耕作过程中采用豆科植物与其他农作物套种、轮作等手段改良土壤环境, 提高农作物产量. 当前, 苜蓿等豆科植物在我国西部地区的开发及开展生态农业、退耕还林还草过程中正起着不可替代的作用. 我国共有豆科植物约1400多种. 多年来, 我国科学家以豆科植物根瘤菌为重点, 逐步摸清了我国豆科植物的根瘤菌资源, 进行了系统分类, 发现了一些新属、新种[4~7], 并建立了我国最大的根瘤菌数据库. 其中一个重要的发现是, 一种植物在不同的生态环境可与多种根瘤菌共生, 例如我国的大豆可与3个属、7个种的根瘤菌共生固氮, 而一种根瘤菌(如海南根瘤菌Rhizobium hanaese)可从13 属14种豆科植物的根瘤中分离. 其他很多植物与根瘤菌的关系也是如此. 这一研究说明豆科植物与根瘤菌共生的多样性, 修正并发展了传统的根瘤菌“寄主专一性”和植物“互接种族”的概念. 将为利用现代基因组学、功能基因组学和蛋白质组学手段, 探索最佳的结瘤固氮模式和微生物与植物相互作用的机理提供良好的研究材料.1.2生物固氮调控机理及植物与微生物的相互作用用自生固氮菌——克氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae) 研究固氮基因及其表达和调控机理, 有很多开创性工作, 如发现了固氮基因nifC,7个固氮基因nif操纵子连锁以及正调控基因nifA的调节机理及其对温度和氧的敏感性[8~10]. 豆科植物与根瘤菌之间的分子对话机理研究有了重大进展. 在能量供应方面, 弄清了根瘤菌在豆科植物根瘤中依靠植物提供四碳二羧酸糖作碳源用于固氮, 并发现了dctABD基因[11]; 重组根瘤菌已经构建成功, 并用于提高固氮效率[12,13]; 与粮食作物联合固氮的固氮螺菌(Azospirillum brasilence Yu62)的固氮调节机理也已逐步明朗, 为构建铵阻遏条件下也能固氮的基因工程菌株打下了理论基础[14]. 我国科学家在深入研究正调节基因(nifA)的表达及其产物(NifA)活性调节机制的基础上, 构建了不受铵阻遏的组成型表达的nifA质粒, 将其引入大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonica)和阴沟肠杆菌(Enterbacter cloacae)后, 固氮作用不受铵阻遏[15~19]. 用此基因工程菌株接种水稻可以增产[20,21]. 此外, 还开展了固氮基因负调节基因(nifL)的研究[22,23]. 我国分离的巴西固氮螺菌Yu62的固氮酶基因表达和活性双重调节机制研究已经比较清楚, 为构建耐铵泌铵的基因工程菌株和降低玉米化肥用量提供了理论基础[24~26]. 田间实验结果有实效, 施用工程菌株比不施用的对照增产21.1%, 比野生型菌剂增产8.5%. 在相同产量水平下可降低20%的氮肥使用量. 在共生固氮体系结瘤固氮基因表达调节研究的基础上, 发现苜蓿根瘤菌结瘤基因nodD3的表达不受苜蓿类黄酮物质的启动[27,28], 为扩大根瘤菌的宿主范围提供了理论根据. 同时, nodD3基因表达受到两个启动子的控制[29], 第2个启动子可以被NtrC激活[30]; 化学合成了苜蓿根瘤菌的结瘤因子[31]; 根据宿主植物对根瘤菌识别因子和固氮嫌氧机制的研究, 将豆科植物的凝集素基因和血红蛋白基因转入烟草和水稻, 获得基因表达, 为进一步研究非豆科植物和根瘤菌侵染的关系奠定了技术基础[32,33]. 近年来, 我国开展了特有的华癸根瘤菌(Sinorhizobium huakui)结瘤固氮基因表达调节的研究[34,35], 发现了微生物体内碳代谢与固氮及氮代谢的基因表达调节之间存在着偶联关系[36,37]. 