植物组织培养脱毒技术
组织培养第九章植物脱毒技术
•显微镜下 获取茎尖
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•接种
•盖好瓶塞
组织培养第九章植物脱毒技术
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•脱毒马铃薯试管苗
组织培养第九章植物脱毒技术
3．培养
25+2℃ ，1500-5000LX，10-16h 一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新 鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从 生芽。 4．生根诱导 诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生 根培养基继续培养1-2个月可生根。
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组织培养第九章植物脱毒技术
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组织培养第九章植物脱毒技术
四、分子生物学鉴定 1、双链RNA法
通过提取纯纯化待测植物RNA，并对其进行电 泳分析，可确定dsRNA存在，从而判断待检植物是 否带病毒。 2、互补DNA（c DNA）检测法
也叫DNA分子杂交法
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叶片上产生黄斑、沿叶脉条斑
叶和茎干锈斑、坏死斑 叶片出现褪绿斑点、线纹斑及环斑、 局部坏死、畸形；叶脉间出现星状 透明斑
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组织培养第九章植物脱毒技术
葡萄卷叶病毒 葡萄茎沟病毒 葡萄栓皮病毒 葡萄金黄病毒
欧亚种葡萄 Kober 5BB LN33 Baco 22A
葡萄脉坏死病 110R
葡萄脉斑驳病 河岸葡萄
苹果 柑橘 葡萄 草莓
桃 梨
感染病 毒种类
36 23 26 24 23 11
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组织培养第九章植物脱毒技术
• 所谓脱毒就是采用一定的方法除去植 物体内病毒的技术。 • 无病毒苗：指不含该种植物的主要危 害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的 存在表现阴性反应的苗木。
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植物组织培养中的快繁与脱毒技术及其应用
植物组织培养是一种重要的生物技术，它能够实现植物的快速繁殖、脱毒和基因转化。
在植物学研究和植物育种领域，植物组织培养技术的应用非常广泛。
本文将深入探讨植物组织培养中的快繁与脱毒技术及其应用，以帮助读者更深入地理解这一重要领域。
1. 快繁技术在植物组织培养中，快繁技术是指利用植物体的一小部分组织或细胞，通过体外条件培养，实现植物的快速繁殖。
这种技术可以大大提高繁殖速度，缩短繁殖周期，是进行新种质创制、遗传改良和疫病防治的重要手段。
快繁技术的主要方法包括离体培养、愈伤组织培养和微繁殖等。
1.1 离体培养离体培养是将植物体表层（如幼叶、幼茎）或内部组织（如胚乳、子叶）分离出来，移入含有适当营养盐和植物生长调节物的培养基中培养。
通过控制培养条件和添加合适的植物生长激素，可以诱导组织分化和再生形成新植株。
1.2 愈伤组织培养愈伤组织是植物在受到外界刺激或损伤后，经过细胞分裂和组织再生形成的一种未分化的组织。
