菌种鉴定标准操作规程
标准菌种确认标准操作规程
标准菌种确认标准操作规程一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三内容1.1 试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要内容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对,快速获得细菌种属信息的操作规程.本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息.2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA(核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1。
5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守,所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大,包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱;PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖;PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+),dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1。
菌种的确认标准操作规程
1．目的建立菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
2．依据《中国药典》2010版二部3．范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
4．责任质量管理部，质量控制实验室5．内容5.1试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]5.1.1标准菌株5.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
5.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
5.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
5.1.2工作菌株5.1.2.1标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株5.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
5.2菌种确认试验的主要内容5.2.1菌种的纯度确认5.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
5.2.1.2试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
5.2.2菌种的特性确认5.2.2.1生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
菌种检定操作规程
菌种检定操作规程
《菌种检定操作规程》
一、目的
菌种检定操作规程旨在规范菌种检定过程，确保检定结果准确可靠，保障实验室菌种质量。
二、适用范围
本规程适用于各类实验室对菌种进行检定的操作。
三、设备和试剂
1. 必备设备：无菌工作台、培养箱、平板计数器等。
2. 必备试剂：琼脂培养基、生理盐水、甘油等。
四、菌种检定操作流程
1. 取样准备：将待检菌种进行悬浮液制备或直接取样，保证单一菌种在接种时的质量。
2. 培养基接种：将取样溶液均匀涂敷于琼脂培养基表面，将琼脂培养基放入培养箱进行培养。
3. 孵化：将接种后的琼脂培养基置于培养箱中，进行相应的温度和时间的培养。
4. 菌落计数：使用平板计数器对菌落进行计数，记录结果。
5. 结果分析：根据计数结果，对菌种进行鉴别和鉴定。
五、结果确认与报告
1. 只有经过两名以上实验人员的确认，结果方可出具。
2. 将检定结果填写在检定记录表上，并进行备份存储。
六、质量控制
1. 定期对实验室设备和试剂进行检验、校正。
2. 定期进行内部质量控制，对检定结果进行复核和比对。
七、附则
1. 对于异常情况的处理：出现异常结果时，要及时进行排查并记录处理过程。
2. 本规程未尽事宜，由实验室主管负责进行详细规定。
以上即为《菌种检定操作规程》的内容，希望各实验室严格按照此规程进行菌种检定工作，确保实验室菌种质量及检定结果的准确性。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
16srrna鉴定菌株的标准操作规程
16srrna鉴定菌株的标准操作规程1. 准备工作：清洗实验室器具、准备培养基和试剂、保持操作环境的无菌状态。
2. 提取细菌样品：从菌落、液体培养基或环境样品中选择一个菌落较纯净的菌株。
使用无菌操作工具，在无菌条件下，用菌液或菌落均匀涂抹于无菌平板上。
3. 培养菌株：将无菌平板培养基转移到适合该菌株生长的培养条件下。
通常情况下，大多数菌株可以在37℃下培养24小时后获得足够的菌量。
4. 提取菌株的16S rRNA基因：使用合适的菌株提取方法提取菌株的总DNA，并使用PCR方法扩增16S rRNA基因。
