雌性生殖细胞减数分裂的分子基础

项目名称：雌性生殖细胞减数分裂的分子基础首席科学家：孙青原中国科学院动物研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部门：国家人口和计划生育委员会一、关键科学问题及研究内容(一)拟解决的关键科学问题自然流产、不孕不育、出生缺陷和辅助生殖成功率低的根本原因之一是卵子质量下降，而减数分裂异常是造成卵子质量下降的主要原因，但减数分裂异常的原因迄今还远未阐明。

本项目拟解决的关键科学问题是：减数分裂过程如何受到精确调节进而决定雌性生殖细胞的质量？主要分解为如下三个具体问题加以解决：1）雌性生殖细胞减数分裂是如何起始的？ 2）卵母细胞减数分裂阻滞与恢复如何受到调节的？3）遗传物质如何在卵母细胞减数分裂过程中维持稳定？（二）主要研究内容针对上述科学问题，我们将主要开展以下四个方面的研究：1、卵原细胞减数分裂启动及卵母细胞生长起始调节机制1）卵原细胞减数分裂启动的关键调控元件及调节途径；2）表观遗传修饰在减数分裂启动过程中的作用；3）卵泡形成及卵母细胞生长起始的分子机制。

2、卵母细胞减数分裂DNA断裂、修复与重组的分子基础1）DNA断裂、修复与重组的分子基础及在卵母细胞命运、卵泡形成和染色体数目稳定等方面的作用；2）卵母细胞减数分裂DNA修复途径选择、重组位点定位和重组频率的分子基础和机制；3）DNA断裂修复信号通路和细胞凋亡信号通路在卵母细胞发育过程中交互对话和转换的分子机制。

3、卵母细胞减数分裂阻滞与恢复调控机制1）卵母细胞减数分裂阻滞与恢复调控新机制的发掘；2）卵母细胞减数分裂阻滞与恢复基因调控网络；3）颗粒细胞与卵母细胞的交叉对话在减数分裂阻滞与恢复中的作用。

4、卵母细胞减数分裂染色体精确分离调节1）卵母细胞减数分裂过程中染色体正确分离的纺锤体检验点调节；2）染色体交叉和粘合与染色体正确分离间的关系；3）卵子老化非整倍性增加与纺锤体检验点及染色体粘合之间的关系。

二、预期目标(一)本项目的总体目标本项目以阐明雌性生殖细胞减数分裂的调控机理为目标，通过对控制雌性生殖细胞减数分裂起始、卵母细胞生长起始、DNA断裂和重组修复、减数分裂阻滞和恢复以及两次细胞分裂过程中染色体精确分离关键基因/蛋白的研究，探讨卵母细胞减数分裂正确有序发生的分子基础，为卵子发生异常相关疾病的诊治以及辅助生殖技术的完善提供理论基础。

通过该项目的开展，进一步完善我国在卵子发生尤其是减数分裂调控研究的现代化系统研究平台，培育和造就一批在国际上具有影响力、在国内具有引领作用的优秀中青年研究人才，发展成为该领域国际领先行列的研究团队，并为我国在该领域的持续发展奠定基础。

（二）五年预期目标1) 利用原始生殖细胞、颗粒细胞和卵母细胞特异基因敲除技术，发现3-5个在减数分裂启动、原始卵泡形成和卵泡募集过程中发挥关键作用的基因/蛋白，并阐明其调节机制；2) 阐明决定卵母细胞DNA同源重组修复位点和频率的分子机制及在卵母细胞命运和染色体数目稳定等方面的作用；3）通过离体和在体研究手段解析卵母细胞减数分裂阻滞和恢复分子机制；4）阐明控制卵母细胞（包括人卵母细胞）减数分裂染色体分离机制及影响因素，为提高卵子质量，防止或降低非整倍性卵子产生提供理论基础；5）争取在国际一流杂志上发表6-8篇论文，在生命科学领域有重要影响的刊物或生殖生物学领域一流刊物发表论文50-80篇，申请专利4-6项；造就一支高水平的、具有重要国际影响力的卵母细胞减数分裂科研队伍，培养博士研究生约50-60名，博士后研究人员15名左右。