愈伤组织培养是利用这种特殊组织进行快速繁殖的一种方法，通过控制培养条件和添加植物生长调节物，可以诱导愈伤组织再生形成新植株。
1.3 微繁殖微繁殖是利用植物的微小芽或胚珠进行快速繁殖的方法。
通过培养条件的控制和植物激素的添加，可以诱导微小芽或胚珠快速生长并形成新植株。
2. 脱毒技术在植物组织培养中，由于植物体内可能携带病毒、细菌等病原体，因此会影响到组织培养的效果。
脱毒技术是为了解决这一问题而出现的一种重要技术。
脱毒技术能够有效地清除植物体内的病原体，提高组织培养的成功率和繁殖效率。
2.1 生物脱毒生物脱毒是利用生物制剂对植物体内的病原体进行清除的方法。
通过培养环境中添加含有特定菌株或真菌的生物剂，可以促进植物体内病原体的清除和组织的健康再生。
2.2 生理脱毒生理脱毒是利用植物自身的生理代谢特性进行脱毒的方法。
通过调节培养条件和添加特定的营养物质，可以激活植物的生理代谢活性，加速病原体的清除和组织的再生。
植物组织培养项目六 植物脱毒技术
2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制
了病毒的复制；
3）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生 组织中比其他任何区域具有更高的活性。 4）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的 增殖 。
二、植物脱毒的方法
1. 茎尖培养脱毒
通过茎尖培养脱毒的原理 1）病毒在植物体内的分布：茎尖、根尖顶端分生组织病毒 浓度低，甚至不带病毒。（茎尖、根尖无维管束系统，病毒 无法运动）
获得的再生植株无病毒。
珠心胚培养对柑橘鳞皮病、速衰病、裂皮病、
脉突病等十分有效。
柑橘珠心胚培养：取花后约7 周的幼果胚囊， 接种在25±2 ℃黑暗条件下培养 1个月，再转光 培养（1000 lx，12 h/d）。
3-4 周发生球形胚和愈伤组织，9-10 周分化子
叶，苗高 3 cm左右移植到营养钵蛭石基质中培
全世界植物病毒近788种，病毒对寄主植物造成
毁灭性危害，导致大幅度减产。
2. 植物病毒病的症状
1）变色
2）坏死 3）畸形 4）萎蔫
3. 植物病毒的侵染特性
1）有性生殖退化、仅用无性繁殖方法繁殖的植物，
极易受病毒病的侵染。
2）大多植物病毒不经种子传播（专化性强的病毒除 外）。 3）病毒在生长旺盛的部位繁殖速度较慢。
4）生根诱导：
将 2-3 cm 的无根苗转入生根培养基（ 1/2MS+IBA 0.10.2 mg/L）继续培养1-2 个月就可形成根。 极难生根的（桃、苹果等）通过微体嫁接法获得完整 植株。 二次茎尖培养，脱毒率达100%
培养基与培养方式
1）MS培养基适于多种植物茎尖培养，White、Morel培
葵、紫罗兰等；块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物
培养脱毒苗用什么技术,为什么取茎尖
培养脱毒苗用什么技术，为什么取茎尖回答一般会用组织培养技术来培养脱毒苗，组织培养技术是在无菌的环境下，将从植物体中分离出的组织接种在有各种营养物质的培养基上进行培养，通过培养后就会有再生的完整植株。
因为植物感染了病毒后会导致农作物品质衰退，所以为了获得高产，就必须要培养出无病毒的苗木。
一、培养脱毒苗用什么技术
1、培养脱毒苗的技术
常用组织培养技术来培养脱毒苗，组织培养技术是从植物体中分离出符合需要的组织、器官或者细胞以及原生质体等，并通过无菌操作，在无菌条件下把植物接种在含有各种营养物质以及植物激素的培养基上进行培养，通过培养后会获得再生的完整植株或者生产具有经济价值的其他产品的技术。
