Comet Assay
Comet Assay 彗星分析系统软件功能:彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。
测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。
具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染色系统的分析系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。
以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。
在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。
这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。
尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。
2.检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。
这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。
超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。
当加入嵌入剂溴乙锭时，负超螺旋松散，环状结构从类核核心伸展开来，形成一个晕圈。
同样，用电离辐射来破坏环状结构时可发现相似的效应，单链断裂就足以使超螺旋松散。
彗星试验最常用的形式是细胞被包埋于琼脂糖中后，用去污剂和浓盐溶解，这样DNA就被固定，用于继后的电泳。
彗星试验最早由Ostling 和Johanson阐述，他们参考Cook 等的类核模型，用松散的超螺旋的DNA对彗星尾巴加以描述，事实上，彗星尾巴可被简单的看作被电场拉向一边的晕圈。
Ostling 和Johanson采用低于10的PH值。
值得一提的是，尽管我们现在采用最多的是碱性SCGE,但对于检测单链断裂，并不需要在高PH下进行。
2.2常用的彗星试验形式2.2.1碱性单细胞凝胶电泳Ostling 和Johanson的试验方法并没有被广泛采用。
几年以后，两个研究组独立的提出了包括在高PH 下处理的方法，Singh等在PH为10的情况下用2.5M Na Cl、Triton-100和十二烷基肌氨酸钠溶解细胞1h，然后用碱(0.3M NaOH)处理，在高PH（>13）的情况下电泳。
Olive等在电泳前用弱碱(0.03M NaOH)溶解细胞1h。
于是, 彗星试验被看作是和碱性解旋、碱性洗脱、碱性蔗糖沉降同类，为了把DNA断裂暴露出来，都必需用碱性变性来把DNA双链同DNA断链区分开来。
用碱是使彗星尾巴更显著，在不影响其灵敏度的情况下提高检测的分辨率。
Ostl ing 和Johanson利用这种方法，检测了从1Gy 到3 Gy之间的电离辐射的效应, Singh等报告在0.25到3 Gy 范围内彗星尾长增加。
2.2.2中性单细胞凝胶电泳在上述方法发现后，用中性方法检测低水平DNA断裂能力的另外一种方法被提出。
在一段时间的碱性处理后，恢复条件至中性后再电泳。
这一改变降低了其敏感性，扩宽了其应用范围，但仍用于检测单链断裂。
为了能排除单链断裂的干扰方便的检测双链断裂，Olive等提出了一种完全不同的中性彗星试验。
他们的方法采用了在50℃的琼脂糖长时间处理溶解细胞，在这种情况下核基质可能被破坏，从而真正的观察DNA双链断片（或这些断片的游离末端）。
2.2.3对损伤特异酶类的使用检测DNA断链只能给出有限的信息。
一些损伤剂可能直接引起DNA断裂，但通常它们会很快重新连接起来。
事实上它们可能只是脱嘌呤/脱嘧啶位点（即AP 位点或无碱基糖），因其在碱性条件下不稳定，所以看似断片。
他们也可能是细胞内修复的中间产物。
因为核苷酸和碱基切除修复过程都是切掉损伤并用正确的碱基予以替换。
为了在提高灵敏度的同时提高特异度，我们介绍了用可产生特定损伤或断裂的酶来消化类核的额外步骤。
因此,核酸内切酶Ⅲ用于检测氧化的嘧啶，甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶（FDG）用于检测主要的嘌呤氧化产物8- 羟基鸟嘌呤和其它改变了的嘌呤,T4核酸内切酶V用于识别UV诱导的环丁烷嘧啶二聚体，Alk A在3-甲基腺嘌呤端切割DNA。
