实验三 乙型肝炎病毒表面抗原检测
乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法
乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法前言乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是由乙型肝炎病毒（HepatitisB virus , HBv ）引起的传染性疾病，在我国人群中感染率较高，，是严重危害人民身体健康的常见传染病之一。
对乙肝的诊断主要以实验室检测乙肝表面抗原（Hepatitis B Surface antigen , HBsAg ）为主，检测方法主要有酶免疫法、反向间接血凝法、放免法、化学发光法、免疫荧光法等，目前应用较广、较普及的是酶免疫法。
本标准所使用的缩略语为HBV 、HBsAg 。
本标准从2002 年7 月1 日起实施。
本标准由卫生部医政司提出。
本标准由北京大学医学部人民医院肝病研究所负责起草。
本标准主要起草人：陶其敏、全文斌。
本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。
中华人民共和国卫生行业标准中华人民共和国卫生部2002-04-20 批准2002-07-01 实施乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法WS / T 223 一2002Guidelines for enzyme immuno 一assay of hepatitis B surface antigen1 范围本标准规定了血清HBsAg 酶免疫检验方法（两步法）中相关的技术要求。
本标准适用于各基础、临床实验室和流行病学研究中血清HBsAg 测定。
2 方法选择2 . 1 常用方法HBsAg 的酶免疫检验方法根据反应模式可分为“一步法”和“两步法”两种方法。
“一步法”是将待测样品和酶标记抗体同时加人到反应孔中进行反应，从而达到快速的目的；“两步法”则是先将样品加人到反应孔中，待反应结束后再加人酶标记抗体，从而使待测样品的“捕获反应”和酶标记抗体的“酶联反应”分开进行，因而反应更加稳定、重复性也更好。
2 . 2 推荐方法由于“一步法”存在产生“前带现象”的可能，故在本标准中不列为推荐方法；本标准推荐使用酶免疫“两步法”。
2 .3 方法原理本标准推荐使用酶免疫“两步法”检测HBsAg ：将抗HBs 的单克隆抗体（简称单抗）或多克隆抗体（简称多抗）包被于聚苯乙烯微孔板等固相载体上，加人待测血清，如其中含有HBsAg ，则可与固相上的包被抗体结合；洗板去除不参加反应的无关蛋白成分后，加人酶（如辣根过氧化物酶）标记的第二株抗体使之与血清中HB 、Ag 反应，在固相载体上形成包被抗体一血清中HBsAg 一酶标记抗体的复合物（即双抗体夹心）；再加人底物后，酶催化底物，产生显色反应，根据显色反应颜色的深浅可判定血清样品中HB 、Ag 的有无及相对含量。
用两种方法检测乙肝表面抗原结果分析
用两种方法检测乙肝表面抗原结果分析目的了解用ELISA法检测乙肝表面抗原和用化学发光法检测表面抗原两者之间的结果情况。
方法采集320例就诊人员的血液标本，分别用化学发光法与ELISA法检测。
结果320份标本中，发光法检测出40份阳性，280份阴性。
ELISA 法检测出42份阳性，278份阴性。
经χ2检验两者无显著性差异（P>0.05）。
结论ELISA法成本比较低，耗时长，实验的影响因素比较多，易出现假阳性。
化学发光法成本高，所需时间短，干扰因素少，不易出现假阳性。
标签：乙肝表面抗原；ELISA；化学发光流行病学调查结果显示，我国的乙型病毒肝炎感染性约达10%，乙肝的实验检测对其防治具有非常重大的意义[1]。
乙型肝炎病毒乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。
随着科学越来越进步，检测的手段也越来越多。
自20世纪70年代至今，诸多高敏感性的检测方法被广泛应用于临床免疫学的检测中，当中应用最为广泛的就属酶联免疫法（enzyme linked Immunosor bent assay，ELISA）[2]。
近几年，化学发光微粒子免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）正逐渐发展，是一种敏感性较强的临床免疫学检测方法，有效解决了低浓度乙型肝炎病毒乙肝表面抗原的检测难题[3]。
现用ELISA法，化学发光法，这两种方法检测的相关性进行探讨。
1 资料与方法1.1一般资料标本来自于我院2016年3月1日～3月5日体检人员，共320例，男198例，女122例，年龄18～72岁，平均年龄为（39.5±8.4）岁。
1.2标本采集用红头采血管，真空抽取静脉血3 ml，标本静置后离心提取血清。
1.3检测试剂与仪器一种采用雅培化学发光HBsAg定量检测试剂盒，标本离心后，按照雅培I2000化学发光仪的操作规程检测。
双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)实验设计
