显微成像方法与技术2-2
显微成像技术的发展与应用
显微成像技术的发展与应用近年来，科技日新月异，人们的生活也在不断发生变化。
显微成像技术作为科技领域的一个重要分支，在医学、生物、物理等领域得到了广泛的应用，并持续地不断发展。
本文将探讨显微成像技术的发展与应用，并分析它们的意义及未来的前景。
一、显微成像技术的发展显微成像技术是一项重要的科技创新，其发展历史可以追溯到17世纪。
当时，人们开始使用简单的显微镜观察微观世界。
19世纪，发明了复合显微镜，可以增强显微镜的分辨率，进一步促进了显微成像技术的发展。
20世纪，电子显微镜的诞生，为显微成像技术带来了一场革命，具有出色的分辨率和灵敏度，即使可以观察到原子尺度的物质。
随着计算机技术的不断进步，显微成像技术的精度和速度也得到了极大的提高。
二、显微成像技术的应用1、医学应用显微成像技术在医学领域中得到了广泛的应用，特别是在癌症的检测和治疗方面。
显微成像技术可以帮助医生将肿瘤细胞分解成微小的分子级部分，以便更准确地确定癌细胞的类型和位置，为疾病的治疗提供更好的依据。
2、生物领域应用显微成像技术在生物学领域应用广泛，能够帮助科学家研究细胞和生物分子的结构及定位。
现代显微成像技术能够使用荧光标记来标记特定的生物分子，从而揭示它们在细胞内的位置和功能。
这种技术在药物研发、疾病治疗和基因研究中得到了广泛的应用。
3、材料科学领域应用显微成像技术对特定材料的结构进行分析和图像化，对材料的分析和评估提供重要的信息。
底层的结构和相互作用方式对材料的性能和机能有着决定性的影响，显微成像技术可以在这一领域发挥独特的作用。
三、显微成像技术的未来随着显微成像技术的不断发展，它在医学、生物、材料科学等领域的应用范围将不断扩大。
研究者们也在不断努力改进技术的分辨率，使其可以观察到更细微的结构。
预计，在未来几年，人工智能和机器学习等技术的不断发展，将为显微成像技术的提高提供支持，从而实现对更细微的生物和科学结构进行更加准确的分析和评估。
近代显微成像技术的研究进展与应用
近代显微成像技术的研究进展与应用狄伶【摘要】The development of microscope imaging technology was introduced, and the imaging principle and application of fluorescence microscopy, confocal microscopy and super-resolution microscopy were outlined. The technology of stimulated emission depletion (STED) was clarified in the super-resolution microscopy. With the rapid development of computer technology and photo-electricity technology, a new generation of microscopy of living cells is developed, and cells tracking, real-time observation, 3D reconstruction, fluorescence quantification and four-dimensional dynamic analysis can be carried out at molecular and ion levels.%本文简述显微成像技术的发展历史,介绍荧光成像、共聚焦显微成像和超分辨显微成像技术的工作原理及应用.超分辨显微成像技术中主要介绍受激发射损耗技术.随着计算机技术和光电技术的飞速发展,新一代显微成像技术对活细胞微观生命活动实现了分子和离子水平的形态定位、实时动态观察、三维结构重组、荧光定量分析和四维动态分析.【期刊名称】《中国医疗设备》【年(卷),期】2018(033)002【总页数】4页(P107-110)【关键词】显微成像技术;共聚焦显微镜;受激发射损耗;超分辨显微成像技术【作者】狄伶【作者单位】上海交通大学分析测试中心,上海 200240【正文语种】中文【中图分类】TH74引言显微成像技术是一种借助物理方法观察微小物体的技术手段，它的发展与物理学领域对光的认识密不可分。
MetaMorph显微成像分析
■ 从宏观到细节
同 时 获 得 相同细 胞的微观 和宏观图 像
