RSAP分子标记技术
RSAP标记技术在紫菜遗传多样性检测及种质鉴定中的应用
RSAP标记技术在紫菜遗传多样性检测及种质鉴定中的应用乔利仙;翁曼丽;孔凡娜;戴继勋;王斌【期刊名称】《中国海洋大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2007(037)006【摘要】限制性位点扩增多态性(restriction site amplification polymorphism,RSAP)是根据基因组内普遍存在的酶切位点来设计特殊的引物,通过简单的梯度PCR反应来产生多态性.本研究首次将RSAP标记技术成功应用于紫菜遗传多样性检测和种质鉴定.利用所建立的适合于紫菜RSAP分析的PCR反应体系和反应条件,使用30对引物对15个紫菜系DNA进行了PCR扩增,经过3次重复验证,有12对引物能够扩增出清晰且稳定的条带.这12对引物共扩增出413条带,其中408条为多态性条带,多态性比例96%,平均每对引物产生34条多态性条带,片段大小在50～500 bp之间.利用这413条带进行聚类分析,产生了这15个紫菜系的进化树.15个紫菜系在0.69相似系数水平上分为两大类:一类包括坛紫菜;另一类包括条斑紫菜和少精紫菜.选2对引物R1/R6和R3/R4所扩增的10条稳定且重复性好的条带,构建了这15个紫菜系的RSAP-DNA指纹图谱.在该指纹图谱中,每个紫菜系都有其独一无二的指纹模式,能够很容易地与其它紫菜系相区分.【总页数】6页(P951-956)【作者】乔利仙;翁曼丽;孔凡娜;戴继勋;王斌【作者单位】中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101;中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.基因间隔序列(ITS)在水产动物种质鉴定和遗传多样性分析中的应用 [J], 徐田军;刘楚吾;刘丽;董秋芬;杨叶欣2.RSAP分子标记技术在园艺植物研究中的应用 [J], 任羽;王得元;黄少华;徐世松;张志群3.DNA分子标记技术在坛紫菜(Pyropia haitanensis)中的应用 [J], 吴晓雯; 王铁杆; 刘颖; 张鹏4.DNA分子标记技术在坛紫菜 (Pyropia haitanensis) 中的应用 [J], 吴晓雯;王铁杆;刘颖;张鹏5.RAPD标记在紫菜遗传多样性检测和种质鉴定中的应用(英文) [J], 贾建航;王萍;金德敏;曲雪萍;王倩;李传友;翁曼丽;王斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
SRAP分子标记在园林植物遗传育种中的应用
分子标记技术以能直接研究 DNA 水平上的遗 传变异，不 受 组 织 器 官、环 境 及 基 因 是 否 表 达 的 限 制，其多态性高，遗传稳定等优点广泛应用于植物的 遗传育种研究［1］。在近 30 年中，分子标记技术得到 了快速发展，目前 DNA 分子标记已达几十种，大致 可以分为 4 类： 以分子杂交技术为基础的标记，如 RFLP； 基于 PCR 技术的标记，如 RAPD、SSR、ISSR、 AFLP 和 SCAR 等； 基于 DNA 序列的标记，如 cSSR、 ITS 测序分析技术等； 以 DNA 芯片技术为基础的标 记，如 SNP 等。
1 SRAP 技术的原理与特点
相关序 列 扩 增 多 态 性 （ sequence-related amplified polymorphism，SRAP） 分子标记技术最初是由美 国加州大学蔬菜作物系 Li 与 Quiros 博士［2］于 2001 年在研究芸薹属作物时创立的，又称为基于序列扩 增多 态 性 （ sequence-based amplified polymorphism， SBAP） 。它是通过一对独特的引物对开放阅读框 （ ORF） 进行 PCR 扩增，由于物种及个体间的差异导
随着园林绿化的发展，对园林植物的需求度也 越来越高，如要求物种丰富，品种多样化，观赏性状 特异性高，可以周年生产，抗逆性强等。而近几年一 种新的分子标记方法———相关序列扩增多态性（ Se-