双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) 【技术背景】目前检测HBsAg的技术有：①两位点一步法：可出现钩状效应，待测抗原浓度过高出现假低值或假阴性；②两步法：无钩状效应；③一步半法：减少钩状效应。
本实验所采用的方法为一步半法，此法是基于抗原抗体特异性反应的原理，因此对于所检测的抗原其对应的抗体是特异性的，待测抗原必须存在于抗体结合的抗原决定簇，因此，此法用于乙肝表面抗原是比较准确的。
【病人准备】虽然在进行乙肝表面抗原检查前没有空腹检查的要求，但检查前一天应注意不喝酒、不服用任何对检测结果有影响的药物。
【标本的采集与保存】血清：采用正确医用技术采集静脉血2ml，待血液自然完全凝固后，2000-3000转/分离心10分钟，取新鲜血清用于检测。
血浆：用抗凝血浆管（枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一作抗凝剂）采集静脉血2ml，3000-3500转/分离心10分钟，取新鲜血浆用于检测。
血清样品：5天内测定，可以放置于4℃；超过一周，-80℃保存2.实验前准备1）用前三十分钟从冰箱中取出的试剂盒和待测标本，平衡至室温（18-25℃）；2）将恒温箱或恒温水箱调至反应温度。
【原理】将抗HBs 的单克隆抗体（简称单抗）或多克隆抗体（简称多抗）包被于聚苯乙烯微孔板等固相载体上，加人待测血清和酶标记抗体（抗HBs-HRP），血清中HBsAg与微孔板上的包被抗体（抗HBs）结合，洗涤分离后，加人酶底物系统，留在微孔板表面抗HBs-HBsAg-抗HBs-HRP复合物中的HRP催化底物进行显色反应。
根据显色反应颜色的深浅（吸光度A 高低）与血清标本中HBsAg含量成正相关，以此判定血清样品中HBsAg 的有无及相对含量。
显色为阳性，不显色为阴性。
【试剂与器材】1.试剂抗HBs包被的微孔板、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、酶标试剂、浓缩洗涤液、显色剂A、显色剂B、终止剂、封板膜2.器材加样枪（20μL、50μL -250μL）、恒温设备（恒温水浴箱或恒温箱）、洗板机、酶标仪、吸水纸、消毒缸要求：a ）酶标仪在450 nm 和492 nm 的波长不精密度应在≤1 %，分别在449 nm -451 nm 和491 nm-493 nm 之间，吸光度（A 值）要求可以测到小数点后两位；b ）移液系统在100μl和50 μl 的移液不精密度应≤1 % ，分别在99- 101μL和49.5μL-50.5μL 之间；c ）恒温系统在37 ℃、43℃的温度变异应成±1℃。
乙肝表面抗原检测流程
乙肝表面抗原检测流程
1. 采集样本，通常使用静脉血作为检测的样本。
医务人员会使用消毒的针头抽取一定量的血液。
2. 样本处理，采集到的血液样本会被送往实验室进行处理。
在实验室中，血清会被分离出来，以便进行后续的检测。
3. 酶免疫法检测，乙肝表面抗原通常使用酶免疫法（ELISA）进行检测。
ELISA是一种常用的免疫学检测方法，通过检测血清中特定抗原或抗体的存在来进行诊断。
4. 结果分析，实验室技术人员会分析样本中乙肝表面抗原的检测结果。
阳性结果表明患者体内存在乙肝病毒，阴性结果则表明患者体内暂时没有乙肝病毒的感染。
5. 结果报告，最终的检测结果会被记录在报告中，并由医生进行解读和诊断。
如果检测结果呈阳性，医生可能会建议进行进一步的检测以确认诊断，并制定相应的治疗方案。
需要注意的是，以上流程仅为一般的乙肝表面抗原检测流程，
具体的操作步骤可能会因医疗机构和实验室的不同而略有差异。
在进行乙肝表面抗原检测前，建议咨询专业医生以获取详细的检测流程和注意事项。
1乙肝表面抗原检测操作规程
1.1乙肝表面抗原检测操作规程-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN乙型肝炎病毒表面抗原检测（ELISA）1原理：在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HbsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。
2试剂：试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司包装规格：96Test/Kit试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被HbsAb），HbsAg酶标抗体（含HRP标记HbsAb）, HbsAg阳性对照（含基因工程HbsAg），HbsAg阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含BSA缓冲液），浓缩洗涤液（PBS-T 缓冲液），底物A（含H2O2），底物B（含TMB），终止液（含H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。
试剂储存条件及有效期：2~8℃避光保存，有效12个月。
3样本采集：取静脉血3-4ml于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于4℃冰箱保存，如长期保存需置于-15至-20℃冻存，并避免样本反复冻融。