上述实例中，DNA断裂频率增加则彗星尾部强度增加。
在过氧化氢处理过或加有光敏剂用可见光处理过的细胞中，用核酸内切酶Ⅲ或F DG很容易检测出氧化碱基。
这种氧化的碱基在正常人淋巴细胞中也有一定数量的发现。
2.3 不太常用的彗星试验形式2.3.1 5溴-2脱氧尿苷标记检测复制DNA和DNA复制有关的DNA断裂将使彗星尾长增加，然而，用这种方法不可能辨别出S期和非S期细胞——可能是因为在某一时间参与复制的DNA数目极少，或因为复制装置用某种方法稳定复制叉，使这种断裂和正常的损伤断裂不同。
如果在复制期间用5溴-2脱氧尿苷（BDdR）来标记细胞，然后用抗5溴-2脱氧尿苷抗体显色，可观察到带有标记的彗尾，后5溴-2-脱氧尿苷标记期间DNA复制的成熟导致标记物质重新进入头部。
2.3.2 检测DNA修复的中间物有的断裂可看作UV诱导损伤或大块加合物时核苷酸切除修复的中间物，此种断裂通常是短命的——至少在增殖细胞中是如此。
把UV照射的细胞和DNA合成抑制剂羟基脲、阿糖胞苷或阿非迪霉素一起培养，将阻断断片的修复合成，引起剪切断裂的积累，这就提供了一个检测损伤的敏感方法。
（在非分裂细胞如外周血淋巴细胞，剪切裂口在没有抑制剂时也能积累，因为其再联接的速率受三磷酸脱氧核苷供应不足的限制）。
2.3.3 荧光原位杂交彗星试验彗星的出现反映出细胞内DNA损伤的总体情况。
它对特殊染色体或染色体区域的定位及区分彗星内DNA或特殊基因的种类非常有用。
荧光原位杂交（FISH）通常用cDNA或寡聚核苷酸探针识别目的基因的序列而达到此目的，但要同包埋在正常杂交温度下溶解的琼脂糖中有彗星微细结构的DNA杂交，还存在技术困难。
目前这些问题已经解决，用它来识别特殊染色体的DNA、端粒DNA、着丝粒DNA和单拷贝基因已成为可能。
目前用这种方法很少能出现有用的信息（尽管图象很漂亮），但还是很有前途的。
例如，它可以用于检测低剂量DNA损伤剂处理后特殊基因的修复速度。
2.4 彗星试验能检测凋亡吗？当几乎所有的DNA都在彗星尾部，就使彗星的头部变小，可以把其想象成一个环状彗星。
因为某些原因，有人认为环状彗星代表凋亡细胞。
当然，一些损伤相对严重的细胞将经过程序性细胞死亡是完全可能的，但不能被描述成凋亡，有两个理由：l凋亡是不可逆的，但显示为环状彗星的受损细胞可修复它们的损伤，使环状消失。
l凋亡的特征是DNA断片变为核小体寡聚体大小，这些小片段DNA 在溶解或电泳过程中肯定会消失；有时可能看见极少正常DNA荧光的彗星残影，可能代表凋亡细胞中的高分子量 DNA残影.最近Singh提出一个观察凋亡细胞的方法，和普通彗星试验一样，把细胞包埋入琼脂糖并溶解，然后并没有电泳，而用乙醇沉淀DNA来替代。
已知的凋亡诱导剂处理过的细胞显示出粒状DNA的晕圈和模糊的外边界，如同扩散的小片段显示的一样。
2.5 在彗星试验中AP位点是否可被看作DNA断裂？AP位点在碱性环境中不稳定，但我们通常在碱性SCGE中所用的PH和处理时间足以使它们一部分或全部断裂吗？实验表明，与采用0.03M NaOH相比，采用强碱（0.3M NaOH）能使更多的AP位点断裂，并可部分解释较温和的碱性方法较低的灵敏度，但PH不是唯一的变量，所以很难进行方法之间的直接比较。
用AP核酸内切酶来解释这个问题是可能的；在特殊的PH条件下，用已知能诱导DNA碱基丢失的试剂处理细胞后，用AP核酸内切酶消化类核能使断裂增加吗？然而，AP核酸内切酶经常和去除特殊损伤碱基提供AP底物的转葡糖基化酶有关连，也存在着非特异性污染核酶活性的可能性,所以给出一个明确的答案非常困难。
用甲基甲磺酸盐处理蚕豆属faba根尖细胞的试验表明有一些AP核酸内切酶敏感位点在强碱（0.3M NaOH）条件下并未断裂。
3. 彗星的定量3.1 观察彗星用DNA结合染料染色后，在荧光显微镜下可观察DNA，溴乙锭（EB）最为常用，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）次之。
EB是一种嵌入型染料，与DNA单链相比，能更有效的结合DNA双链。
DAPI能与DN A双螺旋主沟结合，荧光强度视双链结构而定。
碱处理时DNA链分开，即使头部完整的超螺旋在中和时易于复性，但至少DNA尾部将会彻底的变为单链。
用吖啶橙（AO）染色更肯定这一点。