quence-related amplified polymorphism，SRAP） 以其多 态性 高、非 等 位 检 测，样 品 信 息 量 大，操 作 简 便，重 复、稳定、可靠性高和费用低等优点，广泛应用于园 林植物的遗传多样性和亲缘关系分析、图谱构建、种 质资源鉴定、基因克隆和基因定位的研究中，为园林 植物的遗传育种提供更确切，更充分的理论依据。
分子标记技术在农作物种子检测中的应用
分子标记技术在农作物种子检测中的应用大家好，今天咱们聊聊那个让人眼前一亮的玩意儿——分子标记技术。
这可是个高大上的科技名词，听着就让人心跳加速。
别急，我慢慢给你们道来。
想象一下，你手里握着一张神秘的宝藏地图，上面密密麻麻地写满了各种标记，有的像星星一样闪闪发光，有的却像是黑洞一样让人望而生畏。
这就是分子标记技术给我们描绘的作物种子世界。
它就像是那些神奇的标记，帮助我们找到最优质的种子，让庄稼长得又壮又高，产量蹭蹭往上涨！首先得提提这个“神探”——SSR标记。
它就像侦探手里的放大镜，一照就能找出问题的关键。
比如，在玉米地里，有人可能会种出个大个子玉米，但一看基因，原来是个小矮子。
有了SSR标记，我们就能轻松揪出问题种子，不让它们祸害我们的庄稼。
再来说说那个“魔术师”——SNP标记。
它就像是魔术师手里的魔棒，轻轻一挥，就能让我们看到作物的遗传密码。
有了SNP标记，我们就像是拥有了一双魔法眼睛，能一眼看穿那些隐藏在种子里的小秘密。
别忘了那个“超级英雄”——InDel标记。
它就像是超人披风上的标志，告诉我们这些种子有多么厉害。
有了InDel标记，我们就像是找到了宝藏地图的指北针，能找到那些隐藏在田野深处的超级种子。
当然啦，还有那个“隐形人”——CRISPR/Cas9技术。
它就像是科幻电影里的高科技装备，能让我们在田间地头轻松“隐身”。
有了CRISPR/Cas9技术，我们就像是穿上了隐形斗篷，能在茫茫农田中轻松找到那些珍贵的种子。
这些分子标记技术就像是一群好朋友，它们一起工作，帮我们守护着农作物的健康成长。
它们不仅让我们能够精准地检测出种子的质量，还能让我们更好地了解作物的生长习性，为我们的农业生产提供强大的技术支持。
现在，你们是不是已经对分子标记技术有了更深入的了解了呢？让我们一起期待这些高科技在未来农业中发挥更大的作用吧！。
花生SRAP—PCR技术体系的优化
提供 。Ｃ Ａ 丙 烯 酰胺 、 Ｔ Ｂ、 甲叉双丙 烯 酰胺 、 硫 酸 过
铵 、 Ｅ Ｄ 均 为 Ａ ｒｓｏ公 司 生 产 ， ａ 购 自 Ｔ ＭＥ ｍ ｅｃ Ｔ ｑ酶
（ Ｒ Ｐ 是 一 种 新 型 的遗 传 标 记 系统 ， 有 多 态 ＳＡ ） 具 性高 、 复性 好 、 重 在基 因组 中分 布均 匀 、 物通 用 引 性 强 等优 点 ， 在作 物 遗传 多 样性 研 究 、 品种鉴 定 、
ＴＡ Ｇ Ｎ公 司 ，Ｒ Ｐ引物 由北 京 华 大 基 因研 究 ＩＮ Ｅ ＳＡ
中心合 成 。
１２ 基 因组 Ｄ Ａ提 取 ． Ｎ
采用 Ｃ Ａ Ｔ Ｂ一氯 仿 一异 戊 醇 法 Ｊ单 株 取 嫩 ，
叶 提 取 基 因 组 Ｄ Ａ。 Ｎ
因子的浓度进行优化 ， 从而保证标记分析体系的
稳定 性 和准确 性 。本研 究 对 花生 Ｓ Ａ Ｒ Ｐ～Ｐ Ｒ反 Ｃ 应体 系 中的 Ｍ Ｃ ｄ Ｔ 、ａ 和引物 等主要 因 ｇ ｌ、 Ｎ Ｐ Ｔｑ酶 子 进行 优化 分 析 ， 立 适 合 花生 基 因组 Ｓ Ａ 建 Ｒ Ｐ— Ｐ Ｒ的优 化反应 体 系 ， Ｃ 为开 展 花生 重 要 性状 分 子
（ 山东省花生研究所 ， 山东 青岛 ２ ６０ ） ６ １０
摘
要： 对花生基因组 Ｄ Ａ的 Ｓ Ａ Ｎ Ｒ Ｐ—Ｐ Ｒ体 系中 Ｍｇ ｌ、 Ｎ Ｐ Ｔ ｑ和引物浓度进行 了优化 ， Ｃ ｃ： ｄ Ｔ 、 ａ 结果表 明，
RSAP标记技术新引物设计及其反应体系的优化