这一发现不仅对生物固氮调控有重要意义, 也对基因表达调控基础研究有重要贡献, 为进一步研究光合和固氮之间的偶联提供了理论基础.1.3固氮酶的生物化学特性及其化学模拟国际上已经对固氮酶高分辨率的空间结构进行了研究, 阐明了其活性中心的原子簇FeMoco及其周围蛋白分子的三维结构[38,39]. Schmid等人[40]对棕色固氮菌缺失FeMoco的突变种nifB-Av1的钼铁蛋白组分做了晶体衍射结构分析, 发现4个亚单位中的1个构象发生了较大变化, 存在一个带正电的漏斗状(funnel)结构, 它足够容纳带负电的FeMoco的插入, 成为具有固氮功能的钼铁蛋白组分. 与此同时, 化学模拟固氮酶在温和条件下合成氨有了很大进展[41]. 在这个领域里我国也做了大量非常出色的工作: 固氮酶催化HD的形成绝对依赖于氮[42]; 在固氮酶催化还原N2的放氢机制中, 率先提出了双位点放H2模式, 对了解固氮酶催化机制有所发展[43]. 美国1992年用X光衍射确定固氮酶活性中心原子簇是由MoS3Fe和FeS3Fe3两个缺口的立方烷型簇合物组成[38], 通过3个非蛋白配体S桥联而成为一个笼(其顶端分别是Fe和Mo). 其实在此之前, 我国就已经合成了这两个簇合物[44]; 根据配位催化原理和化学探针思路, 提出活性中心原子簇笼应是活口的, N2还原成氨和质子还原成H2都是在笼内进行, 提出用于还原底物有两条质子通道的设想[45~47]. 这些进展对指导合成高效催化剂, 实现在温和条件下固氮有重要意义.1.4我国生物固氮研究成果的国际认可和曾经面临的困境“生物固氮”成为科学定义并开始大力研究已有114年的历史. 我国自1937年开始生物固氮研究, 已有65年历史. 20世纪70年代生物固氮研究在生物化学和分子遗传学等方面取得突破后, 我国也取得了一系列重要成果, 在国际上占有一定的地位, 在某些方面还具有重要影响. 因此, 国际生物固氮研究委员会主席W. Newton曾多次建议在中国召开国际生物固氮研究大会, 经研究决定2003年在北京召开第14届国际生物固氮大会.我国生物固氮研究的道路曲曲折折, 曾经有两种错误认识: 一是受到假冒伪劣生物固氮肥料的宣传的干扰, 认为生物固氮问题已经解决; 二是对国际和国内生物固氮研究的突破性进展了解不够, 认为难度大, 进展甚微, 国内经多年研究也未出成果. 两者的结果使我国的生物固氮研究面临严重困境.为防止困境再现, 经我国有关决策者和研究人员的共同努力, 恢复了固氮研究应有的地位. 这就为巩固研究成果, 继续发展, 不失时机地迎接生物固氮的重大突破的新时代的到来, 并把生物固氮研究中与生命科学其他学科相关的重大科学问题提高到一个新水平, 使其进一步为我国农业可持续发展做出重要贡献.2生物固氮研究的展望根据国际上生物固氮研究的发展和我国的具体情况, 我国生物固氮研究应着重下列几个方面.2.1联合(内生)固氮菌固氮基因调控及其在提供氮素中的作用联合或内生固氮菌大多数是自生固氮菌, 其固氮作用大小极易受外界环境因素(氧、铵、温度等)的制约. 在自然状态下有些固氮菌与植物有着松散的联合, 或进入植物成为内生菌, 这就为进一步利用这些固氮生物给植物提供氮素创造了更多的机会. 在研究固氮基因表达和调控的基础上, 有针对地进行固氮菌的遗传改造, 构建高效的固氮菌株, 以提高固氮效率, 减少化肥施用, 为作物提供更多的固氮量[13,14,20,21].2.2根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮的信号传递和分子相互作用豆科植物共生固氮由于其固氮作用的高效率, 始终是生物固氮研究的焦点之一. 根瘤菌与豆科植物之间的信号传递、相互识别、基因的顺序性表达和调节对根瘤的形成、发育和固氮作用的大小等有着错综复杂的联系. 苜蓿根瘤菌和苜蓿的共生结瘤固氮是共生固氮的模式系统, 研究最为集中, 但仍然有很长的路要走. 如果考虑到地区不同和自然环境的差异, 即使是同一模式系统也会有不同的差异表现, 更何况还有特异的共生固氮系统? 在分子水平上阐明两者相互作用的机理, 一方面旨在提高共生固氮的效率, 另一方面还可以为扩大根瘤菌宿主范围, 为实现粮食作物共生固氮提供理论依据和技术措施.2.3氮、碳代谢和固氮与光合作用的偶联氮、碳代谢是一切生物最基本的代谢作用, 而且是相互联系的. 