鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames)
Ames试验
• 突变型菌株的某些特征有可能会在贮存过程中丢失或变异，所以 在Ames试验前必须对所有菌株进行基因型鉴定、自发回变数鉴 定及对鉴别性致突变物的反应鉴定。鉴定合格后才能用于试验， 否则应重新挑选菌种。
• Ames试验的方法分为点试验法、平板掺入法及预培养平板掺入
法。
B
8
应用
• 例如：用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌
B
5
Ames试验原理
B
S9是什么
6
• 因为许多外源化学物是间接诱变剂，需经过代谢活化转变为亲电
子的终致突变物才能与DNA反应，引起突变。鼠伤寒沙门氏菌缺
乏哺乳动物的代谢酶，微量检测直接及间接诱变剂，在进行
Ames试验时，应分别进行不加及加代谢活化系统的检测。而在
生物体内参与代谢活化的主要酶系是混合功能氧化酶系，所以，
• 为使受试物在体外测试中受到同活体类似
的代谢活化作用，在试验中采用将哺乳动
物的肝细胞微粒体（微粒体酶）及受氢系
统一并加入培养基中，进一步提高实验方
法的灵敏度。
B
4
• 标准试验菌株（配套菌株）：有四种 • TA98 、TA97：检测移码突变 • TA100：检测碱基置换突变 • TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感 • 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。 • 只有在四种试验菌株得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
• 该法适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。是应用最
广泛的检测基因突变的体外试验。
B
3
实验原理
• 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌 株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只 能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细 胞发生回复突变成野生型微生物，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。 据此来检定受试物是否具有致突变作用。
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames）
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames）
实验原理
1 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备S9混合液。
10％s9混合液的配制：每10mL由以下成分组成，临用时配制。
活化系统（s-9和s-9混合液）的制备
用哺乳动物如大鼠，经诱导剂处理，取肝组织制备匀浆，9000g 离心，上清液为s-9组分，与辅助成分以适当比例组成s-9混合液，用作试验中的代谢活化系统。
磷酸盐缓冲液（0．2mol/L，pH7．4） 6．0mL
氯化钾溶液（1．65mol/L） 0．2mL
氯化镁溶液（0．4mo1／L） 0．2mL
葡萄糖-6．磷酸盐溶液（0．05mol/L） 1．0mL
辅酶-Ⅱ溶液（0．025mol/L） 1．6mL
肝s-9液 1．0mL
混匀，置冰浴中待用。
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
五菌株鉴定和保存
四种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反
应鉴定，合格后才能用于致突变试验。
1.菌株基因型鉴定
}I)组氨酸营养缺陷鉴定(组氨酸需求试验):
取两个底层培养基、其中一组于培养基表面涂加0. 1毫升0.
培养基成分或试剂除说明外，应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当
保存温度和期限。
2.培养基制备_
C1)营养肉汤培养基
牛肉膏2. 5g
胰陈(或混合蛋白膝)5. 0g
氯化钠2. 5g
磷酸氢二钾(KZHPO}.3H20 ) }. . 3 g
蒸馏水至500mL
加热溶解，调pH至7. 4，分装后0. 103MPa 20min灭菌，4℃保存备用。C2}?营养肉汤琼脂培养基:
迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37艺培养拐介时观察结果。
二，点试法
在攻层培养平皿上写上记号。取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2m } )，加
人是试菌菌涛}_ }h-(_pmt }}}}(} }3}r,，、。"} } }}二_;、}1} .,e} \}
肝S9液1. 0 mL
混匀，置冰浴待用。菌株及增菌培养
试验菌株
四
采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97, TA98, TA100和TA102 o TA97, TA98可检侧
移码型诱变剂:TA100可检测碱基置换型诱变剂;TAZOZ检出移码型和碱基置换型诱变剂。
这4种标准菌株除均有组氨酸突变(his)外还有一些附加突变，可以提高试验菌株对致突
鼠伤寒沙门氏菌试验(Ames试验)文献综述
文献综述：鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）摘要：食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题的重要方面。
美国科学家Dr. Bruce Ames及其同事创立了一种方法，叫鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），它是利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。
关键词：鼠伤寒沙门氏菌试验；基本原理；一般步骤；应用及其研究进展；1 前言污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。
