小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法(超详细~)
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。
实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。
注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。
（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。
（3）固定小鼠，暴露腹腔。
（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。
（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。
（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。
（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。
（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。
（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。
（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。
巨噬细胞小鼠实验报告
一、实验目的1. 观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。
2. 研究巨噬细胞在小鼠非特异性免疫中的作用。
3. 探讨不同刺激条件下巨噬细胞吞噬功能的变化。
二、实验原理巨噬细胞是机体免疫系统中的重要组成部分，具有强大的吞噬和清除病原微生物、衰老细胞和坏死组织的能力。
吞噬作用是巨噬细胞识别、结合并摄取病原微生物或异物的重要机制。
本实验通过观察小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用，评估其吞噬功能。
三、实验材料与试剂1. 实验动物：6-8周龄健康小白鼠。
2. 实验试剂：鸡红细胞悬液、无菌生理盐水、冷亚甲蓝染色液、甲醇、橄榄油等。
3. 实验仪器：显微镜、离心机、恒温水浴箱、计时器等。
四、实验方法1. 实验分组：将小白鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。
2. 实验操作：（1）实验组：每只小鼠腹腔注射1ml鸡红细胞悬液，对照组腹腔注射1ml无菌生理盐水。
（2）注射后30分钟，将小鼠处死，无菌操作取出腹腔液。
（3）将腹腔液离心，弃去上清液，加入适量冷亚甲蓝染色液，混匀后制片。
（4）显微镜下观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况。
3. 数据统计：计算吞噬鸡红细胞的巨噬细胞百分比和吞噬指数。
五、实验结果1. 实验组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的百分比和吞噬指数均显著高于对照组（P<0.05）。
2. 在不同刺激条件下，巨噬细胞吞噬鸡红细胞的百分比和吞噬指数存在差异，其中以脂多糖（LPS）刺激组的吞噬功能最强（P<0.05）。
六、实验分析1. 实验结果表明，小鼠腹腔巨噬细胞具有吞噬鸡红细胞的能力，且吞噬功能受到LPS等刺激因素的影响。
2. 巨噬细胞在小鼠非特异性免疫中发挥重要作用，其吞噬功能与机体抵抗力密切相关。
3. 本实验为研究巨噬细胞在免疫调节中的作用提供了实验依据。
七、实验讨论1. 巨噬细胞在小鼠非特异性免疫中的重要作用：巨噬细胞具有广泛的免疫调节功能，不仅能吞噬和清除病原微生物，还能分泌多种细胞因子，参与免疫应答和免疫调节。
巨噬细胞的实验报告
一、实验目的1. 了解巨噬细胞的基本生物学特性；2. 掌握巨噬细胞吞噬功能实验的操作方法；3. 分析巨噬细胞吞噬功能的影响因素。
二、实验原理巨噬细胞是免疫系统中的一种重要细胞，具有吞噬、清除病原体、分泌细胞因子等生物学功能。
本实验通过观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用，评估巨噬细胞的吞噬功能。
三、实验材料与试剂1. 实验动物：小鼠；2. 实验试剂：鸡红细胞、生理盐水、冷亚甲蓝染色液、培养皿、显微镜、移液器等。
四、实验方法1. 实验动物处理：取健康小鼠，腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导腹腔巨噬细胞产生。
2. 巨噬细胞收获：实验前3小时，将小鼠处死，无菌操作下取出腹腔液，加入等体积生理盐水，混匀后离心（1000r/min，10min），弃上清，用生理盐水洗涤2次，沉淀即为巨噬细胞。
3. 巨噬细胞吞噬实验：将收获的巨噬细胞加入培养皿中，加入适量鸡红细胞，37℃培养1小时。
4. 巨噬细胞染色：将培养好的巨噬细胞加入冷亚甲蓝染色液，染色5分钟。
5. 巨噬细胞观察：用显微镜观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，计算吞噬百分率和吞噬指数。
五、实验结果与分析1. 实验结果：显微镜下观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，部分鸡红细胞被吞噬细胞包裹。
2. 实验分析：（1）吞噬百分率：吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100%；（2）吞噬指数：吞噬的鸡红细胞总数/吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。
六、实验结论本实验成功观察到了巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，说明巨噬细胞具有吞噬功能。
吞噬百分率和吞噬指数可以作为评估巨噬细胞吞噬功能的重要指标。
七、实验讨论1. 巨噬细胞在免疫系统中具有重要作用，吞噬功能是其重要生物学特性之一。
2. 本实验采用腹腔巨噬细胞，操作简便，结果可靠。
3. 影响巨噬细胞吞噬功能的主要因素包括：巨噬细胞的来源、成熟度、环境因素等。
