腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染

腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染

一、包装

1.包装细胞

详情见AD-293 Cells.pdf，AdEasy™ Adenoviral Vector System.pdf（P31-P32）2.细胞转染

方法一、

详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P28-P29）

C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf

3.病毒收集

详情见AdEasy™ Adenoviral Vector System.pdf（P34）

二、扩增

详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P29-P30）

三、纯化

(i) 病毒上清（接一、包装3.病毒收集）.

(ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution.

(iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution.

(iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the

final NaCl concentration will be B0.3 M.

(v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylene

wide-mouthed bottles.

(vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min.

(vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor.

(viii) After centrifugation, a white pellet should be visible.

(ix) Carefully decant the supernatant and add 1.2 ml of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, per

bottle. Resuspend the pellets by

vigorously pipetting liquid up and down.

(x) Vortex the bottles vigorously for 20–30 s to further resuspend the pellets.

(xi) Transfer the vector suspension into screw-cap microfuge tubes in aliquots of 100 ml.

(xii) Snap-freeze the tubes in crushed dry ice and store at -80 。C.

a.按照10ml的病毒上清加入2.5ml的50%PEG6000混合；

b. 加入1.064ml的4M的NaCl混匀；

c. 加入1.142ml的PBS混匀；

d. 4°C下，孵育1.5h，每20-30min颠倒混匀；

e. 4°C下，7000g离心10min。

f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在7000 g 下短暂离心；

g. 加入原病毒上清1/200 to 1/100 体积的PBS重悬沉淀病毒粒子；

h. 立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后（50-100ul/管）冻存于-80°C超低温冰箱中；

上述所需试剂配制方法见Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf（P3）

四、滴度测定

病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc

病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc

五、感染

详情见Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf（P31）

a. 感染前24小时，把细胞传代至35 mm平皿中，加入完全培养基至终体积3ml，培养过夜，感染时，细胞密度为80–90%；

b. 把冻存于-80°C的病毒取出并在室温下冻融；

c. 用新的完全培养基更换培养液，并加入冻融的病毒粒子（MOI为50-100）和polybrene（4 μg/ml），培养液终体积为3ml；

d. 感染8-24h后，用新3-4ml新完全培养基更换感染培养液；

e. 感染48小时后收取细胞进行QPCR检测，感染72小时后收取细胞进行WB 检测；