三、研究方案（一）学术思路生殖健康是人类健康的重要内容。

雌性生殖细胞减数分裂异常和卵子质量下降是导致不孕不育及出生缺陷等诸多生殖相关疾病最主要的内在因素，因而减数分裂的精确调控是保证卵子正常发生和维持女性生殖健康的关键环节。

因此，本项目针对“减数分裂过程如何受到精确调节进而决定雌性生殖细胞的质量”这一关键科学问题，以减数分裂进程为主线，从卵母细胞减数分裂的起始、阻滞与恢复以及遗传物质稳定性维持机制等方面，研究雌性生殖细胞减数分裂调控的分子基础，以期阐明确保卵子发生过程中减数分裂各核心事件依序精确发生的重大基础科学问题，为减少由于减数分裂异常而引发的不孕不育、自发流产和出生缺陷提供新的靶点，并为辅助生殖技术的完善提供技术保障（图1）。

图1，学术思路示意图（二）技术途径本项目以小鼠和果蝇为主要材料，利用遗传学、生物化学、细胞生物学、基因组学和蛋白质组学等多学科交叉研究手段，围绕着卵母细胞减数分裂过程中的几个重要事件：减数分裂起始、卵泡募集、减数分裂重组修复、减数分裂阻滞与恢复、纺锤体检验点和染色体精确分离等，在已有的前期工作基础上，发挥各自的技术特点和优势，各课题间既有侧重点又有交叉，从离体和在体两个层面系统深入地研究雌性生殖细胞减数分裂调控的分子机制以及生物世代间在遗传、进化和多样性方面的分子基础，为人类生殖和发育相关疾病诊治提供分子靶标及理论支持。

主要研究路线见图2。

图2，项目总体技术路线图（三）创新点与特色1、科学问题的前沿性：本项目以我国人类生殖健康的重大需求为导向，瞄准国际科学前沿，凝练研究目标，集中开展卵母细胞减数分裂关键调控分子研究，发掘鉴定一系列在卵母细胞减数分裂起始、卵泡募集、重组修复、阻滞恢复和染色体精确分离相关的基因/蛋白，这不仅对于我们加深对减数分裂调控这一基本生物学现象的认识具有重要意义，还可能为改善人类的生殖健康开辟新的途径。

2、研究方法的先进性：本课题组既有成熟的分子及细胞水平研究平台，也有独特的卵母细胞研究平台，是国际上少数几个具有卵母细胞/卵巢过表达技术、RNAi技术、突变mRNA、Morpholino和抗体注射技术以及各种表型分析技术的实验室之一。

此外，研究团队拥有完善的蛋白组和转录组分子技术，还建立了高度特异性的卵母细胞和颗粒细胞基因敲除小鼠模型，使我们不仅在细胞及分子水平对卵母细胞减数分裂调控进行研究，而且还可以利用动物模型明确它们在生理状态下的功能，从而可以为人类生殖和发育相关疾病诊断治疗提供分子靶标以及理论支持。

3、研究体系的独特性：本项目具备独特的小鼠卵母细胞体外发生体系、卵巢体外培养及RNA干扰体系和卵泡体外重组体系，可采用卵母细胞特异性基因剔除技术（ZP3-Cre、GDF9-Cre），结合活细胞观察等技术研究卵母细胞减数分裂的调控机制。

本项目组还具备原始生殖细胞特异性基因剔除小鼠模型（TNAP-Cre、Vasa-Cre）和高度特异性的卵泡颗粒细胞基因敲除小鼠模型（Cyp19-Cre、Amhr2-Cre）。

目前已经有转基因小鼠、基因剔除小鼠、Flox小鼠以及果蝇在体基因敲除等30多种模型。

利用这些实验动物模型，将对阐述常规实验无法进行研究的新机制具有重要作用。

此外，还将探讨人卵母细胞减数分裂中染色体分离是否受到检验点调节，因而可以直接分析人卵母细胞随年龄增加染色体分离异常升高的原因。

（四）可行性分析1、研究队伍方面本项目所汇集的研究队伍包含了国内从事卵母细胞减数分裂研究的最具活力的科学家，包括长期从事哺乳动物卵母细胞减数分裂研究的国家杰出青年基金获得者（孙青原），2009年从美国NIH全职回国工作的中科院“百人计划”入选者（李卫、李磊），2010年从美国贝勒医学院和Anderson癌症中心全职回国工作的浙江大学特聘教授（范衡宇、黄俊），2010年刚以第一作者发表Science、Cell论文的年轻教授（张美佳、夏来新），长期在国内从事卵母细胞分化和成熟研究的教授（谭景和、沈伟），以及减数分裂研究领域和人类辅助生殖领域国际知名的兼职科学家（HOWARD COOKE、杨树标）。

