高效液相色谱--仪器分析实验教案
高效液相色谱原料及教案
HPLC系统一般由储液器、输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。 工作流程是：储液器中的流动相被高压泵打入系统样品溶液经进样器进入流动相，呗流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附-解析的分配过程，各组分在移动速度上
Inject
t
R
W
W
Time
1/2
B
理论塔板数和理论塔板高度的计算方法
理论塔板数 N = 16(tR/WB)2 = 5.54(tR/W1/2)2 理论塔板高度 HETP = L/N
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易(tR/W1/2)2
标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 峰面积(peak area，A)——峰与峰底所包围的面积。
应用最普遍的反相色谱
反相色谱：基于分子的极性分离 洗脱次序：极性高的先被洗脱 常用的流动相： 水和有机溶剂如甲醇、乙腈 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： C18、C8、苯基等基团 反相色谱固定相多为键合相
正相色谱与反相色谱的比较
二、基本概念
1．色谱图和峰参数
色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
高效液相色谱分析实验讲义
高效液相色谱分析实验一、实验目的1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法3．评价色谱柱效4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；5．学习未知样品的定量分析方法。
二、实验原理不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。
色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等1．色谱定性分析方法（1）利用保留值与已知物对照定性A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性）2．色谱定量分析方法⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。
⑵常见的色谱定量分析方法主要有：a 归一化法。
特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。
b内标法。
特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。
c 标准曲线法（外标法）。
简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。
d 内标标准曲线法。
三、仪器与试剂LC-1000型高效液相色谱仪P3000A-UV3000型高效液相色谱仪甲醇(色谱纯) 二次去离子水苯甲苯苯－甲苯四、高效液相色谱仪操作步骤1. 流动相的预处理用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。
2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。
排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。
高效液相色谱实验
高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习《基础分析化学实验（第二版）》137－140页。
【目的】(1) 了解高效液相色谱仪的工作原理；(2) 学习评价液相色谱反相柱的方法。
【原理】高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。
它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。
色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的。
而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。
评价色谱柱的性能参数主要有：（1）柱效（理论塔板数）n式中t r 为测试物的保留时间，W 1/2为色谱峰的半峰宽。
（2）容量因子k’式中t 0为死时间，通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。
(3) 相对保留值（选择因子）α式中k 1’和k 2’分别为相邻两峰的容量因子，而且规定峰1的保留时间小于峰2的。
(4) 分离度R s式中t r1、t r2分别为相邻两峰的保留时间，W b1、W b2分别为两峰的底宽。
对于高斯峰来讲，W b =1.70W 1/2。
为达到好的分离，我们希望n 、α和R s 值尽可能大。
一般的分离（如α=1.2，R s =1.5），需n 达到2000。
柱压一般为104 kPa 或更小一些。
本实验采用多核芳烃作测试物，尿嘧啶为死时间标记物，评价反相色谱柱。
【仪器和试剂】Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i 进样器，440检测器和记录仪组成）色谱柱：5 cm ×4.6 mm I.D., YWG-C 18H 37 (ODS)，10 μm流动相：甲醇－水(80+20)样品I ： 含尿嘧啶 (0.010 mg ·mL －1)、萘 (0.010 mg ·mL －1)、联苯 (0.010 mg ·mL －1)、菲（0.006 mg ·mL －1）的甲醇混合溶液；样品I I ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液。
《仪器分析》教案课件PPT-第5章 高效液相色谱法PPT文档
2017-动相为液体，固定相为固体吸附剂。根据不同组分在固定 相上的吸附能力不同而加以分离。