■ 从 平 面 到立体 4D浏 览 ， 获 知细胞的 所有结构 随时间发 生 的 位 移 变化和 转移过程 ，获得前 所未 有 的 深 层 细胞信 息
活细胞成像工作站
细胞离子成像
细胞离子成像/FRET简介
钙离子是生命活动最重要的离子之一，通过测 定细胞内游离钙离子浓度，科研工作者可以得知肌 肉收缩、神经信号传导、细胞间通讯、激素反应等 生命活动的重要信息。
另外，许多非金属阴离子，如H+，NO等及细胞 膜电位的检测和线粒体膜电位的快速检测对于观察 细胞的生物学特性有着重要的价值。
长 寿 命 光 源系统 多 种 类 型 的CCD
系 统 与 膜 片钳联 用
实 时 获 得 离子图 像和 离 子 绝 对 浓度值
应用实例
同时展示多波长图像和自定义的测量曲线。当对之前的图像进行二次分 析时，通过鼠标点击曲线任意位置能够快速展示出与之相对应的图像。
CHO细胞标记Fura-2 图像来源： the Biomedical Sciences short course , Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA. Courtesy of Lynda Pierini, PhD, Cornell Medical Center, Ken Dunn, PhD, Indiana University-Purdue University,and Professor ColinIzzard, SUNY University of Albany.
MetaMorph生物学显微成像和分析
资料2-1放大镜的使用方法
资料2-1 放大镜的使用方法放大镜的使用方法有两种：一种是将需要观察的物体放置在一个固定的位置上，再将放大镜靠近物体的一侧，然后沿着肉眼与物体之间的直线方向，缓缓地移动放大镜，直至看清楚物体的细微结构为止；另一种方法是将放大镜放置在一个固定的位置上，将需要观察的物体放置在放大镜之下（靠近放大镜），然后沿着肉眼与放大镜之间的直线方向缓缓地移动物体，直至看清楚物体的细微结构为止。
资料2-2 显微镜使用的注意事项1.取送方法因为反光镜是通过镜柄插放在镜臂下面的，目镜是插放在镜筒上的，所以它们很容易滑落而受到损害。
取送显微镜一定要一手握住镜臂，一手托住镜座，在任何情况下都不允许用一只手提着显微镜。
另外，也不允许学生取下反光镜和目镜到处乱照。
2.镜头的保护目镜和物镜平时放在显微镜箱内的专用的盒内，课间要用专用的塑料袋或布袋随时罩好。
镜头脏了，只能用专用的擦镜纸擦拭，擦拭时要顺着一个方向擦。
如果擦拭后仍不干净，可蘸一点二甲苯再擦。
注意，绝不能把镜头直接放到二甲苯中浸泡，这样会使镜头开胶，导致镜片脱落。
3.粗、细准焦螺旋的使用在调节粗、细准焦螺旋使镜筒下降时，一定要用眼睛直接看着镜筒缓缓下降。
否则，有可能砸坏物镜和玻片标本。
显微镜使用时间过长，镜筒容易出现下滑现象，要及时检查和维修。
4.转换器的使用转动转换器时，不要用手指扳物镜。
这容易使物镜镜头松动，改变焦距，影响观察的清晰度。
正确的方法是：手指握准转换器的边缘转动。
资料2-3 电子显微镜电子显微镜是一种精密分析仪器，是利用高速运动的电子束代替光波的一种显微镜。
工作原理为在一个高真空系统中，由电子枪发射电子束，穿透被研究的试样，经电子透镜聚焦放大，在荧光屏上显示一放大的物像，称为通用式电子显微镜；而用电子束在试样上逐点扫描，然后用电视原理进行放大成像显示在电视显像管上的，称为扫描式电子显微镜。
我国在1965年试制成功20万倍电子显微镜，后来又成功研制了80万倍电子显微镜。
光学显微技术
7、微分干涉显微
differentialmicroscope） （differential-interference microscope） 1952年，Nomarski在相差显微镜 年 在相差显微镜 原理的基础上发明。 原理的基础上发明 DIC显微镜使细胞的结构 显微镜使细胞的结构， 。 DIC显微镜使细胞的结构，特 别是一些较大的细胞器， 别是一些较大的细胞器，如 优点: 优点 能显示结构的三维立体投影影 DIC显微镜 显微镜 线粒体等， 核、线粒体等，立体感特别 与相差显微镜相比，标本可厚,折 像。与相差显微镜相比，标本可厚 折 下的硅藻 适合于显微操作。目前 强，适合于显微操作。，故影像立体感更强。 射率差别更大， 射率差别更大 故影像立体感更强。 （伪彩色） 伪彩色）
3Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and decreased. therefore brightness, is decreased.
