基因的转移与重组体的筛选和鉴定_百替生物

第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定

第一节转化

基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。

一、重组DNA分子转入原核生物细胞

1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌

转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。

转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。

（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染

A、制备感受态细胞

受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。

所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。

转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；

转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；

好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。

B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：

①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；

②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。

③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；

④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；

⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。

⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。

（2）电穿孔转化法

基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。

受体细胞的准备：当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上。

（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌

原理：是基于非接合型质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方式。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。

尤其适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法等进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。

（4）转化率的计算及其影响因素

转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率

有两种表示方式：

A：以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示

B：以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。

以用于转化处理的受体细胞数为基数来计算转化率

A：通过菌液OD值测定或细菌计数，计算出用于制备感受态细胞的受体菌总数。

B：计算转化子与受体菌的比率。

用于制备感受体细胞的菌液每毫升有5×107个菌体，则4ml菌液有2×108个菌体，由此菌液制备成感受态细胞，通过转化处理，获得1000个转化子，则转化率是103／（2×108）＝5×10-6。其含义是每个受体菌细胞被转化的概率是5×10-6，或者说，要得到一个转化子，需要2×105个受体菌细胞。

每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示

单位通常是转化子数每μg DNA分子，如每μg重组DNA分子获得106个转化子，则转化率为106个/μg DNA分子。

影响转化率的因素：

分子量

载体类型及构型

重组DNA分子的浓度与纯度

受体细胞

2.重组λ噬菌体DNA子转导大肠杆菌

转导（transduction）是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。λDNA与外壳蛋白结合成噬菌体颗粒，才有转导宿主大肠杆菌的能力。因此重组的λDNA必须进行体外包装。所谓体外包装，是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包裴为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。

在实验方法上，体外包装包括两个方面：（1）包装抽提物的制备；（2）体外包装过程。

二、重组DNA分子转入真核细胞

1.根癌农杆菌Ti质粒介导法

农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。迄今为止约8096的转基因植株都是利用农杆菌介导转化系统获得的。

农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物无侵染能力。植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，如乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OH－As），它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。具有趋化性的农杆菌移向这些细胞，并将其Ti质粒上的T－DNA的转移至细胞内部。根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进人植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。

步骤：（1）外植体选择与预培养；（2）接种活化的农杆菌工程菌；（3）共培养；（4）选择培养；（5）转化植株再生

2.高压电穿孔法

利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。利用这种方法，可以将DNA导入动、植物及细菌细胞。具有简单方便、对细胞毒性低以及转化效率高等优点。

（1）标准的操作程序——将高浓度的含有克隆基因的质粒DNA加到原生质体的悬浮液中，然后置于200～600V／cm的电场下进行电脉冲刺激。经过如此电穿孔处理的原生质体在组织培养基中培养1～2星期之后，选择已经捕获了转化DNA的细胞，作进一步的继续培养，以便获得再生植株。

应用这种方法已成功地转化了玉米和水稻的原生质体，其转化效率在0．1％～1．0％之间。

（2）影响电穿孔导入DNA效率的因素：

①外加电场的强度：250～750V／cm较宜；

②电脉冲的时间：20～100ms；

③工作温度：对不同类型细胞所要求的条件不同，可以在0℃至室温（25℃）之间进行选择；

④DNA的构象和浓度：线性DNA比环状DNA要好，浓度控制在1～40μg／mL。

⑤工作缓冲液的离子成分：也对其DNA导入效率发生作用，一般用盐溶液悬浮细胞要比用非离子溶液

更易DNA的导入。

3.聚乙二醇介导的原生质体转化法

这种方法常用于转化酵母细胞以及其他真菌细胞。

活跃生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形体后，在适当浓度的聚乙二醇6000（PEG－6000）的介导下，将外源DNA转化入受体细胞中。

4.磷酸钙或DEAE一葡聚糖介导的转染

这是将外源基因导入哺乳类细胞中进行瞬时表达的常规方法。

将被转染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后通过内吞作用进入受体细胞。对于DEAE-葡聚糖作用的机理尚不清楚，可能是其与DNA结合从而抑制核酸酶的作用或与细胞结合从而促进DNA的内吞作用。