RSAP标记技术新引物设计及其反应体系的优化张明科;张鲁刚;巩振辉;惠麦侠【摘要】[目的]对限制性位点扩增多态性(Restriction site amplified polymorphism,RSAP)标记技术进行改进,并优化了其反应体系.[方法]遵循引物设计原则,使限制性位点序列位于中间.在其3'端增加3个选择性碱基,5'端设计为10～12个碱基的随机序列,设计了14条长为19 bp的限制性位点扩增多态性(RSAP)新引物.以大白菜、紫菜薹自交系及其F1、F2的DNA为模板,对新引物的反应体系进行了优化,并对其重复性和适用性进行了检验.＃[结果]新设计引物PCR 扩增的前5个循环退火温度为35℃,后35个循环为52℃;在25 μL优化反应体系中,模板DNA用量为2.0μL(20.0 ng/μL)、Mg2+3.0μL(25 mmol/L)、Taq酶(5 U/μL)1.5 U、dNTPs 2.0 μL(2.5 mmol/L)、引物各0.6μL(10 μmol/L);新引物扩增出的谱带较原引物更多,多态性更好;只改变选择性碱基,新设计引物就能扩增出新的谱带;新设计引物的重复性、稳定性好,在养麦和小麦品系,以及紫菜薹、大白菜及其F1、F2中,新引物均能扩增出清晰谱带.[结论]新引物适用性和重复性好,可广泛应用于其他作物的基因组DNA分析.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2009(037)002【总页数】7页(P148-154)【关键词】限制性位点扩增多态性;引物设计;反应体系;体系优化【作者】张明科;张鲁刚;巩振辉;惠麦侠【作者单位】西北农林科技大学,园艺学院,国家小麦改良中心杨陵分中心;陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,国家小麦改良中心杨陵分中心;陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,国家小麦改良中心杨陵分中心;陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,国家小麦改良中心杨陵分中心;陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S188早在1980年，人类遗传学家Botstein等[1]首先提出，DNA限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)可以作为遗传标记，开创了直接利用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。
应用SRAP分子标记构建红麻种质资源分子身份证
应用SRAP分子标记构建红麻种质资源分子身份证刘倩;戴志刚;陈基权;温岚;龚友才;粟建光【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2013(046)010【摘要】[目的]以来源于不同国家和地区的127份红麻栽培种、野生种和近缘种为材料,利用SRAP标记构建红麻种质资源分子身份证.[方法]利用SRAP标记对127份红麻种质进行遗传分析,计算其遗传相似系数.利用UPGMA法作聚类图,构建分子身份证.[结果]40对引物组合在127份红麻种质材料中共扩增出383条DNA片段,其中,375条为多态性片段,总的多态性条带比率(PPB)为97.9％. UPGMA聚类分析结果表明,相似系数为0.70时,127份红麻种质资源被划分为4个类群.用SRAP特征谱带和多种引物组合2种方法可有效区分所有材料,并构建出1 2 7份红麻种质资源特异性分子身份证,置信概率达到99.99％.[结论]基于15对SRAP核心引物组合的36条谱带构建了一套127份红麻种质资源唯一性的分子身份证.【总页数】10页(P1974-1983)【作者】刘倩;戴志刚;陈基权;温岚;龚友才;粟建光【作者单位】中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205;中国农业科学院麻类研究所,长沙410205【正文语种】中文【相关文献】1.基于SRAP标记的国兰种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建 [J], 唐源江;曹雯静;吴坤林2.利用ISSR和RAPD标记构建红麻种质资源分子身份证 [J], 郑海燕;粟建光;戴志刚;李燕;陈基权;龚友才3.红麻种质资源遗传多样性和分子鉴定技术研究Ⅰ.红麻AFLP-银染技术和种质资源指纹图谱的构建 [J], 程舟;卢宝荣;王琼;鲛岛一彦;陈家宽4.应用ISSR分子标记绘制红麻种质资源DNA指纹图谱 [J], 汪斌;祁伟;兰涛;陈惠端;徐建堂;粟建光;李爱青;祁建民5.基于SRAP分子标记的特早熟荔枝种质资源遗传多样性分析 [J], 胡福初;吴小波;陈哲;吴凤芝;周文静;冯学杰;范鸿雁;周瑞云;王祥和因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用SRAP分子标记构建茄子遗传图谱初探
