质粒拷贝数的测定方法
质粒拷贝数的测定方法
生物技术通讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY1999年 第10卷 第1期 Vol 10 No.1 1999质粒拷贝数的测定方法周 涛摘要 在研究生物工程重组蛋白产量的过程中，质粒的拷贝数是一个需要重点考虑的参数，对它进行精确定量至关重要。
本文概述了几种主要的测定方法的原理和特点。
关键词 质粒拷贝数；测定方法Determination methods of plasmid copy numberZhou Tao(Institute of Biotechnology, Beijing,100071)Abstract Plasmid copy number, the number of expression vectors in each cell, is a key parameter in the study of productivity of recombinantmicroorganisms. Recognition of the importance of this parameter has givenrise to a number of methods for its determination. this article focuses on the principles and charactistics of these methods.Key words plasmid copy number; determination method细菌质粒是双链、闭环的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在一般情况下对宿主细胞的生存不是必需的，但质粒含有某些基因，可以补充细菌基因的不足，有利于细菌的生存。
质粒DNA的复制要由复制细菌染色体的多种酶共同完成，在宿主中复制的程度差异很大。
质粒拷贝数指的是每个细胞中所含的质粒的个数。
低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1～2次，而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10～200拷贝。
数字PCR方法准确测量质粒DNA拷贝浓度
数字PCR方法准确测量质粒DNA拷贝浓度董莲华;隋志伟;王晶;傅博强【摘要】中国计量科学研究院(NIM)利用数字PCR技术针对国际比对样品质粒DNA,通过设计2对特异性的引物和探针、优化PCR扩增体系、排除PCR mastermix中的DNA污染,成功建立了定量该质粒DNA的数字PCR方法.比较了采用单重PCR和双重PCR方法定量结果之间的差异,最终实现了对比对样品的定量和不确定度评定.对线性质粒样品的测量结果及其扩展不确定度(k=2)为(8.06±0.55)×103 copies/mg,该结果在比对参考值不确定度范围内,且与参考值非常接近.%NIM established two digital polymerase chain reaction (dPCR) assays for quantifying the plasmid DNA sample, including designing two pairs of specific primer and probe, optimizing PCR amplifying conditions and excluding the DNA contamination in the PCR mastermix.The measurement results by simplex and duplex dPCR are compared.The DNA sample is successfully quantified by the established dPCR method and the measurement uncertainty is eventually evaluated.The measurement result with its expanded uncertainty (k=2) is (8.06±0.55)×103copies/mg, it agree well with the reference value within the standard uncertainty and very close to the reference value.【期刊名称】《计量学报》【年(卷),期】2017(038)002【总页数】5页(P247-251)【关键词】计量学;质粒DNA;数字PCR;拷贝浓度;国际比对;可比性【作者】董莲华;隋志伟;王晶;傅博强【作者单位】中国计量科学研究院, 北京 100029;中国计量科学研究院, 北京100029;中国计量科学研究院, 北京 100029;中国计量科学研究院, 北京 100029【正文语种】中文【中图分类】TB99核酸含量测量具有广泛的应用，如转基因检测、食品中微生物污染以及临床中传染病诊断等方面均涉及到核酸含量的测量。
实时定量PCR测定治疗性HBV_DNA疫苗工程菌的质粒拷贝数
广东药科大学学报Journal of Guangdong Pharmaceutical University Sep,2023,39(5)实时定量PCR测定治疗性HBV DNA疫苗工程菌的质粒拷贝数陈孟璋，何星垚，林汉森（广州广药益甘生物制品股份有限公司，广东广州511495）摘要：目的比较不同的定量方法和总DNA制备方法对实时定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）测定治疗性HBV DNA疫苗工程菌的质粒拷贝数（plasmid copy number,PCN）的影响，为建立快速简便的治疗性HBV DNA 疫苗工程菌的PCN测定方法提供参考。
方法通过试剂盒提取法、Triton X-100煮沸法和培养基煮沸法分别制备总DNA样品用于qPCR检测，使用绝对定量方法和相对定量方法计算不同制备方法样品的PCN，并对测定结果进行统计学分析。
结果试剂盒提取法制备的样品经绝对定量和相对定量计算PCN，结果分别为43.10±4.02和42.92±3.98，显著低于Triton X-100煮沸法的结果（69.32±6.51和68.58±6.42）以及培养基煮沸法的结果（75.73±7.46和76.15±7.50）。
任一样品制备方法，比较其绝对定量和相对定量结果，差异均无统计学意义。
结论qPCR的绝对定量和相对定量计算方法都适用于治疗性HBV DNA疫苗工程菌PCN测定，Triton X-100煮沸法更适合于总DNA模板制备。