吸附剂
溶质 溶剂
2017-6-620
吸附剂
二、液液分配色谱法（LLC）
流动相和固定相都是液体。 分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
第五章高效液相色谱法
HighPerformanceLiquidChromatography HPLC
气相色谱中的“气相”代表什么意思？ 气相色谱：流动相是气体 液相色谱：流动相是液体
2017-6-62
第一节高效液相色谱法的特点
一、高效液相色谱法（HPLC） 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色 谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离 柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分
尺寸排阻色谱法的分离机制：体积排阻效应
样品分子 凝胶珠
流动相
溶质在两相间不 是靠其相互作用 力的不同来进行
分离； 而是按照分子大 小进行分离的； 大分子物质先洗 脱出来，小分子
2017-6-626物质后洗脱出来
孔道
凝胶珠内具有一定大小的孔穴， 体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出 来； 中等体积的分子部分渗透；
2017-6-611
2017-6-612
2017-6-613
六通阀
高压泵
进样前
色谱柱
进样中 （Load）
进样后 （Inject）
4.色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，柱内径 4.6mm或3.9mm，长度15～30cm，不 锈钢柱，填料颗粒5～10μm，柱效为 7000～10000理论塔板数/m。
内蒙古职校仪器分析检测技术教案：高效液相色谱仪的维护
教学活动名称
高效液相色谱仪的维护
教学时间
教学地点
授课顺序
学时数
4学时
指导教师
教学目的
1.使学生掌握高效液相色谱仪的维护
2.使学生能解决日常工作中仪器简单的问题
教学活动安排
1.让学生预习高效液相色谱仪的维护。
2.课堂对学生提问，根据学生回答情况教师讲解和举例。
3.课后布置习题让学生练习。
三．柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：
硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100-200ml;l四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。
3.泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。
4.输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。
高效液相色谱法—高效液相色谱仪(仪器分析课件)
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
高效液相色谱实验
实验1气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定一、目的要求1.了解气相色谱仪的基本结构、工作原理与操作技术；2.学习选择气相色谱分析的最佳条件，了解气相色谱分离样品的基本原理；3.掌握根据保留值，作已知物对照定性的分忻方法。
4.掌握归一化法测定混合物各组分的含量。
二、基本原理气相色谱是对气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质进行检测分析。
由于物质的物性不同，其试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，虽然载气流速相同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定时间的流动后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。
根据出峰位置，确定组分的名称，根据峰面积确定浓度大小。
对—个混合试样成功地分离，是气相色谱法完成定性及定量分析的前提和基础。
而其中气相色谱分离条件的选择至为关键。
主要涉及以下几个方面：1.载气对柱效的影响：载气对柱效的影响主要表现在组分在载气中的扩散系数D m(g)上，它与载气分子量的平方根成反比，即同一组分在分子量较大的载气中有较小的D m(g)。
根据速率方程：（1）涡流扩散项与载气流速无关；（2）当载气流速u小时，分子扩散项对柱效的影响是主要的，因此选用分子量较大的载气，如N2、Ar，可使组分的扩散系数D m(g)较小，从而减小分子扩散的影响，提高柱效；（3）当载气流速u较大时，传质阻力项对柱效的影响起主导作用，因此选用分子量较小的气体，如H2、He作载气可以减小气相传质阻力，提高柱效。
2.载气流速（u）对柱效的影响：从速率方程可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速成正比，所以要使理论塔板高度H最小，柱效最高，必有一最佳流速。
对于选定的色谱柱，在不同载气流速下测定塔板高度，作H-u图。
由图可见，曲线上的最低点，塔板高度最小，柱效最高。
[药学]生物技术本科仪器分析学实验教案
药学生物技术本科仪器分析学实验教案一、实验课程名称：高效液相色谱法测定药物含量1. 实验目的：（1）掌握高效液相色谱（HPLC）的基本操作步骤。
（2）学会使用高效液相色谱仪进行药物含量测定。
（3）理解高效液相色谱法的原理及其在药物分析中的应用。
2. 实验原理：高效液相色谱法（HPLC）是一种利用高压将液体流动相泵入装有固定相的色谱柱，根据药物分子与固定相之间的相互作用力的差异，实现药物的分离和测定。
3. 实验步骤：（1）准备高效液相色谱仪，并检查仪器是否正常工作。
（2）准备对照品溶液和供试品溶液。
（3）设定色谱条件，包括流动相组成、流速、柱温等。
（4）进样并启动仪器，记录色谱图。
（5）计算药物含量。
二、实验课程名称：紫外-可见光谱法测定药物浓度1. 实验目的：（1）掌握紫外-可见光谱法的基本操作步骤。