PCR 反应条件可根据实验室的标准方法或相关文献进行设置。
5. 准备电泳样品：将扩增的16S rRNA基因产物与DNA分子量标记物一同混合，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
6. 电泳分析：将准备好的电泳样品注入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳分析。
根据相对位置和迁移速度，确定16S rRNA基因的大小。
7. 分离目标DNA带：使用无菌操作工具，在琼脂糖凝胶上切割目标DNA带。
8. 提取目标DNA带：使用合适的目标DNA提取方法，从琼脂糖凝胶上提取目标DNA带。
9. DNA序列测定：将提取的目标DNA带进行测序，可以委托测序机构进行测序，也可以使用实验室的测序设备进行测序。
10. 序列分析：使用生物信息学工具对测序结果进行分析，包括序列比对、物种鉴定和进化分析等。
11. 物种鉴定结果的确认：将测序结果与数据库中的已知序列进行比对，确定菌株的物种鉴定结果。
12. 数据和结果的解释：根据测序结果和数据库比对结果进行数据分析和结果解释。
上述是针对16S rRNA基因进行鉴定的一般操作流程，具体操作规程可能因实验室的要求和设备的不同而有所差异。
实施过程中应始终保持无菌操作，确保结果的准确性和可靠性。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增,然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA.16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA 由于大小适中，约1。
5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定.16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属.针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况,需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列,为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序.3.设备和材料3.1器材移液器(1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate;离心机；水浴锅；电泳仪;制冰机;低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪:VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra;琼脂糖;PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+），dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator,5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit;3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管:1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG—3’500 bp左右反向引物519R 5’- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G—3'750bp左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC—3’第3部分正向引物926F5'— AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp 左右反向引物1492R5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A ， Y=C:T. K=G:T ， R=A:G ， S=G ：C. W=A ：T ； all 1：14. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落,然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min,取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍）,混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
菌种鉴定仪标准操作规程
菌种鉴定仪标准操作规程《菌种鉴定仪标准操作规程》一、前言菌种鉴定仪是一种用于快速鉴定微生物菌株的设备，广泛应用于医疗、食品、环境监测等领域。
为了保证鉴定结果的准确性和操作的规范性，制定本规程。
二、适用范围本规程适用于使用菌种鉴定仪进行微生物菌株鉴定的实验室及相关人员。
三、操作人员1. 操作人员应具备相关微生物鉴定的基本知识和实践经验。
2. 操作人员应经过培训，并取得相关操作资格证书。
四、仪器及试剂1. 菌种鉴定仪应符合国家标准，保证设备的正常运行。
2. 试剂应来自正规厂家，保证试剂的质量。
五、操作流程1. 准备待测菌株：将待测菌株培养于适宜的培养基上，保证菌株的纯度。
2. 设置菌种鉴定仪：根据待测菌株的品种和特性设置菌种鉴定仪的相应参数。