关键词：HBV疫苗；DNA疫苗；实时定量PCR；质粒拷贝数中图分类号：R392.1文献标识码：A文章编号：2096-3653（2023）05-0087-06DOI:10.16809/ki.2096-3653.2023051703Determination of plasmid copy number of therapeutic HBV DNA vaccine engineered strain by real-time quantitative PCRCHEN Mengzhang*,HE Xingyao,LIN Hansen(Guangzhou Guangyao Yigan Biological Products Co.,Ltd.,Guangzhou511495,China)*Corresponding author Email:**************Abstract:Objective To compare the effects of different quantitative methods and total DNA preparation methods on the plasmid copy number(PCN)determination of therapeutic HBV DNA vaccine engineered strain by real-time quantitative PCR(qPCR),so as to provide reference for the establishment of a rapid and simple method for the PCN determination of therapeutic HBV DNA vaccine engineered strain.Methods Total DNA samples were prepared for qPCR by kit extraction method,Triton X-100boiling method and medium boiling method, respectively.The PCN of samples prepared by different methods was calculated by absolute and relative quantification methods,and the results were statistically analyzed.Results The absolute and relative quantification results of PCN of samples prepared by kit extraction method were43.10±4.02and42.92±3.98, respectively,which were significantly lower than those obtained by Triton X-100boiling method(69.32±6.51) and medium boiling method(75.73±7.46).There was no significant difference between the absolute and relative quantitative results of any sample preparation method.Conclusion Both the absolute and relative quantitative methods of qPCR are suitable for the determination of PCN of therapeutic HBV DNA vaccine engineered strain, and the Triton X-100boiling method is more suitable for the preparation of total DNA template.Key words:HBV vaccine;DNA vaccine;real-time quantitative PCR;plasmid copy number收稿日期：2023-05-17基金项目：广东省重大科技专项（2012A080204009）作者简介：陈孟璋（1985－），男，硕士，制药工程师，主要从事生物医药研发和临床试验研究，Email：**************。
第七章、质粒
sopA与sopB构成一个转录单位， sopA与启动区域结合，控 制2个蛋白的转录。属自体阻遏控制。 sopB蛋白起到促进sopA与启动区域结合的作用。 sopA 、 sopB缺一不可。 sopC由12个正向重复序列组成，每个含有43个bp，其中又 包含反向重复序列。
sopB与 sopC区结合形成核酸－蛋白复合物，称为 分配复合体。 分配复合体在细胞分裂时将 2个质粒移向细胞两级。 sopA与启动区域结合，控制2个蛋白的转录。 sopB 蛋白起到这一结合的促进作用。 sopA 、sopB缺一 不可。 质粒主动分配模型见图5－14
1、质粒的复制
能够独立复制的单位称为复制子（replicon）。 质粒的复制以θ型复制为主，有单向和双向复制， 以及滚环复制。复制所需蛋白主要来自寄主。 质粒的复制起始位点称为 ori V。 Ori 区域的功能： A.复制起始 B.决定宿主范围 C.决定拷贝数
2、质粒复制的调节
1）、抑制物—靶位调节 调节特点：依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物， 通过与目标RNA的互补结合阻止质粒复制起始。目 标RNA可以是复制的引物，也可以是复制所需蛋白 的mRNA。
放线菌的质粒 scp 不但是致育因子，同时还 编码抗生素合成基因。 多数质粒不显示任何表型效应，至少目前的 方法和手段还测定不出来，这些质粒称为隐 秘质粒（cryptic plasmid）,许多细菌都有， 并非无功能，只是尚未发现。
苏云金芽孢杆菌是著名的杀虫细菌，其杀虫晶体蛋 白（Insecticidal crystal protein, ICP）基因在质粒 上。 编码杀虫晶体蛋白基因多为 cry，还有 cyt 基因 不同的cry 基因杀虫活性不同 对杀虫晶体蛋白敏感的害虫有很多种，包括：鳞翅 目、鞘翅目、双翅目等等。
第五章质粒
起始发生于含有复制所必需的所有顺式作用 元件的600个核苷酸的区段 DNA前导链的 个核苷酸的区段. 元件的600个核苷酸的区段.DNA前导链的 合成以RNAⅡ 合成以RNAⅡ. RNAⅡ RNAⅡ前体的合成起始于其复制起点上游 550bp处的启动子区 继而穿过复制起点, 550bp处的启动子区,继而穿过复制起点, 处的启动子区, 终止于下游大约150个核苷酸附近的一个位 终止于下游大约150个核苷酸附近的一个位 点.