5.原生质体融合

通过带有多拷贝重组质粒的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。经过细胞膜融合，细菌内容物转入动物细胞质中，质粒DNA被转移到细胞核中。

6.脂质体法

将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜融合将基因导入。

脂质体是由磷脂组成的膜状结构，用它包装外源DNA分子，然后与植物原生质体共保温。于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，尔后通过细胞的内吞作用而将外源DNA高效地纳入植物的原生质体。

这种方法具有多方面的优点，包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复性高，包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。用此法转化水稻原生质体的效率可达14％，并得到了转基因的再生植株。

7.显微注射法

借助显微镜将外源DNA直接注射到受体细胞的方法。适用于此种方法的植物样品包括原生质体、游离的细胞，以及诸如愈伤组织、分生组织和胚胎组织等多细胞结构。

在显微注射的实际操作中，受体细胞或组织是被固定在褐藻酸钠或琼脂糖等特定载体上，然后通过显微操作器，将转化的外源DNA直接注射到受体细胞核中去。由于一些重要的禾本科粮食作物均为单子叶的，在原生质体再生和Ti质粒的转化方面都存在着相当的困难，所以对此类植物来说，DNA的直接注射法具有特别重要的实用价值。

本法的一个突出优点是转化频率高，可达60％以上，但操作困难，需要经过特殊训练的专门技术人员才能迸行。

8.颗粒轰击（particle bombardment）技术

颗粒轰击技术是将基因转移到细胞或组织中去的通用方法，也就是平常所说的用基因枪实现基因转移的方法。

将DNA包被在金或钨的微粒中，然后用基因枪将DNA包被的颗粒直接转移到原位组织、细胞乃至细胞器中去。这一技术目前广泛用于植物基因工程、基因治疗以及基因（DNA）免疫等研究。

生物弹击法的操作对象可以是完整的细胞或组织，突破了基因转移的物种界限，也不必制备原生质体，实验步骤比较简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和培养转基因

植物的最有效的手段之一。

第二节基因重组

将目的基因插入载体的过程，即基因重组（gene recombination)，其基本过程包括：首先在目的目的基因和载体两端造成切口，然后依赖于双链DNA粘性末端单链序列的互补结合和DNA连接酶将切口补上。这一步的实质就是将两种DNA在体外进行酶促连接，最终获得一个重组子。一般连接反应中外源DNA与载体的比例采用3：1，4：1或5：1。

不同来源、性质的外源片段采用的连接方式不同。常采用的连接方法有：粘末端连接、平端连接法、人工接头法和同聚物接尾法。

一、粘末端连接

1.全同源粘性末端连接

如果目的序列与载体两端具有相同的限制内切酶位点，则同一限制性核酸内切酶酶切后在目的基因与载体两端产生完全相同的粘性末端，在降低温度退火时，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的序列与载体DNA连接，实现基因重组，称为全同源粘性末端连接。另外，不同的限制性内切酶，如果产生的粘性末端相同，也同样用此方法连接。

该连接方法的优缺点为：

优点：该方法是最方便的克隆方法，其连接效率高，一般采用低浓度酶在低于16度，高浓度ATP的情况下进行连接。

缺点：容易出现载体自身环化、双向插入（即目的基因以两种方向插入载体和多拷贝插入的现象，从而在转化后出现高背景，使得筛选更为困难。双向插入尽管对基因克隆无影响，却会影响基因的表达。采用碱性磷酸酶事先对载体DNA进行去磷酸化处理，可有效避免载体自身环化现象；建立连接体系时，若将目的基因和载体DNA的摩尔数控制在2~3：1，则可有效减少多拷贝插入的问题。

2.定向克隆

使目的基因按一定的方向插入载体的克隆方案称为定向克隆。最常用的定向克隆方案使用两种限制性内切酶切割载体和目的基因，从而在载体和目的基因两端产生非同源互补的两个粘性末端。定向克隆也可以通过在一端造成平端，另一端产生同源粘性末端实现年-平连接。