AO使单链核酸呈现红色荧光，使双链DNA呈现黄/绿色荧光。
我们发现用AO染色会产生红色的彗星尾巴和明显的黄/绿色彗星头。
那么我们用EB和DAPI可以观察到什么呢？起码和DNA 双链相比，DNA单链的强度要小一些，所以，尾部DNA所占的百分比越高，整个彗星所能检测出的荧光就越少。
我们用DAPI测量过，发现总荧光量几乎未减少（Fig.1）。
对从被更为有效染色的DNA双链中去掉的头部中被浓密包裹的DNA来说，或许有一种偶然的代偿和荧光的自淬灭。
无论是什么原因，我们都可以从彗星中获得更多的信息。
总荧光量反映出DNA含量，与G1期细胞相比，G2期细胞能使彗星荧光量增加。
因此，细胞群中每个彗星的损伤水平可以和细胞周期联系起来。
实际上,彗星实验和流式细胞仪一样，均和DNA含量有关。
3.2 彗星测量：图象分析有很多能计算彗星荧光参数的软件包可供选择。
最重要的参数是尾长，头尾光密度比（通常以尾部DNA所占百分比表示）和尾矩。
尾长非常有用，因其只在相对低的损伤水平增加。
随后损伤剂量增加时，尾部光密度增加，而尾长不变。
因尾部的终点由设定的超出背景的荧光值决定，所以尾长也对图象分析系统所设定的背景或阈值很敏感。
相对来说，尾部光密度是最为有用的参数，因其与损伤频率成线性关系，受阈值设定的影响较小，并在最大范围内分辨损伤（理论上，尾部DNA从0%-100%）。
遗传毒性试验
遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。
根据检测的遗传学终点分为4种类型:1检测基因突变（比如：Ames试验）;2检测染色体畸变（比如：微核试验）;3检测染色体组畸变（比如：体外CHL细胞染色体畸变、精原细胞染色体畸变试验）;4检测DNA原始损伤（比如：单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)）。
以上检测结果为呈阳性（除外假阳性）的化合物，为潜在人类致癌剂和/或致突变的物质。
FDA于2006年制定了遗传毒性试验结果的综合分析法指导原则（Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachestointegrationofgenetict oxicologystudyresults）对遗传毒性试验的阳性结果评价和处理：ICHS2（R1）中的遗传毒性结果评价和追加试验策略。
目前已建立的遗传毒性短期检测法已超过200种。
1 现行组合试验方案，用一组试验配套进行试验。
200多种检测方法中,真正经过验证有合适灵敏度和特异度的大概不到10种。
目前多数国家规定,如体内诱变试验显示1个或以上试验呈阳性结果,则需要进行生殖细胞遗传毒性测试。
2 各类遗传毒性试验方法的研究进展2.1 检测基因突变2.1.1 Ames试验Ames试验是检测化学物质基因突变的常用方法。
常规的Ames试验选用四个测试菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535测试菌株,该菌株特别适用于检测混合物的致突变性。
目前出现的新生菌株具有更高的敏感性和特异性,如YG7014、TG7108,缺乏编码O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的ogtST基因,专用于对烷化剂引起的DNA损伤检测;引入乙酰转移酶基因的YG1024、YG1029菌株,对硝基芳烃和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上[4]。
测试代谢活化系统一般采用由Aro-clor1254(PCBs)诱导大鼠肝微粒体酶的S9;国外也有用人肝S9的报道,试验证明其代谢活性明显高于鼠S9[5,6]。
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）说明书
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书一 单细胞凝胶电泳实验介绍单细胞凝胶电泳( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 又名彗星试验(comet assay)， 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复，具有方法灵敏、快速优点，同时既可以定性又可以定量，目前DNA 损伤检测的其他方法（Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法）是无法比拟的。