broad host range
ColE1 pBR322, pUC narrow host ranges Escherichia coli, Klebsiella , Salmonella
almost any Gramnegative organism
三,质粒复制调控 任何染色体的复制都受到调控. 任何染色体的复制都受到调控. 在携带pMBl/colEl复制子的质粒中 复制子的质粒中, 在携带pMBl/colEl复制子的质粒中,这种正 向调节分子是一种RNA,被称为RNAⅡ 向调节分子是一种RNA,被称为RNAⅡ, 它被用作引发DNA前导链的起始合成 前导链的起始合成. 它被用作引发DNA前导链的起始合成. 但是,其他复制子( pSC101)的调节分子 但是,其他复制子(如pSC101)的调节分子 则是一种顺式作用蛋白(RepA ), 则是一种顺式作用蛋白(RepA ),它对复制 的起始具有正向作用, 的起始具有正向作用,而对其自身基因的转 录具有负调控作用. 录具有负调控作用.
除RNAⅠ外,另外一种调控是Rop蛋白,由质粒编码. RNAⅠ外 另外一种调控是Rop蛋白,由质粒编码. Rop蛋白 Rop蛋白质可提高RNAⅠ与RNAⅡ结合的效率.ROp蛋 Rop蛋白质可提高RNAⅠ与RNAⅡ结合的效率.ROp蛋 蛋白质可提高RNAⅠ 结合的效率 白通过促进RNAⅠ RNAⅡ杂交体的形成 RNAⅠ和 杂交体的形成, 白通过促进RNAⅠ和RNAⅡ杂交体的形成,增强 RNAⅠ的负调节作用 的负调节作用. RNAⅠ的负调节作用. 因此,rom/rop基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数 基因缺失至少可使colE1 因此,rom/rop基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数 提高两个数量级.例如, /rop基因的缺失可使 提高两个数量级.例如,rom /rop基因的缺失可使 较早期组建的载体pBR322 pBR322在每个细菌细胞中的质粒 较早期组建的载体pBR322在每个细菌细胞中的质粒 拷贝数从15~20个增至500个以上, ram/rop基因 15~20个增至500个以上 拷贝数从15~20个增至500个以上,在ram/rop基因 中插入一段外源DNA片段, DNA片段 中插入一段外源DNA片段,则可导致致死性的大量 质粒DNA复制. DNA复制 质粒DNA复制.
质粒抽提及鉴定
质粒抽提质粒浓度测定1、打开电脑中NanoDrop程序，选择Nucleic Acid测定。
2、选择抽提试剂盒中的TB作为标准液，吸取2μL擦洗超微量分光光度计（NanoDrop2000）检测头，用擦手纸擦洗两次。
（注意移液枪滴注的手法，用手托着枪头，如此更加稳定）3、再次吸取2μlTB滴入检测头，点击Blank调零。
4、吸取2μl样本，滴入检测头，在Sample ID中输入检测的质粒名称（质粒名称—日期—标号）。
5、点击Measure，开始测量样本（检测前样本需打匀数次）。
6、样本评价，260/280在1.9～2.0之间样本即为标准。
若260/230质粒浓度（Conc.）：在EP管盖上标注浓度，以μg/μL为单位。
7、测定结果图片保存：打开画图程序，先把程序里的图片显示好，按Print Screen键，再点击画图程序，按Ctrl + V键复制图像，再粘贴到Excel程序内。
＜＞质粒核酸电泳DNA能够进行电泳的原理：碱基、磷酸和戊糖三种成分连接构成核苷酸，分为脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。
脱氧核糖核苷酸组成的长链，即是DNA带均匀负电荷。
DNA分子量的描述：生物学上描述DNA常用的kb、nt、bp表示。
kb——千碱基对kilo basent——核苷酸nucleotidebp——碱基对base pair50ml）1、1×TAE buffer（50ml）+ agarose（重量比例为1%，0.5g）——摇匀后放入微波炉2min加热溶解（加热时需用擦手纸盖住瓶口）。
2、加入Gelred（体积比例为1:10000，5μL），摇匀后倒入配胶架，放置室温凝固约30min。
（如想加快时间，可以放置4℃冰箱冷冻加速变硬）不过最好是常温凝固25min后，再放入冰箱10min，效果更佳。
1、吸取6×核酸loading buffer 2μL + 10μL质粒样本打匀待用。
（先在不透水纸张上滴好loading buffer，再加入质粒样本，不同样本换枪头防止污染）2、凝胶放入电泳槽中滴加样本，吸取10μL Marker滴加至凝胶孔中，再依次加入上样后的质粒样本。