高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。
4所需仪器全自动酶免分析仪新鲜蒸馏水或去离子水酶标仪（单波长450nm或双波长450nm/630nm）微量移液器37℃恒温箱或水浴箱洗板机或洗瓶5检验方法平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。
配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。
编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。
稀释：每孔加入20ul样品稀释液。
加样：分别在相应孔中加入100ul阴、阳性对照血清或待测样本。
温育：置37℃温育60min。
加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul。
乙肝表面抗原ELISA检测程序
乙型肝炎病毒表面抗原ELISA法检测程序1检验目的及原理1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。
母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。
尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。
1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen 以及Schuurs进行描述的。
在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。
HBsAg 在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。
在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。
本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。
如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。
2 方法性能参数2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验(1)敏感性：样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。
(2)特异性：使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。
3 标本3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。
3.2血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM 以上离心5分钟，分离血清。
3.3采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。
3.4严重脂血、严重溶血原则上不会影响检测结果，但洗涤一定要彻底、干净。
乙型肝炎病毒标志物表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体检测试剂盒(胶体金法)
血清乙型肝炎病毒HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc检测作业指导书1.目的：建立乙型肝炎病毒HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc定性检测标准操作规程，确保检测结果的准确。
2.范围：适用于检验科免疫实验室。
3.规程：3.1标本的收集与准备：3.2用未加抗凝剂的真空抽血管抽取静脉血2ml。
3.3标本完全凝固后才能离心，并分离血清。
3.4如试验8小时内不能完成，血清标本放2~8℃保存。
3..5标本拒收标准：严重脂血、溶血、黄疸。
4、测定原理：本试剂盒采用胶体金标记免疫层析技术，将HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc单项胶体金标记免疫层析检测条组装成联合检测卡。
样品加到检测卡各项加样孔后,再借助毛细作用移行至层析区,于检测区和对照区,胶体金标记颗粒由于抗原抗体反应形成富聚,形成或不形成肉眼可见的胶体金颗粒反应带,从而实现对HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc的检测，并作出存在与否的判定。
HBsAg用双抗体夹心法检测，胶体金标记抗HBs(鼠单抗)与样品中的HBsAg结合形成复合物,再借助毛细作用复合物沿层析条向前移行,与检测线区预包被的抗HBs(鼠单抗)形成“Au-抗HBs(鼠单抗)-HBsAg-抗HBs(鼠单抗)-固相材料”夹心物而凝聚显色。
游离胶体金标记抗HBs(鼠单抗)则在对照线处与羊抗鼠IgG抗体结合而富集显色。
阴性标本则仅在对照线处显色。
结果于30分钟内判定。