彗星实验是检测DNA 微损伤和修复的新方法，得到国际遗传毒性检测程序工作会议认可。
彗星实验是简单、快捷检测DNA 微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。
是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。
彗星实验具有以下优点：1 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T 和B 淋巴细胞敏感；2 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；3 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；4 安全性好，避免了同位素的使用；5 在单细胞水平上对DNA 损伤进行可视性检测；6 准确性好、灵敏度高；7 属于新技术，客观实际，国际遗传毒性学术委员会认可。
二、试剂盒组成（见试剂盒内）三、试剂使用说明（见试剂盒内）四、操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5个/ml。
2.铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。
3.第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。
也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。
4.第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。
1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
comet assay
准备工作处理细胞将细胞用CPT处理1h作为损伤条件，阴性对照组不进行CPT处理，阳性对照组处理后换上新的培养基作为损伤组，分别取修复8h和修复12h的时候收细胞，细胞计数一铺胶1 基底胶1%normal琼脂糖煮沸之后放在同样煮沸的热水里，倒在专用小盒里，载玻片放在里边蘸一下，用擦镜纸擦去下层胶，放桌上晾一小会儿。
（注意保持桌面清洁）放烘箱里65℃~75℃烘5分钟（放试管架上放进去烘很方便）。
第二层基底胶在65℃恒温槽上加，每一个在玻片的一端加160ul基底胶，轻轻盖一层盖玻片，从左往右，不要有气泡。
放的时候在旁边露出一端盖玻片，方便抽去盖玻片，之后放湿盒里保存一会儿。
2 低熔点胶0.5%低熔点琼脂糖（1%很少用）第一层低熔点胶：每个板铺2*105细胞，trypsin消化（除hela外trypsin都用PBS稀释一倍）后，DMEM中和，PBS吹起来，稀释到2*106个，保证每板加10ul左右体积的细胞，加入120ul的低熔点胶。
低熔点胶事先用微波炉微微沸腾，不要过于沸腾。
在42度恒温水浴中保存，混匀低熔点胶和细胞的过程也在恒温水浴42℃中进行。
将盖玻片用镊子轻轻推一下，由写字边轻轻盖上一层盖玻片。
放在冰上—-----冰上放铝锭。
第二层低熔点胶轻轻推开盖玻片，加120ul低熔点胶。
放盖玻片。
写字的地方用透明胶粘好，字不易掉二裂解揭开盖玻片，放进裂解液中裂解2.5h，裂解液加入fresh的1%triton，三解旋电泳槽中放comet assay的running buffer 泡20min四电泳300mA 24V 电泳20min 上边用盖玻片盖住，并且上边加一个固定的压住，如果电压小了，就往外吸一吸电泳液五中和六染色暗室中的EB小盒，用新鲜EB，轻轻泡胶20min。
泡的时候注意看一下胶还在不在七洗PBS洗一小下八楼下细胞间2照相，绿光，手动，分辨率最大frame 选第二个。
单细胞琼脂糖凝胶电泳(comet assay)修订版
单细胞琼脂糖凝胶电泳（comet assay）Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)步骤：一、细胞悬液的制备：1.吸弃旧培养基，D-Hanks冲洗2遍2.0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，使成细胞悬液，加入离心管，1000rpm，离心10min，弃上清，以1mlD-Hanks悬浮细胞，以上应在暗室及较低温度下进行。