2、脱毒苗的概念
（1）据研究表明，导致农作物品质衰退的原因是因为植物感染了病毒，而为了获得高产，就必须要培养出无病毒苗木，既脱毒苗木。
（2）脱毒苗因为施用植物组培技术培养植物幼嫩芽等部位所获得的小苗，因为新长小苗未受到母本病毒感染，所以叫脱毒苗。
二、脱毒苗为什么取茎尖
1、取茎尖的原因
因为相对于根尖来说，茎尖的更容易大量的持续获得，对植株的损伤也较小，而且茎尖通常也不带病毒，所以常用茎尖培养脱毒苗。
和培养其他器官一样，在进行茎尖培养时，首要需要表面不带病原菌的外植体，而茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，无须表面消毒就能够得到无菌的外植体。
2、脱毒苗的应用
脱毒苗技术运用到了花卉、果树、魔芋等农业生产中，从而生产出优质无毒的花卉球种、无病毒果树苗木等植物。
植物脱毒组培的方法和原理
植物脱毒组培的方法和原理
植物脱毒组培是一种通过细胞或组织培养技术去除植物组织中的病毒或其他病原体的方法。
其方法包括以下几个步骤：
1. 选择合适的母本植株：选择健康没有病毒污染的植物作为母本植株。
2. 提取母本组织：从母本植株中提取出组织，如叶片、茎段、种子等。
3. 建立细胞或组织培养：将提取的组织转移到营养培养基上，提供适宜的营养物质和激素，促使组织细胞分裂和生长。
4. 建立病毒感染模型：将营养培养基中加入病毒悬浮液或病毒感染的植物部分，使细胞或组织感染上病毒。
5. 选择抗病株系：在病毒感染的条件下，筛选出能够抵抗病毒感染的细胞或组织，这些细胞或组织可以表现出无病毒或低病毒含量的状态。
6. 培养和繁殖抗病株系：将筛选出的抗病细胞或组织进行继代培养，使其继续增殖和繁殖。
植物脱毒组培的原理主要基于以下几个方面：
1. 细胞或组织培养条件的控制：适宜的培养基成分和激素浓度能够促进细胞分裂和生长，同时也能够改变细胞的物质代谢和
抵抗能力，有利于抗病性的培养。
2. 细胞再分化的能力：在培养条件下，植物组织细胞有再分化为器官样组织的能力，可以通过再分化获得无病毒细胞或组织。
3. 病毒感染的选择性：某些植物病毒在体内能够引起明显的病症，但在体外无法复制，通过在体外培养条件下去除病毒复制的环境，可以选择出无病毒的细胞或组织。
4. 细胞或组织的抗病机制：植物组织细胞通过产生抗病蛋白、抗氧化物质等手段，形成对病毒感染的抵抗能力，通过培养和筛选可以选择出具有这种抗病机制的细胞或组织。
植物脱毒组培方法的应用可以用于繁殖无病毒植株、培育新品种、保存稀有植物等。
植物组织培养脱毒技术
香石竹脱毒的具体操作过和如下：
（1）热处理 将盆栽植株或离体瓶苗，在 36～38℃下处理2周，或每天在36℃16小时和 38℃8小时处理共30天，光照为3000lx。
（2）表面消毒 选取盆栽香石竹植株叶腋间生 出的侧芽为外植体，先用自来水冲洗半小时， 用75%的酒精消毒30秒，再用2.5%次氯酸钙 或次氯酸钠溶液处理15分钟,取出后用无菌蒸 馏水清洗4次,用无菌滤纸吸去多余水分备用。
第三节 脱毒苗的检测
经过脱毒处理的植株作为无病毒原原种或原种使用之前， 必须针对特定的病毒进行检测，才能保证组培苗的内在质量。 目前常用的植物病害检测方法有可见症状鉴定、寄主鉴定、 抗血清检测、电镜检测、分子检测等。可见症状鉴定法较简 单，但准确性差，对于不表现楞见症状的隐症病毒几乎无效； 而电镜检测、分子检测虽然准确性高，但设备昂贵。目前生 产上，国内外主要采用鉴别寄主和抗血清检测法检测植物病 毒。
第一节 常见植物病毒及其症状
