酶联免疫吸附法(ELISA)检测霉菌毒素
酶联免疫吸附法(ELISA)检测霉菌毒素
酶联免疫吸附法（ELISA）检测霉菌毒素霉菌毒素主要是指霉菌在其所污染的食品或是饲料中产生的有毒代谢产物，在饲料的加工、运输和贮存过程中都可能会产生。
据统计，已知的霉菌毒素有300多种，常见的毒素有：黄曲霉毒素，玉米赤霉烯酮/F2毒素，赭曲毒素，T2毒素，烟曲霉毒素，赭曲霉毒素，呕吐毒素，麦角毒素等。
霉菌毒素污染多为复合型，饲料中大多存在3种以上的霉菌毒素污染。
霉菌毒素通过饲料或食品进入人和动物体内，引起人和动物的急性或慢性毒性，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等。
因此，霉菌毒素的检测必须引起重视，防患于未然。
1霉菌毒素检测方法饲料中霉菌毒素检测方法主要有目测法，薄层色谱法（TLC），高效液相色谱法（HPLC），酶联免疫吸附法（ELISA），放射免疫法（KIA）及快速试纸检测法。
其中酶联免疫吸附法（ELISA）此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
经过三四十年发展，ELISA技术已经作为一个成熟的快速筛选方法，应用于不同的行业，美国USDA，EPA将众多ELISA的方法作为官方快速筛选方法。
2酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法（ELISA）的基本原理是，在合适的载体上，酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合成酶标记抗体抗原复合物，在酶底物的参与下，复合物上的酶催化底物使其水解成为另一种带色物质，其核心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色深浅来进行分析。
该法优点突出，1）灵敏度高，干扰小：抗体抗原的免疫反应特异性很强，结构类似物、荧光物质、有色物质对检测的干扰很小。
2）操作简便快捷：由于特异性强，简化了样品的预处理和提取纯化过程，同时测定时间短。
3）安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂贵的测定仪器，且所用试剂也相对较少，毒素标准品的浓度可以很低，减少了对检测人员和环境的潜在危害和污染。
尤其适用于大批量样品的快速测定。
3试剂盒ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
评估霉菌毒素脱毒产品的体外方法
评估霉菌毒素脱毒产品的体外方法
霉菌毒素是一类由霉菌产生的毒素，可以对人体造成严重的健康危害。
为了保障食品卫生安全，必须进行有效的霉菌毒素脱毒。
目前，已经开发了一些体外方法来评估霉菌毒素脱毒产品的效果。
本文将对这些体外方法进行评估。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）也是一种常见的体外方法。
该方法利用特异性抗体与霉菌毒素结合，然后使用酶标记二抗进行检测。
ELISA方法具有简便快速、不需要昂贵的仪器设备和专业操作人员等优点。
该方法的灵敏度和准确性相对较差。
核酸检测方法也可以用于评估霉菌毒素脱毒产品的效果。
聚合酶链反应（PCR）可以检测霉菌毒素产生菌株的存在，从而评估脱毒效果。
PCR方法具有高度灵敏度和特异性，但也需要相对复杂的实验室设备和技术。
细胞实验也是一种常用的体外方法。
通过将霉菌毒素脱毒产品或样品与细胞培养物共同处理，观察细胞的存活率、细胞毒性等指标，从而评估脱毒效果。
细胞实验具有操作简便、灵敏度高等优点，但缺点是并不能真实反映人体内的毒素代谢和清除过程。
动物模型也可以用于评估霉菌毒素脱毒产品的效果。
将霉菌毒素脱毒产品注射到小鼠体内，观察其对小鼠的影响，从而评估脱毒效果。
动物模型能够更真实地模拟人体内的情况，但其操作复杂、时间周期长，并且存在动物伦理道德等问题。
评估霉菌毒素脱毒产品的体外方法有多种选择，每种方法都具有其优缺点。
在实际应用中，可以根据需求和实际情况选择合适的方法来评估霉菌毒素脱毒产品的效果。
黄曲霉毒素B1酶联免疫定量检测试剂盒 说明书
1ELISA kit for quantitative detection of aflatoxin B1一、概要黄曲霉毒素主要是两种霉菌黄曲霉及 A.paraticus的二级代谢物。
这些霉菌在湿热的环境和耕作土地上污染的植物产生。