像基因注入、核移植、转基 基因注入、核移植、 因等的显微操作常在这种显 微镜下进行。 微镜下进行。
四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： 四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： (A) 明视野显微镜 (B) 相差显微镜 (C) 微分干涉显微镜 (D) 暗视野显微镜
单分子定位显微成像技术介绍
单分子定位显微技术（Single Molecule Localization Microscopy，简称SMLM）是一种基于荧光显微技术的高分辨率成像方法，它的原理是通过利用单个荧光分子的闪烁信号来定位样品中的单个分子，从而实现高分辨率成像。
SMLM技术可以实现分子级别的可视化，其分辨率可以达到10纳米以下，远高于传统显微技术。
由于其高分辨率和高灵敏度，SMLM 技术已经成为生物学、化学、材料科学等多个领域中重要的研究工具。
一、原理SMLM的原理基于单个荧光标记的瞬时发光特性。
当激光或其他光源激发荧光标记时，标记会发射荧光光子。
这些光子在相机或光探测器上被捕获，并转化为电子信号。
在SMLM 中，通过分析这些光子的时间和空间分布，可以确定每个荧光标记的位置。
SMLM的关键在于利用光学显微镜的成像系统将荧光标记限制在光学焦点内，使得每次只有单个标记被激发发光。
因此，可以记录每个标记的光子发射时间和位置信息，并将这些信息用于精确定位标记的位置。
SMLM技术包括多种方法，其中最常用的是单分子激发的STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）和PALM（photoactivated localization microscopy）。
在SMLM过程中，需要解决许多技术挑战，包括背景噪声的影响、荧光标记的失活和漂移等问题。
为了解决这些问题，研究者们开发了各种算法和图像处理技术，如滤波、校正和重建方法等。
这些技术的应用可以提高SMLM的空间分辨率和信噪比，并为更深入的细胞生物学研究提供了新的工具。
图 1 STORM其中，STORM是最常用的SMLM技术，其基本原理是利用亚波长分辨率下荧光发光的闪烁特性，对单个发光染料的位置进行定位，进而构建出超分辨率的图像。
STORM技术将样品在一定范围内随机激发，从而使样品中的荧光染料分子以随机的方式发光。
利用图像处理算法，可以对发光点的位置进行高精度的计算，得到超分辨率图像。
光学显微镜技术
光学显微镜技术第一章概述第一节显微镜的作用人眼对微观世界观察的局限性光学显微镜是人类探索微观世界的光学精密仪器光学显微镜的发展在很大程度上决定了人们对生命现象的认识第二节显微镜的类型根据照明源的性质一、光学显微镜：利用可见光（或紫外光）为照明源，一般有单式及复式显微镜两类。
复式显微镜可分为：1.普通型：常规使用。
2.特种型：如荧光、相衬显微镜等；供专门观察和研究。
3.高级型：万能显微镜。
4.共焦激光扫描显微镜（Confocal）。
第三节光学显微镜的发展简史1625年法布尔提出显微镜的概念1610年伽利略制造出具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜1611年开普勒说明了显微镜的原理1665年虎克制造出放大140倍的显微镜，提出“Cell”的概念1684年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜19世纪阿贝提出显微镜的完整理论1902年艾夫斯建立了双目镜系统1935年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖20世纪60年代微分干涉衬显微镜问世20世纪80年代共焦激光扫描显微镜开始应用第四节显微镜的基本光学原理一、折射与折射率光线的折射现象物质的折射率二、透镜的性能凸透镜可以会聚光线凹透镜可以发散光线三、透镜的成像质量象差：是指透镜所形成的象与理想象在形状、颜色等方面存在差异。
色差：由于不同的颜色光线折射率差异而形成的象差。
色差的校正（1）采用单色光为光源。
（2）利用透镜的性质。
四、显微镜的成象（几何成象）原理利用凸透镜成象原理物镜成象：利用物体在凸透镜一倍焦距以外二倍焦距以内，成倒立的放大的实象。