3. 载玻片制备：将待测菌株悬浮于载体上，进行薄膜制备。
4. 菌种鉴定：将载玻片放入菌种鉴定仪中进行快速鉴定。
5. 结果判读：根据仪器显示的结果进行判读，并与其他方法进行对比分析。
六、结果记录与报告1. 记录：对每次鉴定实验的结果进行详细记录，并按规定保存相关数据。
2. 报告：将鉴定结果进行整理，并向相关部门或客户提交鉴定报告。
七、设备维护和质控1. 设备维护：定期对菌种鉴定仪进行维护和保养，保证设备的正常运行。
2. 质控：定期进行质控实验，保证菌种鉴定的准确性和可靠性。
八、处罚与奖励1. 对违反本规程造成损失的个人或单位，将给予相应的处罚。
2. 对严格执行本规程并取得良好成绩的个人或单位，将给予相应的奖励。
九、附则1. 本规程由实验室管理者负责执行，并定期进行评估和更新。
2. 对本规程中未尽事宜，由实验室管理者负责解释和裁决。
十、生效日期本规程自颁布之日起生效。
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菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1 整体操作步骤1.1 纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2 挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3 如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE 试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E 试剂条进行鉴定。
1.4 如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep 试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph 试剂条进行鉴定。
1.5 假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB 试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne 或其他试剂条进行鉴定。
1.6 选定正确的试剂条以后，根据不同的API 试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API 鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2 革兰氏染色2.1 染色剂的配制2.1.1 结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h 使用，置密闭棕色瓶中储存。
1.7 碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml 水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml ，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
1.8 稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml ，摇匀。
2.2 操作:2.1.2 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
2.1.3 干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～3 次，以固定涂片。
2.1.4 染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本，染色1 分钟。
2.1.5 水洗：斜置玻片使很细水流的纯化水从染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止。
2.1.6 滴加碘液冲去残水并媒染约 1 分钟，用纯化水冲去碘液吸干。
2.1.7 滴加95%的乙醇脱色约20～30 秒，脱色时应将玻片微振动，使酒精分布均匀，立即用水冲净。
2.1.8 稀石碳酸红溶液染色 1 分钟后，用水洗净晾干或吸干。
2.1.9 镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100 倍物镜观察细菌革兰氏属性。
革兰氏阳性菌染色成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成红色，同时做阳性对照。
3 简单染色3.1 用于真菌与细菌的鉴别。
1.9 操作:2.3 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
2.4 干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～3 次，以固定涂片。
2.5 染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本，染色1 分钟。
2.6 水洗：斜置玻片使很细水流的自来水从染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止，自然晾干或吸干。
2.7 镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100 倍物镜观察菌体形态。