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
质粒
第二节 质粒编码的遗传表型
大多数的质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性，即 具有一定的表型，质粒可依其表型的不同主要划分为以下 几种类型: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 致育质粒 抗药性质粒 产生毒素的质粒 降解质粒 致病性质粒 共生固氮质粒
致育质粒
R质粒
这类质粒(R质粒)能 使宿主微生物对抗生 素、化学药物或重金 属离子等杀菌剂表现 出抗性。
在新产生的无质粒的子细胞中，开始的时候是含有CcdA 和 CcdB 这两种蛋白质的 。 但由于毒剂 CcdB 和解毒剂 CcdA 具有不同的稳定性， CcdA 蛋白质不稳定，易被蛋 白水解酶 (protease) 降解，而较稳定的 CcdB 蛋白质便可 行使其对寄主细胞的致死作用。
2. 随机分配机制(random distribution)
几种不同质粒的转移性能
质粒 ColE1 ColE2 ColE3 拷贝数 10-18 10-18 10-18 转移性 不能 不能 不能 质粒 R6k RP4 pBR322 拷贝数 1-2 4-7 约20 转移性 能 能 不能
F 因子
R100
1-2
1-2
能
能
pBR325
约20
不能
1. 自主转移质粒的特点 已 知 大 肠杆 菌 的 F 质 粒 、 R1 、 R100 、 ColV 、 Collb-P9 、 R6k、RP4等均属于自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒， 其中较小的R6k质粒也有38kb。 许多G-细菌中的自主转移质粒需要大于30kb的DNA来编码 与接合转移有关的蛋白质，如F质粒的转移操纵子(tra)就包 含23个基因，大小为33 kb。 tra基因和oriT在质粒自主转移过程中起着重要作用，所以 大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点。
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生物技术通讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY1999年 第10卷 第1期 Vol 10 No.1 1999质粒拷贝数的测定方法周 涛摘要 在研究生物工程重组蛋白产量的过程中，质粒的拷贝数是一个需要重点考虑的参数，对它进行精确定量至关重要。
本文概述了几种主要的测定方法的原理和特点。
关键词 质粒拷贝数；测定方法Determination methods of plasmid copy numberZhou Tao(Institute of Biotechnology, Beijing,100071)Abstract Plasmid copy number, the number of expression vectors in each cell, is a key parameter in the study of productivity of recombinantmicroorganisms. Recognition of the importance of this parameter has givenrise to a number of methods for its determination. this article focuses on the principles and charactistics of these methods.Key words plasmid copy number; determination method细菌质粒是双链、闭环的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在一般情况下对宿主细胞的生存不是必需的，但质粒含有某些基因，可以补充细菌基因的不足，有利于细菌的生存。
质粒DNA的复制要由复制细菌染色体的多种酶共同完成，在宿主中复制的程度差异很大。
质粒拷贝数指的是每个细胞中所含的质粒的个数。
低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞分裂前只能复制1～2次，而多拷贝数质粒可以在细胞分裂前复制成10～200拷贝。
质粒的拷贝数依赖于各种胞内外因素：质粒拷贝数首先决定于自身的遗传性，控制质粒拷贝数的基因位于一个包括DNA复制起点在内的质粒DNA的区域内。
