细胞培养中支原体污染的特点及检验的笔记
支原体污染及其检测
支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。
支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。
最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。
支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。
这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。
支原体污染常用的检查办法如下。
1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。
如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。
要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。
电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。
详见电子显微镜技术一节。
2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。
【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。
【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。
(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。
(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。
(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。
细胞培养中支原体污染
细胞培养中的支原体污染的预防及处理Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。
自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。
一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。
对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。
对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。
支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
支原体清除实验
支原体清除实验支原体污染是细胞培养过程中的常见现象。
细胞被支原体污染之后，在显微镜下无法直接观察到，生长状态可能发生或不发生改变，因此一般不易被察觉。
但是支原体会改变细胞的很多生长参数，因而极易对后续实验造成影响，所以对支原体污染的检测和清除非常重要。
以下为一次支原体检测和清除的实例。
材料：细胞系：SH-SY5Y支原体PCR检测试剂盒：Myco-P-20 (上海炎熙生物 )支原体清除剂：Myco-E-1 (上海炎熙生物 )方法与结果：1，将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。
两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。
2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。
在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。
每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。
3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。
最后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。
4，按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作，结果如下：4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。
在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。
4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。
可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。
在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。
注释：由于PCR是一种非常灵敏的检测方法，所以很容易出现假阳性条带。
浅析细胞体外培养的三大污染
浅析细胞体外培养的三大污染细胞培养技术是离体方法中主要的一种，是从动物体内取出细胞，模拟体内的生理环境，在无菌、适温、丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。
细胞实验是科学探究的基础，然而在细胞培养中，常会因为不适宜的环境条件以及不得当的操作导致细胞被污染。
在细胞培养实验中如何避免污染是一项很重要的工作，现在我们来看一下细胞体外培养中常见的污染种类，以及避免方法。
1、外源性污染外源性污染中应注意实验室内空气保持洁净，定期清扫、紫外消毒，操作者严格按照无菌操作进行。
由于离体细胞对各种毒物都很敏感，所以细胞培养所用器材的清洗、消毒处理非常关键。
培养所用的物品器具要彻底清洗消毒，超净台的物品摆放要井然有序，避免反复烧烤已经高温灭菌的物品以及避免因细胞株种类过多而引起的细胞间交叉污染。
细胞实验室的构建也是各个细胞实验服务公司必备的实验室，实验室需要配备CO2培养箱、超净工作台/生物安全柜、纯水系统以及液氮罐等设备，同时需要保证细胞实验室的干净与整洁。
2、支原体污染支原体是一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状，由于它的直径小（约为0.15-2 µm），而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。
在光学显微镜下支原体不可见，对培养基的需求有限，一般不会引起培养物混浊，因此支原体像慢性毒药一般杀细胞于无形之中。
细胞被支原体污染后，其生长繁殖和形态、代谢及功能、染色体及免疫细胞产量均会受到影响，支原体污染能够消耗营养物，促进代谢积累，导致PH改变，诱导或抑制细胞因子表达，并改变培养细胞的代谢、增殖特征以及形态。
据一些资料报道，支原体污染在细胞体外培养过程中发生率高达15%~80%。
为了避免支原体污染的发生，对培养物进行常规的支原体检测非常重要，应严格按照细胞培养操作程序进行操作、确保适宜的环境条件、严格的无菌观念操作、定期清洁消毒、任何培养用液使用前均进行无菌检查、只引进来源可靠的细胞，同时一旦发现污染的细胞应灭活弃之避免进一步污染扩散。
细胞培养过程中的污染
细胞培育过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括全部混入培育环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
培育细胞受细菌污染后，会消失培育液变混浊，pH转变。
也有的培育液肉眼观看无多少转变，只能在镜下发觉菌体才知污染。
所以，每天应认真观看。
污染后细胞发生病理转变，胞内颗粒增多、增粗，最终变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株（系）丢失。
培育细胞受真菌污染后，可见培育液中漂移着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培育液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交叉在细胞之间或培育基中，有的呈链状排列。
念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。
个体细小，有增多趋势。
镜下看时，要将培育瓶用酒精棉球擦洁净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最终由于养分耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm, 一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
开头不易发觉，能在偏碱条件（pH7.6~8.0）下生存，对育霉素有抗药性，多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中心有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。
培育细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。
但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不准时处理，还会产生交叉污染。
采纳组织细胞培育法生产疫苗，假如没有除去潜在病毒的组织培育物，会产生病毒污染。
目前，从原代猴肾细胞的培育中已发觉不少于20种血清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培育，但生产疫苗是担心全的。
若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞和会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。
因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
五、非同种细胞污染由于细胞培育操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使•种细胞被另•种细胞污染。
细胞培养中的支原体污染
生物特性：
无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，其直径仅有 0.13～0.18μm，是目前发现的最小细胞，并且变形能力大，故能通过滤菌 器。 革兰氏染色不易着色或呈阴性。 胞膜中含有胆固醇或其他甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性，对于物 理因素，如压力、渗透压、脱水的抵抗力很大。 多数支原体适合在偏碱性条件下生存（pH值7.6~8.0），对酸耐受性差。