固氮作用需要消耗作为能源的碳源. 植物共生固氮中固氮作用的能源直接来自光合作用. 固氮生物有选择性地利用碳源, 其中以四碳二羧酸糖的利用较好. 固氮生物在氮、碳代谢的基因表达中, 分别利用RNA聚合酶的σ54和σ70. 碳代谢调控蛋白CRP(carbon receptor protein)与结合在启动子上的σ54相互作用, 使依赖σ54的dctA和glnAp2等基因启动子的表达受到抑制[36,37], 其结果就在分子水平上将氮、碳代谢联系起来. 最近研究证明, CRP-cAMP同样抑制肺炎克氏杆菌nif基因的表达, 而且其抑制作用的大小与启动子上有无潜在的CRP结合位点直接相关[48,49].豆科植物是C3植物, 固氮作用需消耗光合作用能量的10%, 因此减产达5%, 固氮不增产[50]. 虽然在大豆根瘤菌中增加nifA正调控基因的拷贝数, 可以提高固氮作用, 增加产量[51,52], 但仍然需要植物提高光合作用效率, 才能满足既不施或少施氮肥, 又能达到增产的目的. 如何提高豆科植物的光合作用效率, 是光合作用和固氮作用的共同研究问题. 现有报道表明, 通过诱变获得高光效的大豆品种, 产量可提高30%左右[53]. 这一品种将为固氮和光合偶联研究提供了材料. 另一途径是通过转基因技术将C4植物的基因转入豆科植物, 使其变成C4植物. 这种可能性是存在的, 最近已经将玉米光合作用C4途径的基因转入水稻, 获得高光效增产幅度较大的转基因水稻[54~56], 这为获得C4豆科植物提供了借鉴.2.4共生固氮中包括蛋白质组学在内的功能基因组学研究共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究包括根瘤菌和宿主植物两个方面. 功能基因组学研究的前提是对目的生物的基因组进行全序列分析. 目前国际上已经对苜蓿根瘤菌基因组进行了全序列分析[57], 接着是大豆根瘤菌和百脉根根瘤菌(Rhizobium loti)基因组. 在宿主植物方面已经启动了对苜蓿Medicago sativa Lin)、大豆(Glycine max Lin)和百脉根(Lotus corniculatu)基因组序列的分析[58~60]. 这些研究成果将为固氮功能基因组和蛋白质组学研究奠定基础和建立技术平台. 目前, 固氮功能基因组和蛋白质组学已经陆续有所报道[61~63]. 固氮资源生物多样性研究表明, 不同根瘤菌可与同一豆科植物相互作用结瘤固氮, 但它们之间的结瘤固氮效率却大不相同. 同样, 同一根瘤菌可与不同属的豆科植物结瘤固氮[64]. 这一结果为开展共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究奠定了基础. 可以充分利用公布的苜蓿根瘤菌基因组序列, 通过RNA 和蛋白质差异显示法和微阵列法, 对不同苜蓿根瘤菌基因组及其突变株在共生条件下进行功能比较, 对不同根瘤菌在同一豆科植物结瘤的不同根瘤素基因表达进行比较, 将可大大推进共生结瘤固氮中微生物与植物相互作用机理的研究. 在此基础上, 还可寻找非豆科植物, 特别是禾本科植物中是否有以及有多少类似于豆科植物的根瘤素存在, 从而最终为非豆科植物的共生固氮和自主固氮提供策略和技术路线. 无疑, 共生固氮功能基因组和蛋白质组学研究将具有更为重大的科学意义和潜在的实际意义.致谢感谢沈善炯、李季伦和朱家壁教授对文稿的建议和修改及林敏、陈文新、周朝晖等教授所提供资料. 本工作为国家重点基础研究发展规划资助项目(批准号: 2001CB108904).参考文献1 Denarie J, Roche P. 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生物固氮的研究进展
生物固氮的研究进展一、本文概述生物固氮，指的是生物体（特别是某些微生物）在无氧或低氧条件下，将大气中的氮气（N₂）转化为氨（NH₃）或其他含氮化合物的过程。