目镜成象：是利用物体在凸透镜一倍焦距以内，成正立的放大的虚象。
显微镜成象原理：第二章、显微镜的主要光学技术参数第一节数值孔径（Numerical Aperture，NA）数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体间介质的折射率（η）和孔径角（u）半数正弦的乘积。
用公式表示：NA= ηsin u/2数值孔径代表了物镜或聚光镜光通量的大小，是衡量物镜或聚光镜性能高低的重要指标。
【显微光学】显微镜光学原理及技术参数详解
显微镜光学原理及技术参数详解目录1 第一章：显微镜简史 (2)2 第二章显微镜的基本光学原理 (2)2.1 折射和折射率 (2)2.2 透镜的性能 (2)2.3 影响成像的关键因素—像差 (2)2.3.1 色差（Chromatic aberration） (3)2.3.2 球差(Spherical aberration) (3)2.3.3 慧差(Coma) (3)2.3.4 像散（Astigmatism） (3)2.3.5 场曲（Curvature of field） (4)2.3.6 畸变（Distortion） (4)2.4 显微镜的成像（几何成像）原理 (4)2.5 显微镜光学系统简介 (5)3 第三章显微镜的重要光学技术参数 (5)3.1 数值孔径 (6)3.2 分辨率 (6)3.3 放大率 (7)3.4 焦深 (7)3.5 视场直径（Field of view） (7)3.6 覆盖差 (8)3.7 工作距离 (8)4 第四章显微镜的光学附件 (8)4.1 物镜 (9)4.2 目镜 (11)4.3 聚光镜 (11)4.4 显微镜的照明装置 (12)4.5 显微镜的光轴调节 (13)5 第五章各种显微镜检术介绍 (14)5.1 金相显微镜 (14)5.2 偏光显微镜（Polarizing microscope ） (17)5.3 体视显微镜（Stereo microscope） (19)1第一章：显微镜简史随着科学技术的进步，人们越来越需要观察微观世界，显微镜正是这样的设备，它突破了人类的视觉极限，使之延伸到肉眼无法看清的细微结构。
显微镜是从十五世纪开始发展起来。
从简单的放大镜的基础上设计出来的单透镜显微镜，到1847年德国蔡司研制的结构复杂的复式显微镜，以及相差，荧光，偏光，显微观察方式的出现，使之更广范地应用于金属材料，生物学，化工等领域。
2第二章显微镜的基本光学原理2.1折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现像，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。
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LSM 510系统光路图
1.Optical fibers conducting laser light 2.Collimators 3.Beam combiner 4.Main dichroic beamsplitter 5.Scanner 6.Scanning lens 7.Secondary dichroic beamsplitter 8.Secondary dichroic beamsplitter 9.Secondary dichroic beamsplitter
光谱串扰
激发串扰和发射串扰
以GFP和DsRed为例，说明如何避免激发串扰。
假如细胞内同时转入了GFP和DsRed，可以458nm激发GFP的荧光，543nm激发DsRed
的荧光，此时检测到的基本是单个探针的荧光。 如果以488nm或514nm激发，则会同时激发二者的荧光。
传统的解决串扰的方法是通过滤光片的选取来检测某一探针的最强荧光光谱区段，以 与光谱上相邻近的探针的荧光区分开。 例如，同时被GFP和YFP标记的细胞，以488nm激发时，同时可检测到GFP和YFP两者 的荧光。为区分二者的荧光，可用500-520nm滤光片收集GFP的荧光，而用535-545nm 滤光片收集YFP的荧光。虽然这个方法不能完全清除相邻探针的荧光串扰，但主要贡 献还是来自所检测的探针。