原体是没有作用的。
支原体污染应对策略
新一代支原体抗生素M-Plasmocin 其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合 成受阻。另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制。 可以强效对抗支原体及相关的无胞前对抗支原体最理想的 方法。
支原体污染来源
工作环境的污染
操作者本身的污染（包括操作者操作不当以及某些支原 体在人体是正常菌群） 实验器材的污染 培养基等试剂的污染
被污染细胞造成的交叉污染
制备细胞的原始组织或器官的污染
支原体污染的类型
口腔支原体(M.orale) 精氨酸支原体(M.arginini) 猪鼻支原体(M. hyorhinis) 发酵支原体(M.fermentans)
梨支原体(M. pirum)
莱氏无胆甾原体(idlawi）
支原体污染有时易被忽视！
1.培养液可不发生混浊
2.细胞病理变化轻微或不显著
3.细微变化也可由于传代，换液而缓解。 4.个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从 培养器皿脱落
但支原体污染对细胞的影响却是极大的！！！
1、影响细胞的生长状态及形态 支原体可使培液中支持细胞生长的营养物质含量减少，造成细胞生长缓慢甚至 停止；另外还会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变，表现为细胞收缩、 贴壁细胞脱落、裂解等。
细胞支原体污染相关知识简介
细胞支原体污染相关知识简介（2016年10月16日）（1）支原体简介：支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.1 - 0.6微米。
目前，已发现的支原体品种有100多种。
其中，有近20种曾经在各种细胞培养体系中检测到，但超过98%以上的支原体污染是由6-8种引起的（注：具体的支原体种类，上海易色的《一步法恒温支原体检测试剂盒》说明书中有详细介绍）。
而且同一种细胞经常被多种支原体污染。
（2）支原体污染细胞的途径：由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的0.20微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过0.10微米孔径的除菌滤膜,造成细胞的支原体污染。
细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。
（3）细胞培养用的组分，如血清、培养液等。
（3）细胞支原体污染的隐蔽性：由于支原体体积比细菌小很多，通常支原体污染密度非常的高，可达107-9/mL培养液，但即使这么高密度的支原体污染也无法通过普通显微镜的肉眼观察进行判断。
而且，轻度到中度的支原体污染并不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，也不会明显改变培养液的浑浊度或培养液的pH值。
以上两个原因就导致体外培养的细胞即使被支原体污染了，一般的科研工作者也不会觉察到。
也就是说：如果不进行支原体的常规检测，你甚至不知道你培表1，细胞支原体污染统计结果，数据来自参考文献 [4]3. Edward Burnett and Liz Penn, European Collection of Cell Culture(ECACC®). Mycoplasma Detection and Elimination. Don Finley, Market Segment Manager, Sigma® Life Science. Biofiles, Vol. 8, No. 184. John Ryan (2008). "Understanding and Managing Cell CultureContamination". Corning Incorporated. p. 24.。
细胞培养中支原体污染的检测方法
细胞培养中支原体污染的检测方法由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。
实验室新引进的细胞，应该比较采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用。
为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性，中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。
美国食品药品监督管理局(FDA)强烈建议，应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况。
欧洲药典European Pharmacopoeia(EP,7 the dition,Section2.6.7.)规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。
提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。
所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要。
2017年先达基因（）研发了一种细胞污染支原体检测试剂盒，每次检测只需半个小时，减少了很多工作量，其原理是基于其自主研发的恒温核酸检测技术（ERA），结合恒温荧光定量检测仪，可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA 片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体，实现了快速、简单、灵敏的进行细胞支原体常规检测。
1956年，Robinson等首次发现细胞培养物中的支原体污染以来，对其形态、繁殖、分类、体外培养、细胞膜结构和膜蛋白分析、代谢途径等方面都进行了深入研究。
1995年10月，来自马里兰盖瑟斯堡的基因组研究协会(TIGR)与位于ChapelHill的北卡罗来纳州立大学的团队合作，共同完成生殖支原体全基因组580kb测序，这也是人类首次完成支原体全基因组测序的，随后RichardHerrma实验室完成了肺炎支原体全基因组800kb的测序，使得支原体的检测进入分子检测领域成为可能。
到目前为止，出现了很多支原体的检测方法，有传统检测方法（包括直接培养法和DNA荧光染色法）、ATP酶法、免疫法（ELISA法等）以及分子诊断方法（包括普通PCR和荧光PCR、LAMP，重组酶扩增技术等），这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。
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细胞培养中支原体污染的特点及检验的笔记
支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物。
约有1%可通过滤菌器。
支原体无细胞壁形态呈高度多形性。
可为圆形、丝状或梨形。
支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。
电镜下观察支原体膜为三层结构。
其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。
支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。
横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群
或中央束。
支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。
多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6-8．0)，对酸耐受性差。
对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。
支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊。
多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。
但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。
为确定有无支原体污染可做如下检测：
①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。
②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA 着色，染色后用荧光显微镜观察。
具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l：3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗，置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。
染色后用蒸溜水洗1-2min，向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。
镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。
③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。
④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高，但方法较为复杂。
支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。
它不同于细胞，也不同于病毒。
支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。
支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。
国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.oral e）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。
组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。
支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如β-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。
对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。
InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。