这一过程对于全球氮循环和生物圈的氮素供应具有至关重要的作用。
本文旨在概述生物固氮的研究进展，包括固氮微生物的种类与特性、固氮机制、固氮效率的提高方法，以及生物固氮在农业、环保和工业生产等领域的应用前景。
我们将重点介绍近年来在分子生物学、基因工程和生物技术等方面的新发现和新进展，以期为推动生物固氮的深入研究和实际应用提供参考。
二、生物固氮的微生物学基础生物固氮，又称生物氮固定，是指某些微生物在常温常压下，将大气中的氮气（N₂）转化为氨（NH₃）或其它含氮化合物的过程。
这一生物过程在地球氮循环中起着至关重要的作用，为许多生态系统和农作物提供了必要的氮源。
生物固氮的微生物主要包括两大类：自生固氮菌和共生固氮菌。
自生固氮菌，如圆褐固氮菌，能够在无植物存在的情况下独立进行固氮作用。
而共生固氮菌，如根瘤菌，必须与植物形成共生关系，在植物根部形成根瘤结构，才能有效固氮。
固氮过程的核心是固氮酶的作用。
固氮酶是一种由铁蛋白和钼铁蛋白组成的复合酶，能够在ATP的供能下，将N₂还原为NH₃。
这一过程中，铁蛋白起到传递电子的作用，而钼铁蛋白则是固氮反应的催化中心。
固氮微生物具有独特的生理生态特性，以适应其在各种环境条件下的固氮生活。
例如，它们能够分泌多种胞外酶，分解有机物质以获取能量和营养；同时，它们还能够形成特殊的细胞结构，如根瘤，以提高固氮效率。
固氮效率受到多种因素的影响，包括环境因素（如温度、湿度、光照等）、土壤条件（如pH值、有机质含量等）以及微生物自身的遗传特性。
因此，在农业生产中，通过调控这些因素，可以有效提高生物固氮的效率和效果。
随着分子生物学和基因工程技术的快速发展，对固氮微生物的遗传机制和固氮酶的作用机制有了更深入的了解。
这为通过基因工程手段改良固氮微生物、提高其固氮效率提供了可能。
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生物固氮测定方法研究进展
2016051848 黄鹏
摘要:对生物固氮测定的方法乙炔还原法(A R A)、15N同位素稀释法(I D)、、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法进行综述,并评述了其引起误差的因素和测定结果的准确性。
关键词:生物固氮;固氮量;测定;方法
目前,固氮测定技术对于生物固氮研究是十分重要的。
随着研究的深入,固氮
测定技术也不断地向准确、可靠、操作简便的方向发展。
生物固氮测定方法主要
有乙炔还原法、、15N同位素稀释法、非同位素法、全氮差值法和酰脲估测法等。
为便于更好研究生物固氮, 本文主要介绍常用的几种测定方法以及它们的优缺点,
以供参考。
1乙炔还原法
始于20世纪60 年代, 目前被广泛应用,根据固氮酶具有还原分子氮或利用其他底物的能力,使乙炔还原为乙烯,作为固氮的间接测定。
从植物根际分离的
纯培养物分别接种于盛有无氮半固体培养基的血清小瓶中,置于28 ～30 ℃培养箱中培养48 h ,将血清小瓶瓶盖在无菌条件下换成橡胶塞,用无菌注射器抽出10 %的气体, 每瓶注1 mL C2H4,,再置于28 ～30 ℃下培养24 ～48 h。
用无菌注射器从瓶种抽取混合气体0 .2 m L 注入气相色谱仪(GC)进样柱中, 测定C2H4含量。
其中,以不接种菌注有C2H2的血清小瓶为对照, 重复 3 次。
从显示屏上C2H2、C2H4峰值判定有无C2H4的产生以确定其固氮性能, 按下式计算其固氮酶活性大小。
A RA =（实际C2H4峰面积×标准气含量×血清小瓶容积∕（标准气峰面积×进样量×培养时间×样品量）。
主要仪器：SP一02型气相色谱仪和氢离子化鉴定器。
该方法优点是灵敏度高,操作较简单,速度快、费用较低,可快速确认固氮作
用的存在与否。
并通过还原乙炔活性的强弱，推算出植物——— 固氮菌联合体
的固氮量、适应范围广,可以离体,也可以整株活体连续测定或原位测定。