定向克隆有效的限制了自身环化，并且实现了目的基因的定向插入，在基因克隆，尤其是表达某一基因时，极为有用。定向克隆的连接体系与相应的粘性末端或平末端连接相同。

（1）平末端连接

T4DNA连接酶能催化限制性内切酶切割产生的DNA平末端进行连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供使用，用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合，则可用适当的酶将粘性末端变为平末端，再用T4DNA连接酶。

平端连接比粘性末端连接效率低很多，但具有普适性，可适用于任何DNA片断间的连接，是非常有用的基因克隆策略。另外，平端连接还常用于将人工合成的人工接头连接到DNA末端，为进一步的克隆奠定基础。

平端连接的主要缺点是连接效率低和存在多拷贝的插入，为此，在平端连接时。需采用高浓度的DNAA和连接酶，同时，在连接体系中加入低浓度的聚义二醇类物质，也可有效提高连接效率。多拷贝插入的缺点。可通过控制插入片断与载体的墨尔比解决。

（2）同聚物加尾

同聚物加尾法就是利用末端转移酶分别在载体分子及外源双链DNA片段的3’末端各加上一段寡聚核苷酸，人工制成粘性末端。外源DNA片段和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，它能够催化脱氧核苷三磷酸逐个地加到DNA分子的3-OH末端，反应中不需要模板的存在，4种dNTP中的任何一种都可以作为它的前体物。因此，当反应混合物中

有一种dNTP时，就可以将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3-OH上，行程仅由一种核苷酸组成的尾巴。

（3）人工接头连接法

人工接头连接法可分为两种：一种为DNA连接法（linker）,另一种是DNA接头法(adapter)。

1.DNA连接子法：DNA连接子是一段人工合成的具有平头末端的双链寡聚脱氧核苷酸片断，长度一般为8~12个，其上有一个或数个限制性核酸内切酶的识别位点。由此可以看出，DNA连接子的作用主要是在DNA末端天加一个限制性内切酶识别位点，已产生粘性末端，已利用DNA片断连接。主要使用于对平末段的改造和连接。

2.DNA接头法:尽管DNA人工连接子技术具有许多优越性，但也存在一些弊端。如靶DNA内部含有与连接子相同的识别序列时，在进行限制性核酸内切酶切割之前，必须进行甲基化，以保护靶DNA不被破坏。这一系列步骤，使得DNA连接子技术操作较为烦琐。

DNA接头是一段人工合成的一端或两端为粘性末端的DNA序列，其中包含一个至多个限制性核酸内切酶位点。接头法克服了连接子仅适用于平端改造的缺点，可以平端与目的基因连接，也可以粘性末端与目的基因连接。

（4）T-A克隆

目前T-A克隆是用来直接克隆PCR产物的方便方法。其原理是：由于TaqDNA聚合酶在扩增目的基因的同时，可以不依赖于模板而在产生的两端加上两个游离的“A”，因而只要载体切口处人工加上游离的“T”，PCR产物即可与载体连接。T-A克隆载体已被广泛应用，并已成为商品化载体。

第三节克隆的筛选与检测

在基因克隆、DNA文库制备过程中，外源DNA与载体连接、载体转化宿主细胞或体外包装的载体中，往往有一部分是没有外源DNA的，来自自我载体的空荷载体。如何从克隆的群体中排除假阳性的重组子，如何从成千万的重组子中筛选出所需要的目的克隆，如何证明选择的克隆含有所需要的目的基因？所以筛选是克隆目的基因的重要步骤。筛选的目的就是挑选出含有目的序列的重组体。（一）重组克隆的初步筛选

克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源DNA分子本身的特性，采用不同的方法。主要有遗传学检测、物理特性检测、分子杂交以及免疫学分析等。从初步筛选直到分子杂交，进一步到DNA测序和基于蛋白质功能的分析，使得对克隆的检测逐步深入、精确。

1.重组克隆的遗传学检测

遗传学检测方法是重组子筛选过程中最初的检测步骤。重组子的表征来源于载体所携带的标记和重组子结构特性。根据这两类表征对重组子进行初步筛选。

重组子的筛选含有两层含义：（1）把携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来；（2）把携带有特定外源插入片段的重组子挑选出来。