黄曲霉毒素B1（AFB1）属于自然最强烈的致癌物质，它一般产生于花生、玉米、巴西坚果和棉花种子中。
本试剂盒利用酶联免疫吸附测定法（ELISA）对各种谷物、饲料及其他食品中的AFB1含量进行快速、定量检测。
二、原理本试剂盒是利用直接竞争酶联免疫吸附微孔模式进行检测，灵敏度可达0.1 µg/kg（ppb）。
样品或标准品中游离的黄曲霉毒素B1与酶标抗原竞争结合包被在微孔中的抗体上的结合位点，经洗板洗去多余的酶标抗原与黄曲霉毒素B1后加入显色剂与反应底物，其与酶标物作用而成蓝色，加入反应停止液后颜色由蓝色转变为黄色，黄色越深则表明黄曲霉毒素B1越少，用酶标仪在450 nm处测定光吸收值可准确定量检测样品中的黄曲霉毒素B1的污染水平。
三、试剂盒构成1、反应板支架……………………………………………………………………………1块2 黄曲霉毒素B1抗体包被反应板……………………………………………………96孔3、黄曲霉毒素B1标准品溶液（0 ppb，0.1 ppb，0.25 ppb，0.5 ppb，1 ppb，2 ppb）…1套4、酶标记物…………………………………………………………………4瓶5、酶稀释液……………………………………………………………………1瓶6、样品稀释液………………………………………………………………1瓶7、显色剂溶液………………………………………………………………………1瓶8、反应底物溶液………………………………………………………………1瓶9、终止液………………………………………………………………………………1瓶10、浓缩洗涤液（20 X）………………………………………………………1瓶四、注意事项1、试剂盒请置放于2-8℃条件下保存，使用过程中不要让微孔干燥，使用后立即将试剂放回至2-8℃条件下冷藏。
酶联免疫吸附法检测饲料中赭曲霉毒素A
酶联免疫吸附法检测饲料中赭曲霉毒素A摘要：将赭曲霉毒素A进行化学修饰，制备赭曲霉毒素A半抗原及人工抗原，免疫动物，并通过单克隆抗体技术制备了赭曲霉毒素A的单克隆抗体及酶标记抗体，建立赭曲霉毒素A的酶联免疫吸附法。
结果表明，该法灵敏度为1 μg/L，在20 μg/kg和40 μg/kg的加标水平下，赭曲霉毒素A在饲料（浓缩料、配合料和原料）的回收率为81.8%～96.1%，变异系数为8.3%～12.2%。
本法适用于饲料样本中赭曲霉毒素A的检测。
关键词：酶联免疫吸附法；单克隆抗体；赭曲霉毒素A；饲料赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）是一种真菌毒素，主要由产毒曲霉菌和青霉菌产生，常污染食品和饲料[1，2]。
赭曲霉毒素A能引起动物急性和慢性中毒，是强致癌物，对肾脏造成不可逆的致死毒害，还可导致胎儿畸形、流产甚至死亡，其对人类的潜在危害备受关注[3，4]。
国际癌症研究机构在1993年将其定为人类可能致癌物，赭曲霉毒素A广泛存在于农产品及畜产品中，通过污染食物和饲料直接或间接进入人类食物链，因此有必要加强对赭曲霉毒素A的检测[5，6]。
目前，赭曲霉毒素A的残留分析方法主要有免疫学检测方法和仪器分析方法，仪器检测方法主要通过其荧光特性进行高灵敏度检测，其样本处理过程一般较复杂，检测成本较高；免疫分析法是以抗原抗体免疫化学反应为基础进行测定的方法，具有灵敏度高、快速简便等优点[7，8]。
本试验建立了基于单克隆抗体的ELISA法检测赭曲霉毒素A，其灵敏度高、快速简便，适用于饲料中赭曲霉毒素A的快速批量检测。
1 材料与方法1.1 样品与主要试剂饲料（浓缩料、配合料、原料）样品购于贵阳某农贸市场，均质后置于4 ℃，待测。
赭曲霉毒素A标准品，购自中国兽医药品监察所；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OV A）、辣根过氧化物酶（HRP），购自Sigma公司；其他常规试剂，除特别注明外均购自北京化学试剂公司。
1.2 主要仪器MK3酶标仪（美国热电雷勃仪器有限公司）；96孔酶标板（美国Costar公司）；TDL-40B离心机（上海安亭）。
酶联免疫法(ELISA)检测饲料中黄曲霉毒素B1
１５ ｍＬ分 液漏 斗 中 ， 入 ２ Ｌ三氯 甲烷 ， 塞 ２ 加 ０ｍ 加
轻摇 ３ｒｉ， 置 分层 。放 出下 层 三氯 甲烷 层 ， ｎ静 ａ 经 盛 有约 ５ ｇ 先用 三氯 甲烷湿 润 的无水 硫酸钠 过 预
滤 器 于 １０ ｍ ０ Ｌ蒸 发 皿 中 。再 加 ５ ｍＬ三 氯 甲烷
恒 温培 养箱 、 量移 液器 、ｕ ： ｅ型 酶标 微 Ｓ ｎｓ Ｒ ｅ
仪（ 天美）涡漩 式振荡 器 。 上海 、