4. 本实验为后续研究巨噬细胞吞噬功能的影响因素提供了基础。
八、实验总结本实验通过观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，成功评估了巨噬细胞的吞噬功能。
小鼠巨噬细胞实验报告
小鼠巨噬细胞实验报告实验报告: 小鼠巨噬细胞实验引言：巨噬细胞是免疫系统中重要的细胞类型，对于清除细菌、病毒和其他病原体起着关键作用。
小鼠巨噬细胞是研究人类巨噬细胞功能的理想模型。
本实验旨在通过培养小鼠巨噬细胞并观察其对厌氧菌的吞噬作用，以了解巨噬细胞的基本功能。
材料与方法：1. 材料：- 小鼠巨噬细胞株- 营养物质适配的培养基- 96孔板- 厌氧菌培养物- 杀菌剂- 显微镜2. 方法：1）培养小鼠巨噬细胞：将小鼠巨噬细胞接种在含有营养物质适配的培养基的96孔板中，放置在37C的恒温培养箱中培养至细胞数量达到适当密度。
2）准备厌氧菌培养物：将厌氧菌培养到适当的浓度，用杀菌剂杀死细菌并洗涤，以适当浓度悬浮于无菌PBS中。
3）观察吞噬作用：将适量的小鼠巨噬细胞加入96孔板的每个孔中，再加入适量的厌氧菌悬液。
孔板放置在37C的恒温培养箱中培养一定时间后，取出样品，在显微镜下观察吞噬作用。
结果：在观察过程中，我们发现小鼠巨噬细胞对厌氧菌表现出了明显的吞噬作用。
在将小鼠巨噬细胞与厌氧菌接触后，许多巨噬细胞出现了吞噬现象。
巨噬细胞将厌氧菌囊泡化并向细胞内融合，形成吞噬体。
在吞噬体形成后，巨噬细胞进一步进行吞噬作用，并最终将吞噬的厌氧菌消化。
讨论：巨噬细胞的吞噬作用是通过细胞表面的受体与目标物质结合，并通过胞吞作用将其摄入细胞内。
在本实验中，巨噬细胞通过与厌氧菌表面的分子结合，形成吞噬体。
吞噬体进一步与溶酶体融合，释放酸性溶液，将厌氧菌降解并消化。
小鼠巨噬细胞的吞噬作用是免疫系统抵抗病原体入侵的重要机制之一。
吞噬作用不仅消除了细菌等病原体，还能迅速调动其他免疫细胞参与免疫防御。
此外，巨噬细胞还能产生和释放多种细胞因子，调节和激活其他免疫细胞，如淋巴细胞等。
然而，需要注意的是，吞噬作用可能受到多种因素的影响，如细胞状态、病原体类型和数量等。
在实验中，我们观察到的吞噬作用是基于体外条件下的实验模型，因此无法完全代表体内情况。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验
2、菌和细胞在摇床中作用的时间不超过30 min，如果在 37C 条件下作用时间过长，被吞噬的菌很快会被裂解， 也就不能计数为吞噬了菌的细胞。
3、滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定，如果使用的 吞噬细胞是细胞系，细胞体积较大，那么加入的细胞 数就相应的少一点。
血球计数板计数法
血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有 两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见下图）， 每格面积1mm2，加盖玻片后的深度为0.1mm。因此， 每大方格容积为0.1mm3。
计数时，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上 线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。 计数应重复3次，取其平均值。
数完毕后，依下式计算： 每1mL白细胞悬液细胞数＝（4个中方格细胞总数 /4） ×104× 稀释倍数
每1mL红细胞悬液细胞数＝（80个小方格细胞总数 /80） ×400×104× 稀释倍数
（2）白色念珠菌制备 将白色念珠菌接种于沙氏平皿 培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水 配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清， 再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用 生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。
（3）吞噬细胞与菌混合培养 取巨噬细胞0.5ml加白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃
实验时眼球放血、断椎处死小鼠，新洁尔灭浸泡5分钟。 剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一
小口(注意避开血管)，用1640灌注腹腔，收集腹腔液于 试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清， 沉积细胞用1640离洗一次。最后沉积细胞用含10％小 牛血清1640配成适当浓度备用(1-2×106／ml)。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验
巨噬细胞原代培养方法步骤
巨噬细胞原代培养方法步骤
1．实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 1ml（勿注
入肠内）。
2．引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。
3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针
头下吸取入针管内。
6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g ，4℃离心10分钟，去
上清，加10 ml Eagle培养基。
7．计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105个细胞细胞，其中90%为巨
噬细胞。
8．为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106个/ml。
9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，
用Eagle液冲洗1-2次后，再加新Eagle培养液置37℃ CO2温箱中培养。
五年制免疫实验课 腹腔巨噬细胞吞噬试验
２. ADCC作用杀伤靶细胞。
形态学检测方法 同位素释放法 酶释放法