世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。
美国科学家Dr. Bruce Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。
该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。
众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames 试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames 试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等[1]。
2 定义2.1 回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
简述 ames 实验的步骤及可能产生的结果？本实验中还应注意哪些方面？
简述 ames 实验的步骤及可能产生的结果？本实验中还应注意哪些方面？
1. 实验步骤：
- 制备测试菌株：使用经过基因突变处理的鼠伤寒沙门氏菌作为测试菌株。
- 制备测试物质：将待测化学物质进行适当的溶解和稀释。
- 平板涂布：将测试菌株和测试物质分别涂布在含有营养物质的琼脂平板上。
- 培养平板：将涂布好的平板放置在适宜的温度下进行培养，通常为 37°C。
- 观察结果：培养一段时间后，观察平板上的菌落数量和形态。
2. 可能产生的结果：
- 阳性结果：如果平板上出现了大量的回变菌落，说明测试物质具有致突变性。
- 阴性结果：如果平板上的回变菌落数量很少或没有，说明测试物质不具有致突变性。
- 可疑结果：如果平板上的回变菌落数量介于阳性和阴性之间，需要进一步的实验验证。
在进行 Ames 实验时，还应注意以下方面：
1. 质量控制：使用标准阳性和阴性对照物质进行质量控制，确保实验结果的准确性。
2. 剂量效应：确定合适的测试物质浓度范围，观察剂量效应关系。
3. 重复性：进行多次重复实验，确保结果的可重复性。
4. 安全性：遵循实验室安全操作规程，确保实验人员的安全。
Ames 实验是一种初步的致突变性检测方法，对于检测化学物质的潜在致癌性具有重要意义。
但需要注意的是，Ames 实验结果仅提供初步的筛选信息，不能确定化学物质对人体的致癌风险，需要进一步的研究和评估。
Ames试验
Ames试验原理
S9是什么
• 因为许多外源化学物是间接诱变剂，需经过代谢活化转变为亲电子的终致突 变物才能与DNA反应，引起突变。鼠伤寒沙门氏菌缺乏哺乳动物的代谢酶， 微量检测直接及间接诱变剂，在进行Ames试验时，应分别进行不加及加代 谢活化系统的检测。而在生物体内参与代谢活化的主要酶系是混合功能氧化 酶系，所以，在Ames试验中加入的代谢活化系统应主要是混合功能氧化酶 系，一般是加入S9混合液。S9即经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆，经 9000r/min离心得到的上清液。在S9中再加入一些辅助因子，如辅酶Ⅱ （NADP+）、葡萄糖-6-磷酸，K+、Mg2+及缓冲液等组成S9混合液（S9mix）
• 为使受试物在体外测试中受到同活体类似 的代谢活化作用，在试验中采用将哺乳动 物的肝细胞微粒体（微粒体酶）及受氢系 统一并加入培养基中，进一步提高实验方 法的灵敏度。
• 标准试验菌株（配套菌株）：有四种 • TA98 、TA97：检测移码突变 • TA100：检测碱基置换突变 • TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感 • 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。 • 只有在四种试验菌株得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
• 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。 • 加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。 • 突变型菌株的某些特征有可能会在贮存过程中丢失或变异，所以在Ames试
验前必须对所有菌株进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物 的反应鉴定。鉴定合格后才能用于试验，否则应重新挑选菌种。 • Ames试验的方法分为点试验法、平板掺入法及预培养平板掺入法。
• 不足之处 • 微生物的遗传信息仅为哺乳动物的1/6； • 微生物的DNA修复系统没有哺乳动物复杂而精巧； • 微生物无免疫功能，而哺乳动物则具有复杂的免疫监视机能。 • 少数不在肝脏中进行代谢转化的外来化合物，本法不能检出其突变性，如苏
ames试验的基本原理
ames试验的基本原理一、引言Ames试验是一种常用的基因毒性测试方法，被广泛应用于药物、化学品、食品等领域。
该试验的基本原理是通过检测某种物质对细菌的致突变作用来评估其对人类健康的潜在危害性。
本文将详细介绍Ames试验的基本原理。
二、Ames试验的背景Ames试验最早由美国加州大学伯克利分校的Bruce Ames教授于1975年提出，其初衷是为了寻找一种简单快捷、灵敏可靠的方法来筛选化学物质是否具有致癌作用。
随着科技发展和实验方法改进，Ames 试验逐渐成为了一种广泛应用于基因毒性测试中的标准方法。
三、Ames试验原理Ames试验使用Salmonella鼠伤寒杆菌（Salmonella typhimurium）作为实验生物，利用它们对组氨酸（histidine）生长需要这一特点进行检测。
实验过程中将待测化合物与Salmonella鼠伤寒杆菌接触，观察是否会引起它们突变从而使其不再需要组氨酸即可生长。
如果待测化合物能够引起突变，使Salmonella鼠伤寒杆菌从无法生长转变为可以生长，则说明该化合物具有致突变作用。
四、Ames试验的步骤1. 选取适当的Salmonella菌株：选择对组氨酸敏感的Salmonella菌株（如TA98、TA100等）。
2. 制备试验培养基：制备含有必需营养成分和组氨酸的培养基。
3. 预处理细胞：将细胞培养在无组氨酸的培养基中，使其处于低代谢状态。
4. 处理细胞：将待测化合物加入到培养基中，与Salmonella菌株接触一定时间。
5. 涂布平板：将处理后的细胞涂布在含有少量组氨酸和其他必需营养成分的平板上，进行孵育。
6. 计数突变菌落数：观察是否有突变菌落出现，并计数其数量。