应用 ＳＡ Ｒ Ｐ分 子 标 记 构 建 茄 子 遗 传 图 谱 初 探
房 超 杨 志荣４ 刘独 臣 ， ， ， 刘小俊 梁根 云 杨 宏 李跃建 ， ， ， ’
（． １ 四川省农 业科 学院园艺研究所 ， ｔｉ成都 ｌ ＪＩ ￣ 川 省农 业科学院 ， 四川 成都 ６ ０６ ２ 蔬菜品种改 良与种质创新 四川省重点实验室 ， １０ ６； ． 四川成都 ６ ０６ ） １０ ６ ６ ０６ ；． １０ ６ ３ 四
２１ ０ ０年 ２ ３卷 ５期
Ｖ０ ． ３ １２ Ｎｏ ５ ．
西
南
农
业
学
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１ ５９ｌ
Ｓ ｕｈ ｓ ｉａＪｕ ａ ｆＡ ｃ ｌ ｒｌＳ ｉｎ ｅ ｏ ｔｗｅｔＣｈｎ ｏ ｒ ｌｏ ｕｔ ａ ｃｅ ｃ ｓ ｎ ｕ
文 章 编 号 ：０ １— ８９ ２ １ ） ５—１９ ０ １０ ４ ２ （ ００ ０ ５ １— ４
６ ０６ ； ． １０ ６ ４ 四川大学生命 科学 院， 四川 成都
摘
要 ： 用 Ｓ Ａ （ ｅｕ ｎｅｒｌｔ ｍｐｉｅ ｏ ｍｏｐ ｉ 分 子标 记 技 术 构 建 茄 子 分 子 遗 传 连 锁 图 。 图群 体 为 ２ ５ 利 Ｒ Ｐ Ｓｑ ｅ ｃ— ａｅ Ａ ｌｉｄＰｌ ｒｈｓ ｅ ｄ ｆ ｙ ｍ） 作 ５ ４４ （ ｏａ Ｓ ｌ—
Ｉ ｎ ｖ ｔｏ ｎ ｒｅｙ Ｉ ｒ ｖ ｍｅ ｔ ｙ Ｌ ｂ ｒ ｔｒ ｆ ｉ ｈ ａ ｒ ｖ ｎ ｅ，Ｓ ｃ ｕ ｎ Ｃ ｅ ｇ ｕ ６ ０ ６ ｎ ｏ ａ ｉｎ ａ ｄ Ｖａｉ ｔ ｍｐ ｏ ｅ ｎ ａ ｏ ａ ｏ ｙｏ ｃ ｕ ｎ Ｐ ｏ ｉ ｃ Ｋｅ Ｓ ｉｈ ａ ｈ ｎ ｄ １ ０ ６，Ｃ ｉ ａ；３ Ｓ ｃ ｕ ｎ Ａｃ ｄ ｍｙ ｏ ｒｃ ｌ ｈｎ ． ｉ ｈ ａ ａ ｅ ｆｉｇ ｕ — ｉ
分子标记——SRAP分解
二、SRAP标记的原理：
SRAP标记原理是利用基因外显子里G、C含量 丰富，而启动子和内含子里A、T含量丰富的特点设 计两套引物，对开放阅读框架进行扩增。该标记具有 简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点，并 已被应用于图谱构建、性状的标记和遗传多样性分析。
三、SRAP标记中引物的设计与选择：
步
步
温 94 94 35 72 骤 94 50 72 骤 72 4
度℃℃℃℃循℃℃℃循℃℃
环
环
时 5 1 1 1 5 1 1 1 35 10 保
间分
次
次
存
钟
六、琼脂糖凝胶电泳：
SRAP扩增反应结束后，扩增产物用2%的琼脂 糖凝胶电泳分析多态性。
DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子 筛效应，在分子筛作用下，分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率出现较大差异，从而分离核酸片段检测 其大小。核酸分子中嵌入荧光染料（EB）后，在紫 外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
四、SRAP标记25ul体系的组成：
水：
10*PCR taq buffer:
Mg离子：
dNTP:
Me:
引物
Em:
Taq 酶：
模板DNA：
12ul 2.5ul 2.5ul 2ul 1ul 1ul 3ul 1ul
25ul体系
五、SRAP标记扩增程序：
反预变退延以变退延前延保
应变性火伸上性火伸三伸存
性
琼脂糖凝胶电泳设备：
DNA 琼脂 糖凝 胶电 泳
胶图展示：
胶图展示：
条带不稳现象
电泳时注意事项：