一种病毒可侵染许多植物，而同种植物又可被许多病毒侵染。植 物病毒对农作物的危害可使农业生产受到巨大的损失。 在一年生种子繁殖作物上，可以采取一些预防措施，减轻当年病 害的发生程度，一般不影响下一季的发病。 木本植物一旦发病，以后连年都发病。 营养繁殖的作物如马铃薯，番木瓜，草莓等，连年种植可以积累 多种病毒侵染。马铃薯的退化，就是由多种病毒引起的。
一、植物病毒的发现
很多植物体内都带有植物病毒，由于人类视觉所限，形体 越小的生物就越不易被发现，所以病毒的发现比其它生物要晚 得多。直到19世纪末期，德国的A．Mayer发现烟草上出现深浅 相间的绿色条纹，称之为烟草花叶病，并证实其具有传染性； 后经俄国植物病理学家D．Ivanowski对烟草花叶病病原进行研 究，认为它是由一种极小的“细菌”引起的；最终由荷兰人 M．W．Beijerinck首先提出烟草花叶病病原是一种“传染性的 活性液体”或称“病毒”。此后，许多学者陆续发现了各种植 物病毒。1935年美国人Stanley和Bawden揭示了烟草花叶病毒 的化学本质不是纯蛋白而是核蛋白；1940年德国的Kausche等 首次在电镜下视察到烟草花叶病毒的杆状外形。由此，病毒研 究进入了更深入的领域。目前，人们不但能在实践生产中有效 地防治病毒的侵染，而且能利用病毒作为遗传工程的载体改造 植物。
组织培养脱毒
组织培养脱毒植物组织培养脱毒是目前广泛应用和正在继续发展的主要脱毒方法。
依据的原理是病毒在植物体内分布的不均匀及细胞全能型，如在植物茎尖等分裂旺盛、生长迅速的组织细胞往往检测不到病毒的存在。
采用不含病毒的植物组织或细胞进行组织培养，获得无病毒的植株。
将组织培养脱毒技术与基因工程、品种改良和植物快繁结合起来，利用工厂化育苗，达到快速获得品性优良的无毒种源，具有广阔的开发和应用前景。
3.3.2.1茎尖组织培养脱毒Morel等（1952）从侵染花叶病毒的大丽花的茎尖组织培养获得无病毒的植株，从此茎尖培养成为脱毒的一个有效途径，在马铃薯、兰花、百合、鸢尾、苹果等植物中获得了脱毒成功。
利用茎尖脱毒技术，能够将很多不能通过热处理脱除的病毒脱掉，同时茎尖脱毒获得的植株遗传变异小，能够很好的保持品种的特性。
葡萄脱毒与快繁工艺流程图(摘自曹孜义，2001)3.3.2.2茎尖微芽嫁接脱毒茎尖微芽嫁接脱毒是将组织培养与嫁接相结合，来获得无毒植株的一种新方法，它是将0.1-0.3mm的茎尖作为接穗嫁接到组织培养获得的无毒实生砧木上，再进行试管培养，愈合成为完整的脱毒植株。
该方法可以解决一些果树茎尖组培成苗的困难。
另外，在柑橘等茎尖培养过程中可能发生芽变，出现返祖现象，而茎尖嫁接则不出现这些想象。
3.3.2.3其他组培脱毒方法植株中除茎尖含病毒较少外，花药、胚、胚珠及珠心等组织器官都几乎不含病毒，以这些组织器官为外植体进行组织培养也可以获得无病毒植株。
3.3.2.3.1花药培养法大泽胜次等(1974)首先发现草毒花药培养可脱除病毒，且草莓花药培养与热处理、茎尖组织培养比较，具有脱毒率高，安全可靠等优点。
其后对枸杞、苹果、葡萄、莴苣、玉米等药用植物、果树及蔬菜、农作物进行花药脱毒取得了成功。
3.3.2.3.2珠心胚培养法柑桔的种子具有多胚性，其中有一个胚是受精后产生的有性胚，其余是珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。
珠心胚经培养后可以得到无病毒的珠心胚苗。
植物脱毒方法
植物脱毒方法
1、茎尖培养脱毒:病毒在植物体内的分布并不均匀,越靠近茎端的病毒的感染深度越低,生长点则几乎不含或含病毒很少。
2、愈伤组织培养脱毒法:通过植物的器官和组织的培养,脱分化诱导产生愈伤组织,然后从愈伤组织再分化产生芽,长成小植株,可以得到无病毒苗。
3、珠心胚培养脱毒:病毒一般不通过种子传播,由珠心细胞发育成的胚再生的植株是无毒的,并具有与母本相同的遗传特性。