有效观测时间长。荧光染料的光致漂白(即染料分子会因激发次数过多结构受到破 坏而失效)是制约实验观测、影响实验结果准确性的主要因素之一。对于共聚焦显 微镜, 由于整个激光照射区域内的染料分子都会被激发, 导致非焦点区域的染料过 早漂白。而双光子激发只产生在焦点附近的一个极小区域中, 从而大大减少了对非 观测区荧光染料的破坏，使实验能够在保持生物体活性的前提下长时间进行。
物的荧光信号，并可较好地消除荧光串色的影响、最大限度减少样品荧光信号的损失。
META 技术在共聚焦显微镜的应用是荧光检测技术的重大突破，适合目前不断发展 的新荧光标记技术的应用（如多荧光蛋白标记等），使得对细胞荧光信号的动态分析 更方便和高效，如 FRAP，FRET 分析等，为生命科学研究提供了更加灵活、多样的 手段和方法。
3. Main dichroic beam splitter wheel (8 positions)
4.Projection lens D detector 6.Camera mirror
7. Auxiliary beam splitter wheel (8 positions)
8.Channel 1of the emission filter wheel (6+1 posotions) 9.Pinhole channel 1 (motorized in x, y and z) 10.Detector channel 1: fiber-coupled APD 11.Channel 2 of the emission filter wheel (8 posotions) 12.Pinhole channel 2 (motorized in x, y and z) 13.Detector channel 2: fiber-coupled APD
荧光互相关函数得到的信息：两种成分有没有发生相互作用， 函数的幅度与结合成分的比例成正比。
用荧光互相关FCCS识别和检测凝血酶
ConfoCor2荧光相关谱实验装置
ConfoCor 2系统光路图
1.Optical fiber of the laser module 2.Motorized collimato
制，如果想提高收集效率，就需要扩大孔宽度，而这将导致分辨率下降，反之亦然。
对探测光路的要求低。由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波 效果，多光子显微镜对光路收集系统的要求比共聚焦显微镜低得多，光学系统相对 简单。
Байду номын сангаас
适合多标记复合测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发谱宽阔， 这样，可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的 不同信息，便于相互对照补充。例如，EGFP 和DsRed 的单光子激发波长分别为488 nm 和568 nm，无法实现利用一束单波长激光同时激发。Jakobs 等利用双光子技术， 用925 nm激光同时激发了两种荧光蛋白，观察了它们在Escherichia coli 内的表达情 况。
分光谱的原理
1. 获取λ-Stacke
使用LSM 510 META系统的META通道获取样品的λ-Stacke。这个通道包括分光光 栅和 32 个高灵敏度 PMT 检测器。每个探测器的最小光谱带宽为10.7nm。
2. 参考光谱的定义
不同探针定域于样品的不同区域。
不同探针在样品中交错存在，空间上无法严格区分开。
FCS技术的优点
FCS 测量与传统的其他方法相比其主要优点在于：很高的灵敏度(甚至达到单分子探 测的水平)、测量时不破坏研究体系的平衡状态、可以进行实时监测。FCS 技术通过 对微小体积内荧光分子激发荧光的涨落做相关分析，可以得到产生荧光涨落过程的
信息。在传统的方法中，样品的体积由聚焦激光束和针孔确定，荧光通过一个高数
多光子激发的光源
发生双光子吸收的概率依赖于两个光子在荧光基团内吸收截面的空间位置重叠和到达 时间重叠。双光子激发需要非常高的局部瞬时强度，为得到该强度，激光脉冲峰与基
底之比可达106。但如此强的能量只集中在极短的激光光脉冲宽度(1 飞秒= 10- 15秒)内，