各组收集细胞2~3×106个，必须分散成单个。
悬浮于1mlPh7.4PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。
二、玻片制备：1. 玻片磨砂。
2. 制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。
用pH7.4 PBS 配制。
称0.1g溶于20mlPBS，如NMA与玻片附着不紧，可升高其浓度至0.65%。
铺第一层胶：0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温>5min使其固化，即为第一层胶；第二层胶：37℃0.5%LMPA 100μl+30-50μl（1-2x106）细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱>5min，使其固化。
* 余下的细胞1000g×10min离心，于0.1-0.2ml悬浮缓冲液中混匀，做Western-blot。
三、细胞溶解：1. 玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，4℃>1小时或过夜。
玻片在细胞消化液中可至少存放4周。
细胞溶解液配制NaCl 146.1 gNa2EDTA 37.2 gTris base 1.2 g用约12克NaOH调节pH至10。
用去离子水定容至890ml。
过滤除菌，为贮备液。
室温保存。
应用液加入Triton X-100 至1%DMSO 至10%（消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基）应用前冷藏30~60分钟。
4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。
彗星电泳
每片滴加60ulPI( 5ug/ml) 染色20min.用蒸馏水 洗一下即可观察。
取出玻片放于无Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，吸
水纸吸干； 每片载玻片上加60μl 2μg/ml PI染色15min， 蒸馏水冲洗盖玻片观察并拍照（Olympus荧光显 微镜绿色激发光下观察）；
用casp. exe软件分析细胞拖尾变化
思考题
彗星实验的原理？ 彗星实验的评价方法？
步骤
γ射线照射细胞后，分别于照射后0h，30’， 1h，2h，4h收集细胞并做细胞计数，以 适量PBS重悬细胞；
胶片制备
取100 ul 用微波炉熔解的 1%正常熔点琼脂糖(NMA)滴 在预热的(45℃~70℃)磨砂载玻片上，迅速盖上干净的 盖玻片，4℃ 15分钟，(第一层) 将琼脂糖凝固后，取下盖玻片。将细胞悬液（约3000 个cell/片）与180ul0.65%低熔点琼脂糖溶液在37℃混 匀后，取一半液体滴在第一层的琼脂糖上（2个/载）， 盖上盖玻片，4℃，15min.( 第二层越薄越好，使细胞 尽量在一个平面上) 取下盖玻片，在第二层上滴加60ul0.65%低熔点琼脂糖， 4℃，15min。（第三层）
彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤
目的
掌握彗星电泳的原理 熟悉彗星电泳的操作方法 掌握彗星电泳的评价方法
原理
单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis， SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出后又经 Singh N P和Olive P I进一步完善的一种在单细胞水 平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状 颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。它是一种 测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传 统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需 放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广 泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的 DNA损伤和修复的研究 。