(1)抗药性筛选

这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。

常用的抗生素筛选剂:氨苄青霉素（ampicillin，Ap或Amp）；氯霉素（chloramphenicol，Cm或Cmp）；卡那霉素（kanamycin，Kn或Kan）；四环素（tetracymic，Tc或Tet）；链霉素（strentomycin，Sm或Str）。重组质粒DNA携带特定的抗药性基因，转化后赋予受体菌在含有相应抗生素的培养基上正常生长，而不含此载体的DNA的受体菌不能存活。在质粒载体中通常使用双抗药性标记。

例如：以质粒载体pBR322为例，pBR322含有Tet r和Amp r两个抗性基因。非重组的野生型pBR322应该表现出对Tet和Amp两种抗生素的抗性活性。能在其中之一下生长的受体菌，说明其受体细胞已被转化。

（2）插入失活筛选法

检测克隆载体携带有外源DNA的通常方法是插入失活。经过抗药性筛选获得的大量转化子中既包含

所需要的重组子，也包含非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的抗药性进行再次筛选。

如：pBR322有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），在Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制酶位点，如果在这两个位点中有外源DNA插入，都会导致Tetr基因失活。将转化后的细胞分别培养在含氨苄青霉素和四环素的培养基中，便可检出转化子细胞。

（3）插入表达筛选法

与插入失活相反，插入表达法是外源目的基因插入特定载体后，能激活用于筛选操作的标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。设计载体时，在筛选标记基因前面连接一段具有抑制作用的负调控序列，插入外源DNA将使该负调控序列失活，其下游的筛选标记基因才能表达。例如质粒pTR262有一个负调控的cI基因，当外源DNA片段插入cI基因中的Bc II或Hind III位点，造成cI基因失活，位于cI 基因下游的Tet基因（受cI基因控制）因解除阻遏而被表达，转化后的重组体细胞，在含有四环素的平板中可形成菌落；而未被酶解的质粒，自身环化质粒的转化细胞及未转化受体细胞均不能形成菌落。

（4）环丝氨酸筛选

这种筛选方法只使用于抗四环素的基因插入失活的重组克隆筛选。

如：四环素抗性插入失活

如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。

Tet r失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；

Tet r不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。

（5）显色反应筛选法

上面所述的抗药性等筛选法是用插入失活原理筛选重组DNA的方法。对菌落或噬菌斑平板进行影印复制，通过两个平板的比较，才能辨别插入失活的表型特征。这给筛选工作带来许多麻烦。

显色反应可以在平板上或膜上直接显示出重组克隆，不仅方便而且灵敏。如：在某些载体如M13噬菌体载体，pUC质粒系列、pGEM质粒系列，它们的载体上都携带lac z'基因一段序列，它编码β-半乳糖苷酶的α肽，而宿主细胞为lac z△M15的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有X-gal 和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生有生物活性的β-半乳糖苷酶，把培养基中的无色X-gal 分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色。

若将外源DNA插入到载体上lac z￠序列中，使α-肽基因失活，失去α－互补作用，将重组体转化细胞培养在含有X-gal-IPTG平板上，菌落无色。利用β-半乳糖苷酶显色反应即可挑选出含有外源DNA重组体的阳性克隆

2.报告基因

报告基因是某种生物的特定基因，装配在载体上成为载体结构的一部分，具有指示的功能。与抗药性基因相比较，报告基因作为筛选方法有更高的灵敏度和准确性，在基因工程中的重要性要大得多。

报告基因的表达产物易被检测，受体细胞本身没有这种内源性产物。通过快速测定，“报告”外源基因是否已经重组到载体中，判断外源基因是否已成功地导入宿主细胞（器官或组织），或者在宿主细胞中是否表达。细胞内报告基因产物常作为直接观察载体活动的指示分子。把已知的调控元件连接到报告基因上，控制后者转录活性，对细胞中基因调控和表达的变化作出应答反应，从而直观地“报告”细胞内有关基因表达的信号传递。

在基因工程实验中，选用何种报告基因依赖于所使用的细胞和实验的性质，以及相应检测方法的掌握。选择报告基因的准则包括（1）报告分子（报告基因的产物）应不存在于原有宿主细胞中，或者易与内源性基因产物相区别；（2）报告分子应该有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法来检测；（3）启动报告分子表达应有很宽的信号范围，以便分析启动子活性的幅度变化；（4）报告基因的表达必须不改变受体细胞本来的生理活动。