1、凝胶一定要加热溶解完全，均匀； 2、一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看； 3、上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压； 4、如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应， 中间电场比较均匀； 5、做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致； 6、加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔 内； 7、电泳开始时可采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。 。
软枣猕猴桃性别相关的SRAP分子标记
软枣猕猴桃性别相关的SRAP分子标记作者：李旭吴松权姜明亮朴一龙来源：《江苏农业科学》2016年第08期摘要：以软枣猕猴桃成龄雌株、雄株叶片为试验材料，利用SRAP分子标记手段及SPSS 软件对统计数据进行聚类分析，结果表明，从初筛的80对引物中筛选出15对可稳定扩增出多态性条带的引物组合，19个雌、雄植株共得到77个条带，多态性条带为72个，多态率达到93.50%；雌株多态性比率为68.8%，雄株多态性比率为87.0%；me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7这4对引物的扩增结果表现出雌雄株间的多态性比率具有明显差异；供试的19个植株经聚类分析分成2组，2组中均有70%以上表现出相同的性别。
基于性别相关的SRAP 可以有效分辨出软枣猕猴桃雌株、雄株。
关键词：软枣猕猴桃；雌雄异株；性别鉴定；SRAP；分子标记中图分类号： Q943文献标志码：文章编号：1002-1302（2016）08-0069-03软枣猕猴桃[Actinidia arguta （Seib.et Zucc.）Plangch.ex Miq.]是猕猴桃科猕猴桃属中水平和垂直分布最广泛的多年生落叶藤本果树之一[1]，我国南北各地、朝鲜、日本、俄罗斯均有分布，以我国东三省资源最为丰富，其中，小兴安岭和长白山山区较为多见，是珍贵的抗寒果树资源。
软枣猕猴桃果实富含维生素C、酚类物质、类胡萝卜素及多种矿质元素，具有一定的药用价值。
目前，软枣猕猴桃作为第3代猕猴桃，受到世界各国的广泛关注，其产业开发正蓬勃发展。
但是，软枣猕猴桃为雌雄异株植物，以雌株产果实，雌株的经济价值明显高于雄株，而软枣猕猕猴桃实生苗需要5～7年才能结果，童期漫长，且实生繁殖后代出现雌雄比约为1 ∶[KG-*3]4的性别分离[2]，不利于生产需要。
雌雄异株和幼苗期雌雄无法辨别给软枣猕猴桃种质资源的改良和育种带来巨大困难，因此，软枣猕猴桃的性别鉴定在生产和遗传育种方面有着重要的意义。
龙须菜RSAP分析及其SCAR标记的转化
龙须菜RSAP分析及其SCAR标记的转化王津果;隋正红;周伟;马金华;张淑;常连鹏【期刊名称】《中国海洋大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(044)004【摘要】初步探讨限制性位点扩增多态性(Restriction site amplified polymorphism,RSAP)分子标记技术在龙须菜遗传多样性检测和种质鉴定上的应用.利用所优化的适合于龙须菜RSAP分析的PCR反应体系,对青岛湛山湾野生群体和栽培品系981、07-2进行遗传多样性分析和比较.试验采用15对引物组合在3个群体14个龙须菜个体中共扩增出669个位点,其中多态位点数为146个,多态性比例22％,平均每对引物产生10条多态性条带,片段大小在100～1 000 bp之间.湛山湾野生群体的Na(1.007 5)、Ne(1.007 1)、H(0.003 6)、I(0.005 1)与栽培品系981的Na(1.003 0)、Ne(1.002 1)、H(0.001 2)、I(0.001 8),以及栽培品系07-2的Na(1.0090)、Ne(1.006 3)、H(0.003 7)、I(0.005 4)相比较可知3个群体的遗传多样性是有差异的.种群间的遗传多样性分析表明,在所有检测的样品中,遗传多样性多来自不同群体间的多样性.群体遗传结构分析表明,2个栽培品系981、07-2间遗传距离不大,但栽培品系与湛山湾野生群体间的遗传距离相对较大,而UPGMA聚类分析也明显的将湛山湾野生群体与栽培品系981、07-2区分开来,表明野生群体与栽培品系间已产生一定的遗传隔离.