缺点是不能直接而准确的获得生物固氮量,不适于长时期田间共生固氮的定
量测定,只能短时间内测定固氮酶活性动态,长时间测定时必须考虑到周围环境的影响。
在理论上可以用C2H2与H 比为3 ∶1换算固氮结果,实际上已报道的有1 .5∶1 .0～25∶1 .0 的各种比例。
尤其对田间系统更复杂，因此, 要在控制
条件下测定或在田间单因子条件下测定,以便进行校正，准确性差、结果可靠性不强。
215N 同位素稀释法
ID 的原理是将固氮系统暴露在15N中，经一定时间后，如果在该系统中发
现了15N H 3或其衍生物，则可判定发生了固氮作用, 15N
氮研究中确认菌株有无固氮能力最直接最可靠的方法。
并且适用于自然田间原位或施入某种固氮菌剂后的作物根际联合固氮量的测定，是确定固氮作用定性和定量的最标准方法。
不需校正因子，并可以校正定氮的一些技术操作。
该方法被认为是最有效而实用的方法。
固氮植物和非固氮植物(作为参考植物)生长在施用相同量15N标记肥料的土壤中,如果两种植物从土壤和肥料中吸收相同比例的N素，在没有其他N素来源的情况下,两种植物体内应有相同的15N/14N组成。
当豆科植物固氮时,由于利用了空气中没有标记的N素，植物体内15N浓度将被稀释,15N/14N比例下降,而参考植物的比例不会发生变化,从空气中固定的N素占豆科植物全部N 素的比例(%N df a)可通过下式计算：
⁄)×100
%Ndfa=(1- %NdfF%NdfNF
其中%N dfF 为固氮植物体内15N的原子百分超;
%N dfNF为非固氮植物体内15N的原子百分超;
总固氮量=%N df a ×固氮植物体内全N 量。
ID 的优点是灵敏度高、准确度高可靠性强可以校正非直接测定法的准确性、也能够测定田间综合条件下的固氮量,而且能够区分来源于空气、土壤、肥料中的N 素量,在选育高固N 能力的品种试验中只需要比较固N植物体内15N的含量不需要参考植物的数据。
能够确定某种细菌是否固氮，适合联合固氮菌固氮量的测定。
不需选择参考植物。
缺点是需要选择参考植物。
它会影响固N量的精确性,不会造成很大的测定偏差。
选取同一土壤库中吸收养分相似的根系类型，有相似的N 素吸收类型和生长速率。
15N价格昂贵，测定手段繁琐，易受大气和土壤中15N的干扰。
3非同位素法
通常，磷的含量是随着氮水平的增加而增加，在植物成熟期积累更多的磷。
接种微生物肥料磷的吸收显著增加。
这种方法是应用了全量、1/ 2 量、1/ 4量和
不施肥，其中以不接种为对照。
在植物成熟后，收集样本风干测定总产量，进行化学成分分析(全氮和全磷的含量), ARF 计算公式如下:
AFR=(NP-NP0)/NF
其中A RF :固氮百分数;N P :接种土壤植物吸收的全氮;,
NP0:非接种土壤植物吸收的全氮, ;N F :施氮水平。
非同位素的优点是简单、易行、不需要较精密的仪器、成本低;缺点是时间较长，需要测定全产,不能估计因减产而造成的试验误差, 因氮肥的施用量不同, 会影响测定结果。
高氮施肥水平导致作物从根、作物吸收的氮减少。
4 全氮量差法
全氮增加是固氮量测定可用全氮增加来衡量，在无化态氮来源情况下, 若生命系统中全氮量有净增加则表明有固氮作用发生。
全氮分析有两种基本方法, 凯尔道氏湿消化法和杜马氏干烧氧化法，比较固氮系统和不固氮系统中全氮量, 以确定固氮量。
固氮量计算为固氮系统全氮减去非固氮体系全氮。
总氮差值法=固氮作物总氮-对照作物的总氮。
5酰脲估测法
在开花初期和结荚初期,采鲜样测定幼茎段(包括叶柄)烘干磨碎后测定酰脲含量全氮含量(凯氏定氮法), 硝态氮含量氨态氮含量(茚三酮法);最后计算酰脲相对丰度:酰脲-N /(酰脲-N +硝态-N +氨态-N )× 100 %。
固氮酶活性与幼茎段酰脲含量及酰脲相对丰度均呈极显著正相关。
酰脲是氮素固定的代谢产物，因此，可以估测固氮量。
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