该团队成员包括具有丰富积累、长期从事卵母细胞和减数分裂研究的科学家，更多的是最近几年本领域崭露头角的优秀青年科学家。

2、研究基础方面主持人孙青原研究员、参加人HOWARD COOKE与谭景和教授在哺乳动物生殖细胞减数分裂领域已有几十年的研究经历，在国内、外生殖生物学领域具有重要影响。

杨树标教授长期从事人类辅助生殖研究，具备人类卵母细胞研究很好的基础和平台。

范衡宇教授和张美佳教授分别在2009年和2010年以第一作者在Science杂志发表有关卵母细胞减数分裂恢复、卵母细胞成熟和排卵调节机制的论文；夏来新博士2010年以第一作者在Cell杂志发表有关生殖细胞命运决定的论文。

李磊研究员最近以第一和通讯作者在Developmental Cell、Development 等领域知名期刊发表有关卵母细胞母源因子调控早期胚胎发育的论文。

沈伟教授是国际上为数不多可以把有丝分裂卵原细胞体外培养为减数分裂卵母细胞的科学家之一。

减数分裂过程中发生非姐妹染色单体之间的交换，卵母细胞在长达几十年（人类）的减数分裂停滞中DNA损伤修复的机会很多，黄俊教授近年来在DNA重组、损伤和修复领域发表了一系列第一作者论文，回国后已经以通讯作者在Science杂志发表论文，他在DNA重组、损伤和修复领域的专长，与卵母细胞减数分裂研究可形成交叉优势。

李卫研究员在蛋白泛素化及降解方面以第一作者在Nature、PNAS、Plos Genetics等杂志发表论文，而卵母细胞减数分裂各关键环节的调节都与蛋白泛素化及蛋白降解有关，可以发挥交叉优势。

3、研究平台方面项目组包括计划生育生殖生物学国家重点实验室、合肥微尺度物质科学国家实验室、农业生物技术国家重点实验室、浙江大学生命科学研究院、青岛农业大学生殖细胞生物学重点实验室、山东省动物生殖与育种重点实验室等。

实验室装备先进，具备课题实施需要的所有大型仪器，建立了保证实验开展所需要的下述技术平台。

1）活细胞工作站，可用于长时间地追踪观察细胞分裂、增殖和染色体分离过程以及卵母细胞与颗粒细胞间的相互作用；2) 小鼠卵原细胞向卵母细胞转化的体外体系及卵泡体外重组体系；3）体外培养卵巢的RNA干扰体系；4）减数分裂进程、DNA断裂修复、联会复合体形成和同源重组的检测平台；5）离体卵母细胞减数分裂研究平台，可以通过过表达、RNAi、Morpholino和抗体注射等技术研究特定基因或蛋白在卵母细胞减数分裂过程中的作用；6）基于Cre/loxp系统的小鼠特异条件性基因敲除平台，可用于小鼠原始生殖细胞、卵母细胞和颗粒细胞中相关基因的特异性敲除。

总之，该团队是结构合理的、以青年科学家为主体的、充满活力的优秀科研团队，掌握并拥有实验涉及的所有先进技术和技术平台，能确保研究方案的顺利实施，并有能力做出国际前沿水平的工作。

（五）、课题设置围绕我们要解决的关键科学问题和达到的研究目标，本项目设置了4个课题：1. 卵原细胞减数分裂启动及卵母细胞生长起始调节机制；2. 卵母细胞减数分裂DNA断裂、修复与重组的分子基础；3. 卵母细胞减数分裂阻滞与恢复的控制机制；4. 卵母细胞减数分裂染色体精确分离的调节机制。