通过分析湛山湾野生群体及栽培品系981、07-2的RSAP指纹图谱,从中筛选栽培品系981的特异条带,并将其转化为稳定性好、特异性高的序列特征化扩增区(Sequence characterized amplified regions,SCAR)分子标记.【总页数】7页(P47-53)【作者】王津果;隋正红;周伟;马金华;张淑;常连鹏【作者单位】中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室,山东青岛266003;中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室,山东青岛266003【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.与棉花无蜜腺基因紧密连锁SSR标记的筛选及SCAR标记的转化 [J], 李瑞莲;朱四元;陈金湘;张德胜;刘爱玉;刘海荷2.满天星试管苗与玻璃化苗RAPD标记向SCAR标记的转化 [J], 金美玉;曹天旭;邵春绘;廉美兰;朴炫春3.龙须菜新品系ZC的生长和生理生化参数的测定及其SCAR标记的开发 [J], 王津果;隋正红;周伟;常连鹏;张淑;马金华;张学成4.青海大黄油菜粒色性状AFLP标记的筛选和SCAR标记转化 [J], 赵会彦;肖麓;杜德志5.基于SSR和RSAP的龙须菜作图群体多态性标记开发与亲本间遗传距离的估计与比较 [J], 郭伟华;隋正红;胡依依;李彬彬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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目录摘要 (1)Abstract (1)1 引言 (2)1.1 RSAP标记技术 (2)1.2 DNA提取方法 (2)1.3 PCR反应原理及成分 (3)2 材料与方法 (4)2.1 材料 (4)2.1.1 32个花生品种 (4)2.1.2 主要试剂 (5)2.1.3 主要仪器用具 (5)2.2方法 (5)2.2.1花生DNA的提取 (5)2.2.2 PCR反应体系的优化 (6)2.2.3 PCR反应条件中退火温度的确定 (6)2.2.4引物初步筛选 (7)2.2.5多样性检测 (7)3 结果及分析 (8)3.1 PCR反应体系的优化 (8)3.1.1引物浓度对扩增结果的影响 (8)3.1.2模板浓度对扩增结果的影响 (8)3.1.3TaqDNA聚合酶浓度对扩增结果的影响 (9)3.1.4dNTP S浓度对扩增结果的影响 (9)3.2退火温度对扩增结果的影响 (10)3.3引物筛选结果 (11)3.4多样性初步分析 (11)4讨论 (12)4.1RSAP特点 (12)4.2影响RSAP因素 (13)致谢 (14)参考文献 (15)RSAP标记技术在花生遗传多样性检测中的初步应用生物技术专业李鹏飞指导教师乔利仙摘要：限制性位点扩增多态性(restriction site amplification polymorphism ,RSAP) 是根据基因组内普遍存在的酶切位点来设计特殊的引物,通过简单的梯度PCR反应来产生多态性。
本研究首次建立了适合于花生RSAP分析的PCR反应体系和反应条件,并对RSAP标记技术在花生遗传多样性检测中的应用进行了初步研究。
利用所建立的体系，使用15对引物对32个花生DNA进行了PCR扩增,经过重复验证,有8对引物能够扩增出清晰且稳定的条带，这些条带具有一定的多态性，说明所建立的体系可用于花生遗传多样性分析。
关键词：RSAP；花生；遗传多样性The Application of RSAP Marker Technique in DiversityDetection of peanutStudent majoring in biotechnology Li PengfeiTutor Qiao LixianAbstract : Restriction site amplified polymorphism (RSAP) requires just a simple polymerase chain reaction(PCR)to generate polymorphic markers