（2）学会使用紫外-可见分光光度计进行药物浓度测定。
（3）理解紫外-可见光谱法的原理及其在药物分析中的应用。
2. 实验原理：紫外-可见光谱法（UV-Vis Spectroscopy）是利用药物分子对紫外或可见光的吸收特性，通过测定吸光度与药物浓度之间的关系，实现药物浓度的测定。
3. 实验步骤：（1）准备紫外-可见分光光度计，并检查仪器是否正常工作。
（2）准备对照品溶液和供试品溶液。
（3）测定空白溶剂的吸光度。
（4）测定对照品溶液和供试品溶液的吸光度。
（5）根据吸光度与浓度之间的关系，计算药物浓度。
三、实验课程名称：原子吸收光谱法测定金属元素含量1. 实验目的：（1）掌握原子吸收光谱法（AAS）的基本操作步骤。
（2）学会使用原子吸收光谱仪进行金属元素含量测定。
（3）理解原子吸收光谱法的原理及其在药物分析中的应用。
2. 实验原理：原子吸收光谱法（AAS）是利用特定元素的原子在光源的照射下，从基态跃迁到激发态，再回到基态时发出特定波长的光，通过测定该光的强度与元素浓度之间的关系，实现金属元素含量的测定。
3. 实验步骤：（1）准备原子吸收光谱仪，并检查仪器是否正常工作。
仪器分析-高效液相色谱法
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
《仪器分析教程》教学课件—第10章 高效液相色谱法
10.2 高效液相色谱仪
10.2.4 检测系统 4.示差折光检测器
类型：偏转式、反射式和干涉型三种。
2020/9/1
仪器分析教程
10.3 液相色谱速率理论
10.3.1 涡流扩散 10.3.2 分子扩散 10.3.3 固定相传质阻力 10.3.4 流动相传质阻力 10.3.5 提高柱效的方法
根据固定液和流动相的极性不同： （1）正相液—液色谱法
固定液极性大于流动相极性的色谱法。 应用：分离极性较强的化合物，如脂肪酸、甾醇类 、 类脂化合物 磷脂类化合物等有机物。
（2）反相液—液色谱法
固定液极性小于流动相极性的色谱法。 应用：是目前应用的最多最有效的液相色谱法。适合于分离芳烃、 稠环芳烃及烷烃等非极性或弱极性化合物。
③分析对象
HPLC：受样品挥发度和热稳定性的限制，非常适合分子量较大、难气 化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，
大约占有机物的70～80%。
GC：能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非 挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较 为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物 能用气相色谱分析；
H mp
Cmd p2 Dm
u
②在流动相滞留区内的传质阻力项Hsm
H sm
Csmd p2 Dm
u
2020/9/1
10.3 液相色谱速率理论
5. 提高柱效的方法
1.采用粒度小而均匀、孔穴较浅的固定相担体，这是提高 液相色谱柱效最有效的途径； 2.采用低粘度溶剂作流动相，以减小在柱内的流动阻力； 3.适当降低流动相流速； 4.适当提高柱温，以降低流动相粘度，增大扩散系数。 5.尽量减小连接管、检测器流通池死体积。
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2）定量分析实验记录
丙酮浓度（ul/mL）
峰面积（uV*s）
标样1
50
1875145
标样2
75
2876718
标样3
100
3750275
标样4
125
4607851
丙酮标样标准曲线
课后小结：
本次仪器分析实验高效液相色谱混合物的定量和定性测定，学生通过仪器分析实验，基本了解高效液相色谱的性能及操作，掌握高效液相色谱分析的基本原理，学习高效液相色谱混合物的定量和定性分析，为以后从事仪器设备开发和设计工作，打下良好的基础。
3设置色谱工作站参数。
Agilent HPLC仪
色谱柱：
流动相：甲醇：水=8：2
流速：1.0 mL/min
检测波长：254nm
进样体积：10μL
4进样、采集色谱图。
1）三组分混标液
2）标准溶液系列
3）未知样品
5色谱数据分析，打印色谱图及分析报告。
6更换甲醇流动相，清洗色谱柱。
7关闭仪器。
（五）提问
1、高效液相色谱溶液配制需要注意哪些操作？
仪器分析实验课程教案
实验名称：高效液相色谱混合物的定量和定性测定
实验类型
验证性
教学时数
7
每组人数
8
一、实验目的及要求：
1．掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法；
2．了解高效液相色谱的构造、原理；
3．学习高效液相色谱仪的操作。
教学重点：
1、溶液配制的条件
2、色谱工作站参数的设定。
3、定量定性分析方法
三组分混标液：每mL溶液分别含5 uL苯、甲苯和丙酮。
分别准确移取0、2.50、5.00、10.00和20.00 uL甲苯容易溶于1.00mL甲醇中。
2流动相的配制、过滤和除气。
标准苯测试液。
未知样品1号、2号、3号和4号。
B、上机测定
1更换流动相。
2按操作规定开动仪器，排气后让色谱柱平衡（流动性为80%甲醇，速度1.0 mL/min）。
答：药品需要色谱纯的；配制好的溶液需要抽气处理——这步操作有些高效液相色谱能自动完成。
2、利用高效液相色谱进行定量和定性分析的依据有哪些？
答：定性分析根据相同色谱系统下同一物质的保留时间相同；定量分析的依据是在一定浓度范围内，浓度与峰面积(或峰高)成正比。
（六）数据记录与结果处理
确定样品内的物质，确定样品中甲苯的浓度。
教学难点：
(1)、学习高效液相色谱的使用方法、了解该效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、主要仪器和试剂
主要仪器：安捷伦1260液相色谱仪，配有紫外检测器，Phenomenex ODS柱]；1自动进样器。
试剂：色谱纯甲苯、苯、丙酮、甲醇、超纯水；
未知样品1、2、3、4。
教学内容及过程
（一）检查实验预习报告
（二）上次实验存在的问题
（三）高效液相色谱操作
（四）实验内容及步骤
A、溶液配制
1配制标准系列溶液