4、茎尖微体嫁接:将实生苗砧木在人工培养基上种植培育,再从成年无病树枝上切取0.4—1.0mm茎尖,在砧木上进行试管微体嫁接,以获得无病毒幼苗。
5、花药培养脱毒。
6、热处理脱毒:一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下(35-40°C),即钝化失活。
7、化学处理:抑制或杀死病毒。
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二、抗血清鉴定法
1、叶绿体凝聚法 2、块茎沉淀法 3、环形接口法 4、酶联免疫法
第二节 脱毒材料的获取
目前在生产上常用的脱毒材料获取方法主要有：热处理脱 毒、茎尖脱毒、抗病毒药剂脱毒等。此外，也有人通过愈伤组 织、花丝组培等方法获取无毒植株。 一、热处理脱毒 带毒植株经高温处理后，病毒浓度会降低。通常处理方法 是：把适当的材料移入一个热处理室或光照培养箱中，在 35~40℃高温下，根据种类特征和材料情况处理数天到数周不等。 如香石竹在38℃连续处理2个月，消除了茎尖内所有病毒。百合、 郁金香、，风信子等球根花卉，用休眠种球进行热处理，可大 大降低种球生长点内的病毒含量。 热处理有一定的局限性，一方面热处理只能降低植株内病毒的 含量，单独处理难以获得无毒材料；另一方面热处理时间过长， 会造成植株代谢紊乱，加大品种变异的可能性。生产上通常采 用热处理结合茎尖培养的脱毒方式，获得较高
二、植物病毒的类型
植物病毒大部分属于单链RNA病毒，少数为DNA病毒。其基 本形态有杆状、丝状和等轴对称的近球形二十面体。植物病 毒虽是严格的细胞内寄生物，但专一性并不强，往往一种病 毒可寄生在不同种、属甚至不同科的植物上。如烟草花叶病 毒能侵染十多个科，200多种草本和木本植物。 已知的植物病毒种类有600多种，绝大多数种子植物易发生 病毒病。植物被病毒感染后，一般表现出三类症状：①因寄 主细胞的叶绿素或叶绿体被破坏，使植物出现花叶或黄化病 症。②阻碍植株发育，使植株发生矮化、丛枝或畸形等。③ 杀死植物细胞使植株出现枯斑或坏死。
二、茎尖脱毒 研究表明，茎尖和根尖 的分生组织中一般是无 毒或仅含极低浓度的病 毒粒子。 茎尖由顶端分生组织及 其下的1～3个叶原基构 成。一般大小在0.1～1 ㎜之间. 茎尖脱毒主要包括表面 灭菌、茎尖剥离、茎尖 培养等步骤。
香石竹脱毒的具体操作过和如下： 香石竹脱毒的具体操作过和如下： （1）热处理 将盆栽植株或离体瓶苗，在 36～38℃下处理2周，或每天在36℃16小时和 38℃8小时处理共30天，光照为3000lx。 （2）表面消毒 选取盆栽香石竹植株叶腋间生 出的侧芽为外植体，先用自来水冲洗半小时， 用75%的酒精消毒30秒，再用2.5%次氯酸钙 或次氯酸钠溶液处理15分钟,取出后用无菌蒸 馏水清洗4次,用无菌滤纸吸去多余水分备用。
第一节
常见植物病毒及其症状
一种病毒可侵染许多植物，而同种植物又可被许多病毒侵染。植 物病毒对农作物的危害可使农业生产受到巨大的损失。 在一年生种子繁殖作物上，可以采取一些预防措施，减轻当年病 害的发生程度，一般不影响下一季的发病。 木本植物一旦发病，以后连年都发病。 营养繁殖的作物如马铃薯，番木瓜，草莓等，连年种植可以积累 多种病毒侵染。马铃薯的退化，就是由多种病毒引起的。
三、植物病毒对植物的侵染途径
由于植物病毒一般无专门吸附结构，而且植物细胞表面至今也 未发现有病毒特异性受体部位，因而植物病毒的侵染途径主要 是通过伤口。如：①借昆虫刺吸式口器损伤植物而侵入细胞。 ②借带病汁液与植物伤口相接触而侵入。③借人工嫁接时的伤 口而侵入。 植物病毒侵入植物细胞后，病毒按其各自的核酸类型进行复制。 其增殖过程因病毒类型不同其细节也很不相同，但步骤大致相 似。
第三节
脱毒苗的检测