around restrictive site. An RSAP analytic system suit for peanut was set up and applied in diversity detection of peanut for the fist time. In this experiment, fifteen primer pairs were screened with 32 peanut varies by the RSAP analytic system; and eight of them produced stable and reproducible amplification patterns. Some of the fragments screened by the primer pairs were polymorphic, indicting that the analytic system was suit for the diversity detection of peanut.Key words:RSAP; peanut; diversity1 引言花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一，营养价值高，用途广，深受人们喜爱。
中国花生世界年产量居世界第一位（万书波，2003）。
随着中国加入世贸组织和现代交流的国际化，选育更加高产，高油，抗逆性强，早熟或其他专用型花生品种变得尤为重要（王传堂，1999）。
传统的育种方式存在周期性长，对隐性基因控制的性状不易筛选等局限性，而我国对花生在分子生物学方面的研究还相对落后于其他作物（孙大容，1998）。
因此，探索花生基因组研究方法对于花生遗传育种研究和加速野生种的利用有其重要意义，RSAP作为一种新型的分子标记技术，简便且具有潜力。
1.1 RSAP标记技术RSAP ( restriction site amplification polymorphism)即限制性位点扩增多态性,是通过简单的梯度PCR 反应,针对基因组内普遍存在的酶切位点来产生多态性标记。
RSAP的引物是依据SRAP ( sequence related amplified polymorphism)(序列相关扩增多态性) 的引物设计原理建立(Li G, et al., 2001) ，使用1对17-18个碱基组成的引物序列, 5′端前12-14个碱基为没有特殊组成的填充序列, 3′端的选择性碱基为4-6个碱基组成的限制性内切酶的酶切位点序列。
依据引物内 3端选择性碱基,即基因组内限制性内切酶位点的不同而产生多态性。
该技术无需限制性酶切及其它复杂步骤,仅1个简单的PCR 反应即可实现对DNA限制性位点的多态性进行检测,因此它是RFLP技术的1种简化。
该技术由杜晓华等首先在辣椒中建立(杜晓华等， 2006),同时在苦瓜和水稻上作了验证，乔利仙（2007）对紫菜遗传多样性进行了多态性分析，除此之外没有其它报道。
本研究首次将新型分子标记技术RSAP的PCR体系在花生分析上进行了优化，并对32个花生的遗传多样性进行了初步检测。
1.2 DNA提取方法生物体基因组DNA的提取是进行核酸分子生物学研究的基础。
对大部分细菌来说，主要细胞提取物就是DNA,RNA和蛋白质，因此苯酚提取或蛋白酶降解后，接下来利用核糖核酸酶来分解RNA就可得到较为纯净的DNA样品。
植物全基因组的提取有一定的困难性，主要在于植物组织较难处理，它存在细胞壁，组织中含有大量的碳水混合物，这些碳水混合物不能通过苯酚提取而除去，为此我们可以加入某种去垢剂（CTAB），使其与核酸一起形成不溶的混合物。
植物总 DNA 的提取方法主要有 CTAB 法和 SDS 法,针对不同植物总DNA的提取流程是不同的, 即便是同一植物提取总 DNA 的方法相同, 其技术流程也存在很大差异（Shokes FM，1987）（Bateman ,D F.，1964）改进方法的聚焦点是提高 DNA 的质量。
而一味追求提高 DNA 质量,增加了许多操作环节,所以在满足试验需求的前提下,应考虑简捷可靠的 DNA 提取技术流程。
本实验所用的模板 DNA 就是用经过改进的CTAB 法(陈静等，2008)提取并初步纯化的。