抗体依赖细胞介导的细胞毒试验（ADCC）
ADCC反应是由多种不同效应细胞群介导的 杀伤性效应机制之一。
NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞具有杀伤作 用。
观察靶细胞被破坏的程度，用来判断它们的 细胞毒性。
补体依赖的细胞毒试验（CDC）
实验原理： 细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,3或IgM)
用40倍镜查找观察100个巨噬细胞，计数其中未 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数、吞噬了鸡红细胞的巨 噬细胞数及被吞噬的鸡红细胞数，计算吞噬百分率 及吞噬指数。 吞噬百分率: 有吞噬作用的巨噬细胞数／100×100％ 吞噬指数:
有吞噬作用的巨噬细胞吞入的鸡红细胞总数／ 100
抗体依赖细胞介导的细胞毒试验（ADCC） 补体依赖的细胞毒试验（CDC） 细胞介导的细胞毒试验 NK细胞介导的细胞毒试验
生理盐水
1瓶
苦味酸
1瓶
• 器材（每组）
• 1ml注射器
1个
• 玻片（载玻片/盖玻片） 4片
• 1ml微量加样器
1支
• 200ul微量加样器 1支
• tips
若干
• 1.5mlEP管
2个Biblioteka • 剪刀、镊子1套
• 显微镜 • 温箱
1. 实验前2天，给小鼠腹腔注射5％淀粉溶液１ml（已完成）。 2. 用1毫升注射器给小鼠腹腔注射3％鸡红细胞悬液0.5ml，用
若干
• 剪刀、镊子、解剖盘 1套
• 显微镜
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养一、引言巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，可以通过吞噬微生物、吸收细胞碎片等功能来保护机体免受外来侵害。
近年来越来越多的研究者将目光投向了巨噬细胞的研究领域，例如探究其功能调控、对特定疾病的影响等。
因此，了解如何分离和培养小鼠腹腔巨噬细胞是非常重要的。
二、实验材料1.小鼠（BALB/c或C57BL/6等品系）2.70%乙醇3.磷酸盐缓冲液（PBS）4.腺苷酸二钠（ADT）5.玻璃钝刀6.吹瓶（20ml）7.离心管（50ml）8.腹腔灌注针头9.离心机10.培养皿11.消化液（十氟化十六烷、胰酶混合液等）12.FBS（fetal bovine serum）13.RPMI-1640培养基14.静菌枪、离心管、显微镜等三、实验步骤1.准备工作选用2~3个月龄（约20g体重），性别未限制的小鼠，放至3-4人一笼中，在恒定温度（22-24℃）、湿度（40-60%）下，24小时自由进食饮水，减轻其压力。
实验前，将所需物品全部准备好，消毒好所需器材。
消毒方式可以选择用70%的乙醇喷震或者紫外线照射15min等方式进行消毒，确保实验平凡洁净。
2.腹腔巨噬细胞的分离（1）小鼠腹腔巨噬细胞的处理将麻醉过的小鼠放于消毒好的操作台上，用70%乙醇消毒好腹部，剖开腹腔，将肝、脾、小肠等剔除，留下含有腹腔巨噬细胞（PC）的腹腔。
用离心管接住腹腔内的生理盐水，加1mM ADT处理吸入至腹腔中，轻摇腹腔5分钟，将其取出至消化液中，消化液中加入0.2%的凯西酶和50ug/mL的DNA酶，然后用13g钩头灌注针将其搅拌并吸入管内灌注30分钟，在摇床上50转/分钟恒温摇晃1h。
将腹腔液收集到离心管内离心，离心350g 20分钟，去除上清流体，重悬沉淀细胞于PBS液中。
（2）巨噬细胞的筛选将离心沉淀细胞的上清液放在吹瓶中，吹出细胞液，离心25min后，去掉上清，用PBS液中悬浮细胞过滤到细胞培养皿70%PMI-1640中化为单细胞。
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小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
步骤
一、实验材料准备
1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。
2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。
碘酒绵球和酒精绵球。
3. 器械：一次性注射器、手术器械。
二、实验方法
如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。
不采用刺激物，直接开始下面的步骤。
1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。
用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用
酒精绵球消毒腹部肌层。
2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。
3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。
台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。
4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。
三、结果
巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。
巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。
注意
1. 巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖。
2. 很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。
3. 严格无菌操作，在超净台内进行。
4. 为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器。
5. 吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。
巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。
巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。