一
１— ８
维普资讯
江西 饲料
２ ｏ 第 ６期 ｏ ６年
于分 液 漏 斗 中 。 复振 摇 提 取 ， 重 三氯 甲烷 层 一 并 滤 于 蒸 发 皿 中 。最 后 用 少 量 三 氯 甲烷 洗 涤 过 滤 器， 洗液 并 于蒸发 皿 中 ，５ ６ ℃水 浴通 风挥 干 。挥 干 冷 却后 ， 准确 加入 １． ｍＬ甲醇 水（： ， ００ １１ 将蒸 发 皿 ） 中的凝 结物 充分 溶解 。
１ 方法原 理
架 。每瓶酶标抗 原 中准确 加入 １ Ｌ酶标抗 原稀 ．ｍ ５ 释液 。 充分溶解 ， 配成 实验用酶标抗 原溶 液 ，— ２８℃ 保存 。浓缩洗涤液用 ３０ｍＬ ０ 蒸馏水配制成洗涤液。
３ 样 品的制 备
３１ 一般 饲料 ．
称 取 ５０ ｇ样 品 于 １０ ． ０ ｍＬ具 塞 三 角 瓶 中 ， 准 确 加 入 ２． ｍ ５ Ｌ甲醇 水（：） 液 ， 荡 １ ｎ ０ １１溶 振 ５ｍｉ，
甲醇 、 蒸馏 水 、 氯 甲烷 、 三 无水 硫 酸钠 、 曲 黄 霉毒 素 Ｂ 测试 盒 。 ｌ
黄曲霉毒素 Ｂ 测试盒的组成 ：包被抗体 的 ｌ
反应 板 、 品稀释 液 、 Ｆ 样 Ａ Ｂ标 准溶液 （ ．，．， ， ， ０１０５ １５
酶联免疫吸附法检测饲料中黄曲霉毒素B1
１ ． ２ 试 验 样 品
成猪体消化机 能紊 乱 ，食欲减退 、营养不 良、贫 血 、免 疫 抑 制 、增 重 减 缓 和 生 长 发 育 停 滞 ，Ａ Ｆ Ｂ 。 超标导致仔猪生产性能下降 一 １ 。 １ 试验 材 料 与方法
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ａｆ ｌ ａ ｔ ｏ ｘ ｉ ｎ ｉ ｓ ａ ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ａ ｒ ｙ ｍｅ ｔ ａ ｂ ｏ ｌ ｉ ｔ ｅ ｏ ｆ ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｌ ｆ ａ ｖ ｕ ｓ ａ ｎ ｄ ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｐ ａ ｒ ａ ｓ ｉ ｔ ｉ ｃ ｕ ｓ ， ｈ ａ ｓ ａ ｓ ｔ ｒ ｏ ｎ ｇ ｃ ａ ｒ —
强。为 了解 绵阳 市仔 （ 乳） 猪饲料 中黄 曲霉毒素 Ｂ 。 污染情 况 ，制定 防治和保护措施提供 依据 ，利 用酶联免疫吸 附
Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ原理对 ２ ０个品牌 （ 品种 ） 仔猪饲料进行检 测 ，结果显示总体情况 良好 ，但 仍有隐患。
关键词 ：饲料 ；仔猪 ；黄 曲霉毒素 ；酶联免疫吸附
Ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｉ ｓ检测 分析
酶联免疫吸附法检 测饲料 中黄 曲霉毒素 Ｂ
苟 双
（四川省绵阳市饲料质量监督所，四川 绵阳 ６ ２ １ ０ ０ ０）
摘
要 ：黄 曲霉毒素是黄 曲霉和寄 生曲霉的 次级代谢 物，具有 强烈的致癌、致畸和致突变的作用 ，危害性很
ＧＯＵ Ｓ ｈ ｕ ａ ｎ ｇ
（Ｆ ｅ ｅ ｄ Ｑ ｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ Ｓ ｕ ｐ ｅ ｒ ｖ ｉ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｍｉ ａ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ Ｃ ｉ ｔ ｙ Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ， Ｍｉ ａ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ ６ ２ １ ０ ０ ０ ， Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
实验四 酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素
实验四酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素一、实验目的了解ELISA的基本原理，及其优缺点；掌握间接ELISA法的试验操作过程。