占空比很小，对生物样本并不会造成很大的伤害。双光子显微镜使用高能量锁模脉冲 激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度 只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。例如使用76MHz重复率的100飞秒的 激光脉冲，单脉冲能量只有纳焦耳量级。利用多光子激发，对原本必须用紫外波长(例 如350nm)单光子激发的样本可改用红光波长的双光子(700nm)激发，大大减小了对样本 的伤害。而且，多光子激发可以使用调谐激光器，例如可调谐兰宝石激光器，可输出 700-1000nm波长的激光。
多光子激发原理示意图
(1)荧光分子的多光子激发需要的激光波长比
多光子激发的特点
单光子长。例如, 双光子激发需要的激光波
长大约是单光子激发所需激光波长的二倍。 因此多光子激发能够用红外或者近红外光代 替紫外光作为激发光源。 (2)多光子激发只产生在焦点附近的一个极小 区域中。单光子吸收截面R1=10-17-10-18cm2,
穿透深度深。生物体(细胞、组织等)一般都是高散射体。由于散射系数反比于入射
光波长的四次方，多(N )光子成像将散射系数减弱到原来的1/N 4，使大部分入射光
强能到达样品焦平面，提高了穿透深度，有利于获取深层次组织的清晰荧光图像。
荧光收集率高。与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器(针孔)，提高了 荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。而共聚焦显微镜受到小孔限
单光子与双光子荧光激发比较 (样品为罗丹明B水溶液)
这是多光子激发的一个基本点。而单光子激
发区域为两个锥形区, 在整个照明区均产生 荧光。
双光子激发与单光子激发的比较
多光子激光扫描显微镜的特点
对生物样品的光损伤小。克服了共聚焦显微镜在活体细胞和组织观测中的主要缺陷, 减少了焦点外的光学损害和背景光强度, 极大地降低了紫外光对生物体正常生理活 动的破坏和影响, 为活体观测和研究提供了有利条件。
3. 光谱分离
为了分离光谱，需要样品的λ-Stacke和样品中各个探针的参考光谱。 Linear Unmixing软件通过线性运算来实现光谱分离，即计算每个像素点各个探针 发射信号的强度。因为每一个像素点对应样品的一点，此点检测的光谱S(λ)sum是 各个探针在此点发射信号的累积，可以下式表示。
所以，已知各个探针的参考谱S(λ)dyeA，B and C，就可计算出各个探针的荧光强度 intensitydyeA，B and C。
钛宝石锁模飞秒激光器（MIRA-900F，美国Coherent公司） 输出脉冲宽度：120fs 重复频率：76MHz 平均输出功率：1.3W 可调谐波长范围：700-980nm
荧光相关谱技术
荧光相关谱(Fluorescence correlation spectroscopy，简称FCS)技术是一项近年发 展很快的实验技术，在生物学领域研究中、特别是对活体中动态过程的测量显示出广 阔的应用前景。 FCS 技术测量单个粒子或分子经过一个非常小的荧光激发区域(一般小于1μｍ3)时所 发出的荧光，通过分析荧光涨落的自关联函数得到粒子扩散系数、激发区域内的粒子 数等信息。
LSM 510 META系统 META 通道：分光 光栅和 32 个高灵敏度 PMT 检测器）
LSM 510 META系统光路图
1.Optical fibers 2.Motorized collimators 3.Beam combiner
4.Main dichroic beamsplitter
5.Scanning mirrors 6.Scanning lens 7.Objective lens 8.Specimen 9.Secondary dichroic beamsplitter 10.Confocal pinhole 11.Emission filters 12.Photomutiplier 13.META detector 14.Neutral density filters 15.Monitor diode 16.Fiber out
10.Pinholes
11.Emission filters 12.Photomultipliers 13.Neutral density filters