1.3 PCR反应原理及成分本实验的核心技术和基础步骤是PCR：多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是美国Perkin-Elmer/Cetus公司人类遗传研究室Mullis K.B．等人于1985年发明的一种快速体外DNA片段扩增技术，是八十年代分子生物学资源领域的一项革命性突破，被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。
该技术一问世，就在分子生物学、医学、生物工程、法医学、考古学等领域得到快速而广泛的应用，并且对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展也起了巨大的推动作用。
PCR技术是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术（亦称无细胞分子克隆技术）。
它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸作为介导，通过DNA聚合酶促反应，在体外进行特异DNA序列扩增。
其过程包括模板变性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（longation）退火引物在内的重复循环系列，使末端被引物5′端限定的特异性片段成指数形式累积。
由于在每一循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶 DNA 的拷贝数几乎呈几何级数增长。
因此20次PCR循环将产生约一百万倍的扩增产物，具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强的特点，并且具有从 DNA 粗制品和降解的 DNA 模板中扩增靶序列的能力。
PCR的原理类似于DNA的天然复制过程，关键是运用两个起始引物，分别与待扩增序列相对的两条单链 DNA 结合，结合位点分别位于待扩增序列的两端，并且 3′端相对，然后利用DNA聚合酶依赖于 DNA 模板的特性，模仿体内的复制，在两个引物之间诱发聚合酶反应。
在该反应体系中，各组分用量的大小对扩增是否成功会有极大影响，因此一个反应体系是否适合于对某种作物进行基因扩增，需要进行优化验证。
PCR反应中的主要成份有：(1) 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。
引物的好坏和用量往往是PCR成败的关键。
一般引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度，影响引物与模板配对，从而使非特异性增大，太长则比较浪费，且难以合成。
引物不能与模板结合位点以外的序列互补。
所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。
(2) 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)：一般反应中每种dNTPs的终浓度为20-200μmol/L。
理论上4种dNTPs 20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg 的DNA。
当dNTPs终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。
4种dNTPs 的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTPs的不足出现的错误掺入。
(3) Mg2+：Mg2+ 浓度对 TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。
对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。
在PCR反应混合物中，应尽量减少高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。
(4) 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。
扩增多拷贝序列时，用量更少。