其次，质粒的拷贝数也受细胞生长条件的影响。
细胞的生长速率增大时，质粒的拷贝数下降，主要是因为在高比的生长速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从而质粒拷贝数不断下降［1］。
此外，培养时的温度和培基的组成都对质粒拷贝数有影响，比如当营养物限制或缺乏时会使质粒的拷贝数下降［2］。
为了降低高拷贝数质粒的代谢负担，Remaut等构建了一种所谓潜复制的质粒，在正常情况下每个细胞只有1个拷贝，经诱导后其浓度可达到每个细胞1000拷贝［3］。
一般来说，外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高，但是当拷贝数很大时，拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在了［4］。
这主要有两方面的原因：一方面，高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定，可能是由转录和翻译水平决定的；另一方面，高拷贝数的质粒往往很不稳定。
由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关，因此对于重组蛋白的生产来说，质粒的拷贝数是一个非常重要的参数。
那么迫切需要解决的问题就是如何准确地测定胞内质粒的拷贝数。
现在已经发展了一些测定的方法，大致可以归纳为两类：一类是直接进行测定的方法，包括一些物理分离的方法和杂交的方法；另一类就是间接测定的方法。
下面对这些方法做一个简单的介绍。
1 物理分离的方法物理分离的方法就是将质粒DNA与染色体DNA进行分离并定量。
将质粒DNA与染色体DNA分开主要是基于质粒DNA的两大特性：①质粒DNA 是以共价闭合环状的形式存在，与染色体DNA的线状形式不同；②质粒DNA的分子量比染色体DNA要小得多。
这些方法主要包括：氯化铯-溴化乙锭平衡梯度离心法、凝胶电泳法、高效液相色谱法以及毛细管电泳法等。
1.1 氯化铯-溴化乙锭（CsCl-EB）平衡梯度离心法CsCl-EB平衡离心法是早期经常采用的方法，这种方法分离质粒和染色体DNA，是因为EB与线状和闭合环状DNA分子的结合量有所不同。
EB通过嵌入碱基之间与DNA结合，进而使双螺旋解旋，由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。
最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了EB分子的继续嵌入。
但线状分子则不受限制，可继续结合更多的染料，直至达到饱和，即每两个碱基对大约结合一个EB分子。
正是由于染料结合量的差别，使得线状和闭环DNA分子在含有饱和量EB的CsCl梯度中的浮力密度有所不同，从而达到分离的目的。
如果在细菌的培基中预先加入放射性标记的物质，那么根据回收的DNA条带的放射性强度可以进行定量分析。
1965年，Dewitt在CsCl梯度离心后采用了分部收集的方法，将离心后的产物按密度梯度由高到低分成若干个部分，每部分取出一定的量进行液闪测定。
如图1所示，浮力密度由右到左逐渐增大，前面的“卫星”峰即为质粒DNA峰。
而且分部越细，测定结果的精确度越高。
Clewell及其同事利用这种方法进行了大量的试验，发现放射性物质的回收率有很大的差别，从68%到90%不等［5,6,7］。
根据质粒DNA峰的面积与染色体DNA峰面积的比值即可计算质粒的拷贝数。
图1 CsCl-EB平衡梯度离心法分离菌株S.faecalisDS-5 DNA粗提液［5］CsCl-EB梯度离心法一般需要在超速条件下离心较长时间，比如用垂直转头UTi65需要以45 000 r/min离心16 h，用角转头则时间更长，Ti50以45 000 r/min离心48h，Ti65以60 000 r/min离心24 h，Ti70.1以60 000 r/min离心24 h等等，因为只有这样才能获得较满意的密度梯度。
用CsCl-EB梯度离心法来测定最大的缺点就是分部困难，回收率不稳定，并且十分费时，因此一般都不用来定量，而只做纯化回收质粒之用。
1.2 凝胶电泳（Gel electrophoresis, GE）琼脂糖和聚丙烯酰胺是常用的两种凝胶基质。
聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5～500 bp）效果最好，分辨力极高，相差1 bp的DNA片段就能分开。