4 3%氢氧化钾试验2.1.10 材料3%KOH 溶液（W/V）、无菌木质牙签、待检菌的新鲜纯培养物（18～24 小时）。
2.1.11 操作3.2 在一洁净的载玻片上等距离滴上 3 滴3%KOH 水溶液。
3.3 用铜绿假单胞菌或具有等同反应的菌种作为阳性对照。
3.4 用枯草芽胞杆菌或具有等同反应的菌株作为阴性对照。
3.5 用木质牙签从培养基上分别挑取阳性，阴性和待检菌的新鲜纯培养物（18～24 小时）于载玻片上的 3 滴KOH 水溶液中。
3.6 然后用牙签快速环形搅动30～60 秒后，轻轻地向外拉该菌悬液，如果是革兰阴性细菌，在菌悬液和牙签之间有黏丝出现，如果是革兰阳性细菌则无黏丝出现。
3.7 结果判断4.2.6.1 如果在15 秒钟之内溶液的黏性增强并有黏丝形成，则认为该试验菌株的氢氧化钾呈阳性，试验菌株为G-。
4.2.6.2 如果溶液不产生粘丝，则试验菌株被判断为氢氧化钾试验阴性，试验菌株+。
为G4.2.6.3 当阳性和阴性试验结果均为典型反应时，该实验才有效。
5 触酶试验（过氧化氢酶试验）5.1 细菌代谢产生的过氧化氢对细菌细胞具有毒副作用，而细胞内的接触酶能催化过氧化氢，将其分解为分子态氧，使其解毒。
向含有接触酶的细菌培养物滴加过氧化氢溶液后即产生大量气泡（阳性）。
5.1 材料3%过氧化氢溶液、无菌木质牙签、洁净载玻片、滴管。
5.2 操作2.8 用无菌木质牙签挑取新鲜待检菌的纯菌苔置于洁净的载玻片上。
2.9 向玻片上的菌落滴加3%过氧化氢溶液一滴；或于琼脂培养物上直接滴加3% 过氧化氢溶液试液。
2.10 结果判断：立即观察结果，产生气泡为阳性反应，不产生气泡者为阴性反应。
用金黄色葡萄球菌或具等同性质的菌种重复以上步骤作为阳性对照，并用铜绿假单胞菌或具等同性质的菌种作为阴性对照。
2.11 注意事项2.1.12 阴性控制和阳性控制必须为典型反应时，该实验才有效。
2.1.13 当将过氧化氢溶液加到生长于血琼脂平板上的菌落时会产生假阳性结果（因为红细胞中含有过氧化氢酶）。
2.1.14 必须将过氧化氢酶溶液滴到菌落上，操作顺序不能颠倒，否则会产生假阳性结果。
2.1.15 不要用铂金类接种针或接种环去混合培养物和过氧化氢酶水溶液，因为接种针的铂金可以会引起假阳性结果。
因此在这个试验中，应用木质无菌牙签或是塑料类无菌接种环。
6 葡萄糖氧化/发酵试验3.8 氧化发酵培养基中含有较低浓度蛋白胨和较高浓度碳水化合物，待检细菌通过氧化或发酵利用葡萄糖产酸，使其pH 值下降，培养基中的指示剂由绿色变成黄色。
4.2.6.4 材料5.2 无菌矿物油：液体石蜡121℃半小时高压蒸汽灭菌。
5.3 氧化发酵培养基：葡萄糖10g，胰蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，琼脂4g，溴麝香酚蓝0.08g，去离子水1000ml ，pH6.6-7.0 。
分装于13×100mm 小试管中，121℃灭菌15 分钟。
竖直放置待其凝固后使用。
4.2.6.5 操作6.2.1 打开小试管。
1.10 用接种针挑取分离的单个纯菌落，刺入氧化发酵培养基约1cm 深，分别接种两个试管。
1.11 向其中一只试管内加入无菌矿物油，覆盖在培养基表面约1cm 高，作为发酵管（OF/F）；另一支不加矿物油作为氧化管（OF/O）。
1.12 以同样的方法在试管中接种大肠埃希菌或者是等同菌株作为阳性对照，接种铜绿假单胞菌或者是类同菌株作阳性对照。
2.12 培养：将接种后的发酵培养基放入35～37℃的培养箱中培养24 小时后观察结果，若结果呈阴性，则继续培养24 小时。
2.13 结果判断2.1.16 培养基变为黄色，反应结果记为阳性。
2.1.17 培养基仍保持均匀的绿色，反应结果记为阴性。
2.1.18 如果培养基的颜色由绿色变为蓝色，是由微生物产碱反应所致，记为阴性。
7 细胞色素氧化酶试验细胞色素氧化酶是一种铁卟啉类的酶，它将还原的细胞色素 C 氧化后以非活性的还原态存在。
而还原的细胞色素氧化酶因将电子传递给分子氧而又变成活性态。
在分子氧的存在下，细胞色素氧化酶和细胞色素 C 系统能还原一系列有机物。
其中，它将指示条反应区的α–萘酚和二甲基对苯二胺还原，会形成吲哚酚蓝分子，通过这一反应将细菌进行分类和鉴别。
3.9 材料细胞色素氧化酶检测指示条,指示条反应区的主要成分：二甲基对苯二胺0.1μmol、α-奈酚1.0μmol。
3.10 操作4.2.6.6 用牙签从培养基上挑取生长良好的单一菌落（菌落的pH 值不得低于 6.0，否则会出现假阴性结果）。
4.2.6.7 将菌落均匀涂在反应带上，过20～60 秒后，比较反应带的颜色。
4.2.6.8 若反应带变为紫到深紫色则为阳性反应，不变色或黄色为阴性反应。
8 基于系统发育分析的16S rDNA 序列测定与比对5.4 当药品无菌检查阳性或培养基灌装试验阳性时，需对基污染菌及与该污染菌相似的菌种进行分子水平上的菌种鉴定。
该类样品则其中送往测序公司进行序列测定。
9 洁净区环境控制-微生物鉴定表环境级别区域鉴定范围空气A 级人员鉴定至种表面空气鉴定至属（地面-革兰氏B 级人员染色）表面空气超标鉴定至属，其他革 C 级表面兰氏染色其他革兰氏染色附件：附录1 菌种鉴定标准操作规程流程图相关文件与记录：无培训范围：质量控制部全体人员参考文献：无编制历史与变更原因：本规程属于海南** 制药有限公司第一版文件。
版次号修订内容描述生效日期00 初建附录1 菌种鉴定标准操作规程流程图API 20NE阴性API 20E阳性杆菌发酵实验-细菌G形态观察球菌-G 球菌革兰氏染色菌种纯化杆菌+细菌G形态观察球菌API Strep阴性过氧化氢酶内生芽孢API Staph阳性API阴性API阳性。