二、实验原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种。
本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液）及黄曲霉毒素B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素B1 与黄曲霉毒素B1酶标记物竞争黄曲霉毒素B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被除去。
将基质/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在450nm 处测量，吸收光强度与样品中黄曲霉毒素B1的浓度呈负相关。
三、实验器材1、ELISA试剂盒其组成如下：1.1 包被抗体的反应板48孔1.2 A试剂：样品稀释液l瓶1.3 B试剂：AFB1标准溶液l套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL)1.4 C试剂：酶标抗原l瓶1.5 D试剂：酶标抗原稀释液l瓶1.6 E试剂：浓缩洗涤液l瓶1.7 F试剂：显色底物液a l瓶1.8 G试剂：显色底物液b l瓶1.9 H试剂：终止液l瓶1.10 反应板框架l块2、仪器1.1酶标仪(内置450nm滤光片)1.250µL微量移液器及配套吸头1.3 恒温培养箱(0℃-50℃)1.4冰箱(4℃-8℃)1.5 感量0.0lg的天平1.6调速振荡器或超声波清洗器1.7 离心机5000r/min1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移液管等1.8 小型粉碎机或碾钵1.9其它：滤纸，吸水纸等四、实验步骤1、实验准备1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标准及样品稀释表”1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)称取5.0g样品(已粉碎)于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.00mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去l/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液。
霉菌毒素酶联免疫分析ELISA
如有帮助，欢迎支持。
霉菌毒素酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
1 使用目的：本试剂盒用于肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉）中霉菌毒素残留的定量检测。
2 实验原理本试剂盒采用竞争ELISA方法，在微孔板包被有霉菌毒素偶联抗原，加入霉菌毒素标准品或样品，游离霉菌毒素与微孔条上预包被的霉菌毒素偶联抗原互相竞争抗霉菌毒素抗体酶标记物，用TMB底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中霉菌毒素含量成反比，通过标准曲线计算样品中霉菌毒素的含量。
3 试剂盒组成3.1 预包被的霉菌毒素偶联抗原的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。
3.2霉菌毒素标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb。
3.3抗霉菌毒素抗体酶结合物：1瓶（6ml）。
3.4显色液A：1瓶（6ml）。
3.5显色液B：1瓶（6ml）。
3.6终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7样本稀释液：1瓶（10×, 6ml），用于样品稀释用。
3.8浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9说明书一份。
4 需要而未提供的材料4.1 设备4.1.1波长450nm酶标仪。
4.1.2粉碎机。
4.1.3量筒。
4.1.4振荡器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman No 1或相当的滤纸。
4.1.7微量移液器。
4.2 试剂4.2.1去离子水或蒸馏水。
