小鼠腹腔巨噬细胞提取方法
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法(超详细~)
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。
实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。
注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。
（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。
（3）固定小鼠，暴露腹腔。
（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。
（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。
（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。
（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。
（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。
（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。
（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。
小鼠腹腔巨噬细胞提取流程
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巨噬细胞提取方法
我是按照经典的方法，注射淀粉肉汤3天后腹腔灌洗得来的，培养3小时除去上清液后纯化了巨噬细胞然后加药的，培养24小时后可以看到细胞已经贴壁了，但是我发现加了LPS的组细胞悬浮的比阴性组多，这个就很奇怪了，我的LPS浓度从10ng一直到20ug/mL都有设置，但是吞噬率无一超过阴性组的。
(1) 小鼠2 ml/只腹腔注射3%巯基乙醇酸钠，三天后颈椎脱臼处死小鼠，用75%乙醇浸湿3 min消毒，置超净台中；(2)用镊子将小鼠下腹部皮肤提起，剪开一个小口，将皮肤撕开，完全暴露腹膜；(3)用镊子提起腹膜，用10ml注射器向小鼠腹腔中注入6ml PBS缓冲液,针尖向上，避开肠和脂肪,反复回抽腹腔液，不同的方向冲洗数次，最后吸出腹腔液；(4)将细胞悬液1000r/min条件下离心10min，用PBS液洗涤l次，用含10%的胎牛血清RPMIl-1640将细胞悬起，台盼蓝染色，当活细胞数达到95%以上时调整细胞浓度至2×106个/ml。
(5)将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，把细胞培养板放置于37℃5%CO2的培养箱中培养3h；(6)3h后取出细胞培养板，清洗1次，去除未贴壁的细胞，弃去上清液，然后每孔加入100mL RPMI-1640完全培养液,此时细胞培养板孔内的贴壁细胞即为纯化以后的小鼠腹腔巨噬细胞。
按照以上述制备和纯化腹腔巨噬细胞方法处理细胞后，200μL/孔加入不同浓度的阳性药LPS，阴性对照孔加200μL培养基，放置于培养箱中，培养24 h后取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗3遍，加0.1%中性红溶液200μL/孔，继续于培养箱中孵育3h。
取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗两遍后加细胞裂解液(醋酸与无水乙醇等体积混合) 200μL/孔，将96孔板放在微型振荡器上振荡10 min后，放在4℃冰箱12h过夜。
将细胞板520 nm 波长处测定吸光度。
按下式计算吞噬中性红增加率%=(给药孔A值一对照孔A值)/对照孔A值×100%。
巨噬细胞原代培养方法步骤
巨噬细胞原代培养方法步骤
1．实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 1ml（勿注
入肠内）。
2．引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。
3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针
头下吸取入针管内。
6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g ，4℃离心10分钟，去
上清，加10 ml Eagle培养基。
7．计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105个细胞细胞，其中90%为巨
噬细胞。
8．为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106个/ml。
9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，
用Eagle液冲洗1-2次后，再加新Eagle培养液置37℃ CO2温箱中培养。
分离巨噬细胞的方法
分离巨噬细胞的方法巨噬细胞是免疫系统中重要的成分之一，其功能是吞噬和消化细菌、病毒、细胞残骸等病原体或异常细胞。
为了研究巨噬细胞的生理和病理功能，科学家需要从体内或体外分离出巨噬细胞。
下面将介绍几种常用的分离巨噬细胞的方法。
1. 腹腔巨噬细胞分离法这是一种常用的方法，适用于小鼠或大鼠的巨噬细胞分离。
首先，用适当的方法将小鼠或大鼠的腹腔打开，将腹腔洗液抽取出来。
洗液中含有大量的巨噬细胞。
然后，将洗液经过离心，将沉淀中的巨噬细胞收集起来。
最后，用适当的培养基培养巨噬细胞，使其继续生长和分化。
2. 骨髓巨噬细胞分离法这种方法适用于从小鼠或大鼠的骨髓中分离巨噬细胞。
首先，将小鼠或大鼠的骨髓从骨骼中取出，并用适当的方法将骨髓细胞洗涤干净。
然后，将洗液经过离心，将沉淀中的骨髓巨噬细胞收集起来。
最后，用适当的培养基培养骨髓巨噬细胞，使其继续生长和分化。
3. 化学法分离巨噬细胞这种方法利用化学试剂的特定性质，使巨噬细胞与其他细胞分离。
例如，可以利用巨噬细胞表面特定的受体，使用特定的抗体标记巨噬细胞，并通过离心或磁珠分离得到纯净的巨噬细胞。
此外，还可以利用化学试剂的特殊性质，如巨噬细胞对特定染料的亲和性，来分离巨噬细胞。
4. 细胞排序分离巨噬细胞细胞排序是一种高级的细胞分离技术，可以根据细胞的特定性质，如大小、形状、表面标记等，将巨噬细胞从混合细胞中分离出来。
这种方法可以高效地分离出纯净的巨噬细胞群体，但设备和技术要求较高。
总结起来，分离巨噬细胞的方法有腹腔巨噬细胞分离法、骨髓巨噬细胞分离法、化学法和细胞排序法。
这些方法各有优缺点，科学家可以根据实验需求选择适合的方法。
通过分离巨噬细胞，科学家可以更好地研究巨噬细胞的生理和病理功能，为疾病的治疗和预防提供理论基础。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
目的:建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离的简便方法,为低强度激光照*对巨噬细胞功能的影响研究提供实验细胞.方法:以无血清的RPMI-1640培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养.采用倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染*计算存活率,瑞氏染*计算纯度.结果:获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征.结论:本法是一种简便实用的分离小鼠腹腔巨噬细胞的方法.