经过脱毒处理的植株作为无病毒原原种或原种使用之前， 必须针对特定的病毒进行检测，才能保证组培苗的内在质量。 目前常用的植物病害检测方法有可见症状鉴定、寄主鉴定、 抗血清检测、电镜检测、分子检测等。可见症状鉴定法较简 单，但准确性差，对于不表现楞见症状的隐症病毒几乎无效； 而电镜检测、分子检测虽然准确性高，但设备昂贵。目前生 产上，国内外主要采用鉴别寄主和抗血清检测法检测植物病 毒。
（3）茎尖剥离 在双筒解剖镜下。切除叶片使芽体暴露，用解 剖针剥掉幼叶，直到只剩下2个最幼小的叶原基。 （4）茎尖培养 用小刀片切下茎尖放入培养基。培养条件为 25℃，光照16小时，光照强度为2000lx，平均两周进行一次 转接，5～7周可获得单个小植株。
三、抗病毒药剂处理脱毒 用于植物脱毒的抗病毒药剂主要包括嘌呤和嘧啶 类似物、氨基酸、抗生素等。近年来，在脱毒生产中， 经常采用且效果较好的抗病毒药剂是病毒唑。通常病 毒唑在培养基内浓度为5㎎/l，处理时间4 周后，生长 锥中已无病毒，合适的茎尖大小是关键，1㎜长的茎 尖，脱毒率为80%。
五、植物病毒的症状
植物病毒引起植株的症状是各异的，在观赏植物上由病毒引起 外部症状主要有以下几种： （1）变色：褪绿、黄化、花叶、斑驳、红叶等，常见病毒有； 香石竹斑驳病毒、黄瓜花叶病毒、芋花叶病毒等。 （2）坏死：常见的坏死是病斑或斑点。有轮斑、环斑、条斑 ‘条纹等。如香石竹坏死斑点病毒、，凤仙花坏死斑点病毒草 等。 （3）畸形：植株可出现矮缩、矮化或叶片皱缩、卷叶、蕨叶 等病状。 （4）萎蔫 ：主要是指植物根或茎的维管束组织受到破坏而发 生供水不足所出现的凋萎现象。
第六章 植物组织培养脱毒技术
全世界已发现植物病毒近700种。大多数农作物，尤 其是无性繁殖的家作物都受到一种或一种以上病毒侵 染，且带毒株率高。病毒对寄主植物可造成灭性危害， 导致大幅度减产，甚至全株死亡。潜隐性病毒侵染植 物造成症状不明显的慢性危害，不易被发现，尤其危 险。受病毒侵染的植物全身终生带毒，目前尚无药物 可治愈。国内外解决这一问题的有效途径是培育无病 毒苗，实施农作物无病毒化栽培。
四、植物病毒病的防治
目前防治植物病毒病的基本策略是：防重于治和综合防治。 一般采取以下措施： 1、选育抗病品种 选育病毒不能侵入或即使侵入也无法复 制的抗病品种和对病毒感染有较强适应性的耐病品种。 2、消灭传毒昆虫 利用化学农药、生物农药或物理诱捕等 方法治虫。 3、用无性繁殖法培育无毒苗 利用植物茎尖生长点并结合 热处理（35～40℃）和组织培养的方法得到无毒苗。此法 在防治马铃薯、葡萄、柑桔及某些观赏植物的病毒病方面 十分有效。 4、接种弱毒株来保护植物 这是一种“给庄稼种牛痘”的 方法。目前在许多国家已可用此法来预防蕃茄花叶病，用 于其他植物病毒的弱毒株也在实验之中。 5、采用合理的栽培措施等
一、植物病毒的发现
很多植物体内都带有植物病毒，由于人类视觉所限，形体 越小的生物就越不易被发现，所以病毒的发现比其它生物要晚 得多。直到19世纪末期，德国的A．Mayer发现烟草上出现深浅 相间的绿色条纹，称之为烟草花叶病，并证实其具有传染性； 后经俄国植物病理学家D．Ivanowski对烟草花叶病病原进行研 究，认为它是由一种极小的“细菌”引起的；最终由荷兰人 M．W．Beijerinck首先提出烟草花叶病病原是一种“传染性的 活性液体”或称“病毒”。此后，许多学者陆续发现了各种植 物病毒。1935年美国人Stanley和Bawden揭示了烟草花叶病毒 的化学本质不是纯蛋白而是核蛋白；1940年德国的Kausche等 首次在电镜下视察到烟草花叶病毒的杆状外形。由此，病毒研 究进入了更深入的领域。目前，人们不但能在实践生产中有效 地防治病毒的侵染，而且能利用病毒作为遗传工程的载体改造 植物。