4.2.2 甲醇。
5 贮存5.1 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存6 注意事项6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
6.2 不要使用过期试剂盒。
6.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。
6.4 标准品中含有霉菌毒素，使用时应特别注意，操作时应带手套。
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酶联免疫吸附法（ELISA）检测霉菌毒素
霉菌毒素主要是指霉菌在其所污染的食品或是饲料中产生的有毒代谢产物，在饲料的加工、运输和贮存过程中都可能会产生。
据统计，已知的霉菌毒素有300多种，常见的毒素有：黄曲霉毒素，玉米赤霉烯酮/F2毒素，赭曲毒素，T2毒素，烟曲霉毒素，赭曲霉毒素，呕吐毒素，麦角毒素等。
霉菌毒素污染多为复合型，饲料中大多存在3种以上的霉菌毒素污染。
霉菌毒素通过饲料或食品进入人和动物体内，引起人和动物的急性或慢性毒性，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等。
因此，霉菌毒素的检测必须引起重视，防患于未然。
1霉菌毒素检测方法
饲料中霉菌毒素检测方法主要有目测法，薄层色谱法（TLC），高效液相色谱法（HPLC），酶联免疫吸附法（ELISA），放射免疫法（KIA）及快速试纸检测法。
其中酶联免疫吸附法（ELISA）此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
经过三四十年发展，ELISA技术已经作为一个成熟的快速筛选方法，应用于不同的行业，美国USDA，EPA将众多ELISA的方法作为官方快速筛选方法。
2酶联免疫吸附法（ELISA）
酶联免疫吸附法（ELISA）的基本原理是，在合适的载体上，酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合成酶标记抗体抗原复合物，在酶底物的参与下，复合物上的酶催化底物使其水解成为另一种带色物质，其核心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色深浅来进行分析。
该法优点突出，1）灵敏度高，干扰小：抗体抗原的免疫反应特异性很强，结构类似物、荧光物质、有色物质对检测的干扰很小。
2）操作简便快捷：由于特异性强，简化了样品的预处理和提取纯化过程，同时测定时间短。
3）安全性高，污染少，成本低廉：不需要昂贵的测定仪器，且所用试剂也相对较少，毒素标准品的浓度可以很低，减少了对检测人员和环境的潜在危害和污染。
尤其适用于大批量样品的快速测定。
3试剂盒
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
根据待测物的情况及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
如：双抗体夹心测抗原、双抗体夹心测抗体、间接法测抗原、间接法测抗体、竞争法测抗原、竞争法测抗体等，目前的试剂盒大多属于抗体包被直接竞争ELISA法。
目前国际上比较认可的霉菌毒素检测模式是，试剂盒筛选加大型仪器确证方法配合使用。
试剂盒应用于样品的实验室快速筛选，结果准确性比较高，对于大批量的样品测定分析可有效节约成本，缩短分析时间。
4试剂盒实验示例
1，称粉碎好的样品5g
2，加入0.5gNaCl
3，加入25mL70%甲醇/水
4，超声萃取5min
5，4000转离心5min
6，离心后的样品取上清液过玻璃纤维滤纸过滤
7，加入100ul的酶标记物到混合孔，再加入50ul的标准品及样品到相应混合孔，混匀后转移100ul到相应的测试孔中。
加入50ul抗体到对应的每一个测试孔。
8，震荡5s，20-28℃孵育10min
9，清洗液洗板4次
10，加入100ul显色液,显色8min
11，显色8min后
12，加入100ul停止液，读板。
根据与标准品的颜色比对来进行快速筛选，对于霉菌毒素处于国家规定限量范围左右的样品可再通过大型仪器进行更精准的定量分析。
Beacon试剂盒
Casco试剂盒和免疫亲和柱
Casco试剂盒采用国外的固相包被技术，且固相载体包被的是二抗，稳定性更高质量可靠，超高的性价比，现更可提供试用机会，另外也供应Beacon和Casco免疫亲和柱，可用于前处理起提取净化作用。