琼脂糖凝胶的分辨能力比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广，从200 bp到50 kb，同时琼脂糖凝胶的制备与操作都比聚丙烯酰胺凝胶容易，因此，分离DNA通常都采用琼脂糖凝胶电泳。
由于在中性pH的电泳缓冲体系中，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动，迁移率的大小与DNA分子大小及立体构象有关。
并且在相同电泳条件下，按照Modsnad模型，小分子是以直线泳动的， 而大分子则以曲线泳动，因而小分子泳动速度较大分子迅速，这样，质粒DNA与染色体DNA就得到了分离。
Wesblum［8］等首先利用了凝胶电泳的这一特性来测定质粒的拷贝数。
他们将培养物进行放射性标记，凝胶电泳后测定各条带的放射性强度。
Projan［9］等人采用荧光标记DNA，通过测定标记物的荧光强度代替测定放射性强度，从而扩大了这一方法的应用范围。
测定荧光强度来确定质粒的拷贝数的方法主要有3个步骤：①琼脂糖凝胶电泳分离细胞裂解液；②溴化乙锭染色；③色谱扫描仪扫描电泳条带。
可以直接扫描凝胶，也可以扫描凝胶照相后的底片，但无疑前者的准确度要高一些，因为扫描底片时除了要考虑荧光信号以外还有胶片敏感性的影响。
如图2，是一典型的凝胶扫描图谱。
利用扫描后的质粒峰与染色体DNA峰的面积比即可计算质粒的拷贝数。
图2 双波长色谱扫描仪扫描凝胶条带的图谱［9］在这一方法中影响测定结果的因素主要有：①加样孔中样品的残留；②染色体DNA对质粒DNA的粘附。
由于染色体DNA比质粒DNA大得多，且非常粘稠，因此它能阻止质粒迁移到特异的位置；③染色与脱色的过程。
其中染色过程的影响不大，因为只要染色时间足够长，染料与DNA的结合就可以达到饱和状态。
脱色过程对双螺旋DNA的影响比对线性DNA的影响要大。
脱色30min后，由于洗去了本底的干扰，荧光的吸收值达到最高，到120min一直维持平台期，之后双螺旋的吸收值明显降低而线性的变化不大；④DNA构象的不同，等量的双螺旋DNA与线性DNA的面积是不相同的，后者大约为前者的1.36倍。
由于以上因素的存在，该方法测定的误差范围是±20%。
Guerrini等认为采用脉冲电场凝胶电泳，可以减少染色体DNA和质粒DNA在琼脂糖基质中的残留，以提高测定结果的准确度。
另外，为减少DNA提取过程中的损失，可用低熔点琼脂糖栓塞法，将细胞去壁后在原位裂解，然后直接进行电泳［10］。
1.3 高效液相色谱（high-pressure liquid chromatography, HPLC）高效液相色谱分析是60年代末70年代初发展起来的一项快速分离分析技术。
用这种方法测定质粒的拷贝数，是通过羟基磷灰石（hydroxylapatite, HPHT）的柱子来实现的。
羟基磷灰石对核酸有较强的吸附力，而对蛋白质、多糖等的吸附力较小，并且核酸的构象不同，吸附力也不同，相对来说，超螺旋的DNA比线性、开环的DNA以及RNA的吸附力都要强。
因此可以用羟基磷灰石对核酸进行分级分离并定量。
HPLC-HPHT法测定质粒的拷贝数只需将全细胞提取物上柱，在一定条件下洗脱，如图3，在两个小箭头之间，是在6 mol/L尿素-0.25 mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)以0.45 ml/min流速的条件下洗脱下来的物质，包括染色体DNA、RNA以及蛋白质。
经0.01 mol/L磷酸钠平衡后，在大箭头处开始梯度洗脱，条件是磷酸钠缓冲液在0.5ml/min流速下，浓度在2分钟内由0.01 mol/L上升为0.4 mol/L。
大约13 min后，质粒被洗脱下来。
因为质粒的浓度与质粒峰的面积成正比，根据已知浓度质粒的标准曲线，就可以确定该质粒的浓度。
应用HPLC-HPHT法进行测定，质粒峰面积的误差为±15%［11］，质粒DNA的回收率为95%左右，并且在纯化的质粒中只残存有少于0.5%的染色体DNA［12］。
一根HPHT 柱大约可以分离200～400个样品。
Genthner［11］用这种方法测定E.coli HB101中的pBR322拷贝数为29，与冷泉港实验室报道的30个相差不大。
图3 采用Bio-Gel HPHT柱分离质粒的洗脱图［11］1.4 毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）毛细管电泳是80年代后期在全世界范围内迅速发展起来的一种分离技术。
毛细管电泳在肽、蛋白质（包括酶和抗体）、核苷酸的分离分析甚至快速序列测定方面都有巨大的潜力，而这种潜力又正好适应了各国在以生物工程、分子生物学等为代表的生命科学各个领域中对各种对象的分离分析和微量制备的迫切要求。