肖丹,XIAODan(第四*医大学*事预防医学系,陕西,西安,710032)。
分离巨噬细胞的方法
分离巨噬细胞的方法分离巨噬细胞是研究巨噬细胞功能和特性的重要步骤。
以下是十种常用的巨噬细胞分离方法，并对每种方法进行详细描述。
1. 腹腔巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠或大鼠。
实验动物首先经过局部消毒，然后腹腔被切开，并用含有PBS和酶的缓冲液灌洗腹腔，酶可包括胰酶或胃蛋白酶。
灌洗液收集并离心，上清液中含有的巨噬细胞可被采集。
2. 骨髓巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠或大鼠的骨髓。
动物被解剖并骨髓被收集，随后经过红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最后巨噬细胞被采集。
3. 足垫巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠。
小鼠足垫被切下，然后用酶解液处理，最终得到含有巨噬细胞的悬液。
4. 肝巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠。
小鼠肝脏被解剖切片，随后用酶解液处理使细胞解离，最后巨噬细胞被离心收集。
5. 肺巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠。
小鼠肺脏被灌洗，利用冰冷的灌洗缓冲液反复灌洗肺组织，然后收集悬液中的巨噬细胞。
6. 脾巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠或大鼠。
动物脾脏被解剖切片，然后用酶解液处理，经过红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最终得到含有巨噬细胞的悬液。
7. 血液巨噬细胞分离法：此方法适用于人或动物。
血液被抽取并用红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最后巨噬细胞被离心收集。
8. 胎盘巨噬细胞分离法：此方法适用于人或动物。
胎盘被解剖并切碎，随后用酶解液处理，经过红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最终得到含有巨噬细胞的悬液。
9. 巨噬细胞树突状细胞混合分离法：此方法适用于人或动物。
细胞混合悬液经过抗体标记和磁珠分离，然后通过磁珠分选系统将巨噬细胞和树突状细胞分离。
10. 巨噬细胞分选细胞器结合法：此方法适用于人或动物。
细胞混合悬液经过抗体标记和细胞器结合分选，利用流式细胞术或显微镜观察巨噬细胞的特定标记，并进行分选。
以上十种方法是常用的分离巨噬细胞的方法，每种方法有其适用范围和特点。
研究人员可以选择合适的方法根据研究需求进行巨噬细胞的分离，以获得纯净的巨噬细胞用于后续的实验和研究。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验
剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪
开一小口(注意避开血管)，用1640灌注腹腔，收集腹
腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，
去上清，沉积细胞用1640离洗一次。最后沉积细胞
用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1-2×106
／ml)。
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（2）白色念珠菌制备 将白色念珠菌接种于沙氏平 皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理 盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去 掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗 涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃ 冰箱保存备用。
四角的大方格，又分为16个中方格，适用于 白细胞计数。中央大方格以双线等分为25个中方格。 每个中方格又分16个小方格，通常我们取四角的4个 中方格和中间的1个中方格来计数红细胞。
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首先用吸管吸取少许稀释后的单细胞悬液，从 盖片端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入， 静置数分钟后，再放在微镜下观察计数。
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3、滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使 用的吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入 的细胞数就相应的少一点。
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血球计数板计数法
血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中 央有两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见 下图），每格面积1mm2，加盖玻片后的深度为 0.1mm。因此，每大方格容积为0.1mm3。
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感谢您的观看！
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（3）吞噬细胞与菌混合培养 取巨噬细胞0.5ml加白色念珠菌悬液0.5ml，置
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操作步骤
一、将小鼠以颈椎脱臼法处死，仰卧，固定四肢。
二、依次用碘酒及酒精棉球消毒腹部，以镊子提取腹壁，剪去小块皮肤，继以镊子提取腹腔。
剪一小口，以注射器注入少量冲洗液。
用滴管吸出，再注入冲洗液并吸出，滴管在腹腔内各个位置吸取液体，冲洗每只小鼠腹腔约5ml。
三、将腹腔细胞悬液滴于干净载玻片上，置37度湿盒内，1-2小时后倾去玻片上的液体，
并用腹腔冲洗液轻洗玻片，即可见玻片上有毛玻璃样的单层巨噬细胞粘附，巨噬细胞含量可达90%
四、在显微镜下计算巨噬细胞的百分比，检测分离结果。
小鼠腹腔巨噬细胞的提取与鉴别方法探讨。