抗HBs用双抗原夹心法检测胶体金标记HBsAg与样品中的抗HBs结合形成复合物,再借助毛细作用复合物沿层析条向前移行,与检测线区预包被的HBsAg形成“Au-HBsAg-抗HBs-HBsAg-固相材料”夹心物而凝聚显色。
游离胶体金标记HBsAg则在对照线处与羊抗HBs结合而富集显色。
阴性标本则仅在对照线处显色。
结果于30分钟内判定。
HBeAg用双抗体夹心法检测胶体金标记抗HBe(鼠单抗)与样品中的HBeAg结合形成复合物,再借助毛细作用复合物沿层析条向前移行，与检测线区预包被的抗HBe(鼠单抗)形成“Au-抗HBe(鼠单抗)-HBeAg-抗HBe(鼠单抗)-固相材料”夹心物而凝聚显色。
乙型肝炎病毒表面抗原定量测定作业指导书
乙型肝炎病毒表面抗原定量测定作业指导书一、目的：规范乙型肝炎病毒表面抗原测定的标准操作程序，确保乙型肝炎病毒表面抗原测定的结果准确有效。
二、适用范围：在AutoLumo A2000化学发光检测仪上定量测定人血清中的乙型肝炎病毒表面抗原。
三、临床意义乙型病毒性肝炎是一种重要的公众危害性疾病，据估计全球范围内目前大约有3 亿乙肝病毒携带者。
感染乙型病毒性肝炎可引起广泛的急、慢性肝脏疾病，流行病学研究已经清楚地表明乙肝病毒与肝细胞癌的发生有联系。
HBsAg是乙肝病毒颗粒（HBV）的外壳成分，为大小不一的多肽。
感染乙型肝炎病毒后，机体会产生各种不同模式的抗原、抗体血清学免疫应答反应。
通过检测这些标志物，不仅可以诊断感染，而且还可以判断疾病的进程和预后。
HBsAg是HBV感染后第一个标志物，是提示样本是否有潜在传染性的最好的间接指标。
四、方法原理本产品采用双抗体夹心法原理进行检测。
用抗-HBs 抗体包被磁微粒，用辣根过氧化物酶标记的抗-HBs抗体制备酶结合物。
通过免疫反应形成抗体-抗原-抗体-酶复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与HBsAg含量成正比。
五、标本的采集与处理5.1.采用正确医用技术收集血清/血浆样本，推荐对于使用普通管采血的样本，离心前样本应37℃孵育至少1h；对于使用促凝管采血的样本，离心前样本应37℃孵育至少0.5h，离心条件10000g/min，10min；对于使用抗凝管采血的样本，离心条件10000g/min，10min。
抗凝管推荐使用肝素作为抗凝剂，避免使用枸橼酸钠和EDTA抗凝剂。
5.2.样本中的沉淀物和悬浮物可能会影响试验结果，应离心除去，并确定样本未变质方可使用。
5.3.溶血或脂血的样本不能用于测定。
5.4.样本收集后在室温放置不可超过8小时；如果不在8小时内检测需将样本放置在2~8℃的冰箱中；若需48小时以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。
使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。
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实验三乙型肝炎病毒表面抗原检测
一、目的
掌握ELISA原理和方法
二、实验原理
采用EIA双抗原夹心法检测人血清或血浆中的抗-HBs。
并采用HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP，进行孵育，当标本中存有抗-HBs 时，该抗-HBs与包被的HBsAg结合并与酶结合形成酶结合物HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP复合物，洗去反应物，加入显色剂后，将有明显的颜色变化；当标本中没有抗-HBs时，加入底物后没有或只有很轻微颜色变化。
三、试剂与器材
1.试剂
酶结合物、抗-HBs阳性对照，浓缩洗涤液、显色剂A、显色剂B、终止液（2mol/L H2SO4）、7号待测样品、8号待测样品
2.器材
预包被反应板（9孔）、封板胶条、移液枪、摇床
四、操作步骤
1.取7号待测样品分别填装到4孔中，每孔50μL。
同样取8号待测样品分别
填装到4孔中，每孔50μL。
剩余一孔装填50μL抗-HBs阳性对照。
2.加酶结合物，每孔50μL，并充分混匀，贴上标签纸，置于37℃孵育30min。
3.手工洗板：弃去孔中液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液350μL灌注每孔，
静置5-10秒，弃去孔内洗涤液拍干，如此反复五次。
4.加显色剂：先加显色剂A，每孔50μL；再加显色剂B，每孔50μL；充分混
匀，放置37℃避光孵育15,min。
5.终止反应：每孔加入终止液50μL，混匀。
6.观察颜色变化。
五、实验结果分析
从实验结果看出7、8号待测样品皆无明显的颜色变化，但是阳性对照组再加入显色剂A、B后立即显现蓝色，再加入终止液后立即显现黄色。
表明7、8号待测样品皆无抗-HBs。
而反应显色原因为底物过氧化氢脲溶液和TMB，在HRP酶的作用下，产生蓝色的阳离子根；加入终止液后，一方面，硫酸破坏了HRP酶的活性，使酶的催化功能丧失，另一方面，pH降低，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌。
但本实验并未用上酶标仪，故测定联苯醌的消光系数也无法进行。