若突变菌落数量显著高于对照组，则说明待测化合物具有致突变作用。
五、Ames试验的优缺点1. 优点：Ames试验具有灵敏度高、可重复性好、操作简单等优点，可以快速筛选出具有致突变作用的化合物。
2. 缺点：Ames试验只能检测化合物对细菌的致突变作用，而不能直接评估其对人体健康的潜在危害性。
鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验
现性即可认为该受试物
为诱变阳性。
S-9混合液的制备过程
暴露肝脏，KCL灌注
2
断头处死大鼠、放血、去皮
1
毒理学基础实验课 3 取出肝脏，加入KCL剪碎
取上清、分装、冻存
5
4 制成匀浆，9000g离心
S-9混合液的组成成分
毒理学基础实验课
肝匀浆S-9
100 μl
0.4mol/L MgCl2
设立阳性对照和阴性（溶剂）对照
Ames试验方法及结果评价
毒理学基础实验课
点试法
点样纸片周围长出一 圈密集的His+回变菌 将顶层培养基倒入底层培养基中，落凝者，受试物即为阳 固后放入滤纸片，将受试物点在纸性片致突变物质。
上放入底层，37℃培养48h观察结果
掺入法
将受试物0.1ml、菌液0.1ml分别加背入景菌生长良好受试物 顶层培养基中，倒入底层培养基中每，皿回变菌落数增加一 凝固后37℃培养48h观察结果 倍以上并有剂量-反应
TA97
+
+
+
-
+
自发回变 （-S9）
90-180
TA98
+
+
+
-
+
30-50
TA100
++Fra bibliotek+
-
+
120-200
TA102
+
+
+
-
+
240-320
Ames试验设计
毒理学基础实验课
受试物最低剂量为每皿0.1μg 受试物最高剂量为每皿5mg
艾姆斯试验法
❖ Salmonellatyphimurium(鼠伤寒沙门氏菌的组 氨酸缺陷型(hisˉ)菌株在基本培养基[-]的平板 上不能生长，如发生回复突变则能生长。含 可疑“三致”物例如黄曲霉毒素、二甲氨基 偶氮苯(奶油黄)或“反应停”的试样，加入鼠 肝匀浆，保温一段时间后，吸入滤纸片中， 然后将滤纸片放置于上述平板中央 。
Ames试验（Amesห้องสมุดไป่ตู้test)
❖ Ames试验全称污染物致突变性检测。 ❖ 一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测
环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便方 法。
Ames试验原理
❖ 用遗传学方法培植一种不能自行制造组氨酸的鼠伤 寒沙门氏菌的变异体，这种菌株在无组氨酸的培养 基中不能生长。如果将这种菌株与化学致癌物一起 培养，则可使其DNA（脱氧核糖核酸）再次突变， 恢复到能制造组氨酸的原型（野生型），即在无组 氨酸的培养基中也能生长。利用这一特征性变化来 测试化学物质有无致突变作用，也即致癌性，并根 据生长的菌落数目还可以判定其致癌性的强弱。
❖ 经培养后，出现三种情况：如在平板上无大 量菌落产生，说明试样中不含诱变剂；如在 纸片周围有一抑制圈，其外才是大量菌落， 说明试样中某诱变剂的浓度很高；如在纸片 周围即长大量菌落，说明诱变剂的浓度合适。
❖ 艾姆斯试验是较受重视的快速初筛化学致癌 物的试验方法。艾姆斯试验是快速地鉴别化 学品、新农药和新食品添加剂的致癌性，作 为致癌物质的筛选法而被广泛应用,可以检测 许多物质的致癌性。
Ames
点试法
掺入法
背景菌生长良好受试物 将受试物0.1ml、菌液0.1ml分别加入 每皿回变菌落数增加一 顶层培养基中，倒入底层培养基中， 倍以上并有剂量-反应 凝固后37℃培养48h观察结果 关系，试验结果具有重 现性即可认为该受试物 为诱变阳性。
毒理学基础实验课
七、溶剂的选择 如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂； 如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突 变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、
丙酮、95%乙醇。
一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按
每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定
加入量为100l。
滤纸片（有结晶紫） 抑菌环
0.1ml菌液
37℃24h
顶层
普通培养基
毒理学基础实验课
3、紫外线敏感特性
原理：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长， 而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。 鉴定方法：用灭菌牙签分别将菌株划线接种于普通培养基上，打开平皿盖，用 灭菌黑布盖住一半培养基，用15W紫外灯在距离33cm处照射8s，37℃温箱培养 18h~24h。 结果判断：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具 有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。
诱导 －最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯 联苯（PCB混合物），
－选择健康雄性大鼠体重200g左右，
－一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。
诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验原理
1 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备S9混合液。
10％s9混合液的配制：每10mL由以下成分组成，临用时配制。
活化系统（s-9和s-9混合液）的制备
用哺乳动物如大鼠，经诱导剂处理，取肝组织制备匀浆，9000g离心，上清液为s-9组分，与辅助成分以适当比例组成s-9混合液，用作试验中的代谢活化系统。
磷酸盐缓冲液（0．2mol/L，pH7．4） 6．0mL
氯化钾溶液（1．65mol/L） 0．2mL
氯化镁溶液（0．4mo1／L） 0．2mL
葡萄糖-6．磷酸盐溶液（0．05mol/L） 1．0mL
辅酶-Ⅱ溶液（0．025mol/L） 1．6mL
肝s-9液 1．0mL
混匀，置冰浴中待用。