基因工程中常用的报告基因：

如：（1）氯霉素乙酰转移酶（chloraphenicol acetyltransferase，CAT）基因——氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶的活性，从而阻断肽键的形成并最终抑制细胞生长。

（2）β-葡萄糖酸苷酶（β-Glucuronidase，GUS）基因：一种水解酶，转化植物细胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶能够催化某些特殊反应的进行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反应产物的检测即可确定Gus报告基因的表达情况，以此区分转化子和非转化子。

（3）荧光素酶（luciferase，LUC）基因——一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发光反应。

3.依赖于重组子结构特征分析的筛选方法

（1）快速裂解菌落鉴定分子大小——根据有外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子

（2）限制性核酸内切酶酶解分析法——不仅可以进一步筛选鉴定重组子，而且能判断外源DNA片段的插人方向及分子质量大小等

将重组DNA分子限制酶切点图谱与空载体图谱作对比，根据各种酶切所得DNA片段的大小及变化，即可推测有无外源DNA的插入，并确定出各插入片段的相对位置。

（3）利用PCR方法筛选确定重组子

利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提取的质粒为模板进行PCR反应，通过对PCR产物的电泳分析来确定目的基因是否重组入载体中。

（4）DNA序列测定

最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。

4.物理检测法

（1）凝胶电泳检测法

质粒DNA的电泳迁移率是与其分子量大小成比例的。因此，那些带有外源DNA插入序列的分子量较大的重组体DNA，在凝胶中的迁移速度，就要比不具有外源DNA插入序列的分子量较小的质粒DNA来得缓慢些根据这种差别，就可以容易地鉴定出哪些菌落是含有具外源NDA插入序列的分子量较大的重组质粒。

（2）R-环检测法

在临近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，即所谓的形成R-环的条件下，

双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此，将RNA及DNA的混合物置于这种退火条件下，RNA便会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的DNA-RNA杂交分子，而使被取代的另一链处于单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体，叫做R-环结构。R-环结构一旦形成就十分稳定，而且可以在电子显微锐下观察到。所以，应用R-环检测法，可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。

（二）目的克隆的鉴定

经过初步筛选获得的阳性克隆，下一步必须对带有目的序列的克隆做进一步筛选和鉴定。鉴定一般有几种常用方法：（1）分子杂交；（2）免疫学检测；（3）DNA测序；（4）蛋白质活性筛选；（5）基因互补实验。

1.分子杂交

核酸分子杂交有多种方法：原位杂交、点杂交及Southern杂交等。

原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此DNA／DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA／DNA或DNA／RNA杂种分子的这种能力，可以用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

核酸分子杂交实验包括如下两个不同的步骤：

?第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹转移，主要的有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌班印迹法；

?第二，是将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。

2.免疫学检测

免疫学检测的前体是需要有目的蛋白质，一般从纯化的蛋白质制备抗体。

原理：是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。这类方法的优点是实验周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干扰，如抗体的特异性高可区分不同型或亚型的细胞因子（如ifn），一次能检测大量标本，易标准化。与生物学活性检测方法相比，免疫学检测法在许多情况下敏感性低于前者，所得结果不表示生物学活性，有的mcab只能识别重组的细胞因子，在检测天然的细胞因子中受到限制。

如：

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目

前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

操作步骤：（1）克隆载体表达的蛋白与固相支持物结合；（2）加入目的蛋白特异的第一抗体，洗去未结合的抗体；（3）加入二抗，二抗分子偶连有标记酶；（4）加入无色底物；（5）对酶反应产物进行观察。

3.蛋白质活性和功能互补筛选

DNA杂交和免疫检测对于多数基因和基因产物都是有效的。蛋白质活性作为克隆的指示标记有一定的难度。如果筛选的目的蛋白是一种酶，也可以根据酶对底物的反应来设计克隆的检测。

功能互补法：该方法要求被转化的宿主细胞是某一特定基因的缺陷株，携带来自野生型基因DNA 的质粒，在宿主细胞中能与缺陷基因互补，最终选择具有正常功能的转化细胞。