彗星电泳法检测细胞凋亡原理
彗星电泳法检测细胞凋亡原理细胞凋亡是细胞生命周期中的一种自然过程，也是一种重要的细胞死亡方式。
在细胞凋亡过程中，细胞内会发生一系列的形态和生化变化，如细胞核染色质凝聚、细胞核碎裂、胞质内溶酶体释放等，这些变化是细胞凋亡的特征。
彗星电泳法（Comet Assay）是一种常用的细胞凋亡检测方法，它可以通过检测DNA断裂来判断细胞是否发生凋亡。
这种方法以细胞的DNA为基础，通过电泳的方式使DNA在凝胶上产生“彗星尾巴”状的形态，从而判断细胞凋亡的发生程度。
彗星电泳法的原理是利用DNA在电场作用下的迁移能力差异来检测细胞凋亡。
首先，将待检测的细胞经过相应处理，如破碎细胞膜、去除核膜等，使细胞内的DNA暴露在外。
然后，将处理后的细胞混合在低熔点琼脂糖中，制备成凝胶。
接下来，将凝胶浸泡在含有碱性溶液的电泳缓冲液中，形成电泳系统。
在电场的作用下，DNA 会向阳极移动，形成“彗星尾巴”状。
最后，通过染色和显微镜观察，可以看到DNA的形态变化，进而判断细胞凋亡的程度。
彗星电泳法的检测结果可以通过计算尾长、尾百分比、尾状因子等参数来评估细胞凋亡的程度。
尾长是指从头部到尾部的距离，尾百分比是指尾部长度占总长度的百分比，尾状因子是尾长与头部直径的比值。
通过对这些参数的测量和分析，可以得出细胞凋亡的程度和类型。
彗星电泳法具有灵敏性高、操作简便、结果直观等优点，因此被广泛应用于细胞凋亡的研究和药物筛选等领域。
它可以帮助科研人员更好地理解细胞凋亡的机制，以及评估药物对细胞凋亡的影响。
此外，彗星电泳法还可以用于毒理学研究、环境污染监测等方面。
彗星电泳法作为一种常用的细胞凋亡检测方法，通过检测DNA断裂来判断细胞凋亡的发生程度。
它具有操作简便、结果直观等优点，并被广泛应用于细胞凋亡研究和药物筛选等领域。
通过彗星电泳法的应用，科研人员可以更好地理解细胞凋亡的机制，为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
dna损伤修复检测指标
dna损伤修复检测指标DNA损伤修复检测是评估细胞对DNA损伤的应对能力的一种方法。
DNA损伤可以由各种因素引起，包括紫外线辐射、化学物质暴露、放射线和内源性代谢产物。
细胞通过一系列的DNA损伤修复机制来维护基因组的完整性。
以下是一些用于评估DNA损伤修复的常见检测指标：1. 细胞周期检测：•检测细胞周期的改变可以指示DNA损伤修复的发生。
损伤修复通常发生在细胞周期的G1、S和G2阶段。
2. γ-H2AX：•γ-H2AX（磷酸化的组蛋白H2AX）是DNA双链断裂的标志物。
它在DNA受到损伤时会磷酸化，并形成微小的核斑点。
通过检测γ-H2AX的表达水平，可以评估DNA损伤的程度。
3. 单细胞凝胶电泳（Comet Assay）：• Comet Assay是一种常用于评估DNA单链和双链断裂的方法。
它通过观察细胞在电场中的移动形成comet状的图像来定量评估DNA 损伤。
4. DNA损伤修复蛋白的表达：•检测DNA损伤修复相关蛋白，如ATM、ATR、BRCA1、BRCA2等的表达水平，可以提供有关DNA损伤修复机制活性的信息。
5. 细胞生存分析：•通过暴露细胞于DNA损伤剂后观察其生存率，可以评估细胞对DNA损伤的修复能力。
6. 尿中DNA损伤标志物：•某些DNA损伤产生的代谢产物可以在尿液中检测，如8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHdG），这可以作为DNA氧化损伤的指标。
7. 细胞自动修复功能检测：•通过测定细胞对DNA损伤的自动修复功能，可以更全面地了解细胞对DNA损伤的整体反应。
这些检测方法的选择通常取决于研究的具体目的以及可用的实验条件。
DNA损伤修复的评估有助于深入了解细胞的应对机制，对于理解癌症的发生和发展、药物筛选和治疗方案的制定等方面具有重要意义。
单细胞凝胶电泳
二、实验流程
采用碱性SCGE，其基本操作过程包括：
1.细胞制取
• 取处于对数生长期的Hela细胞，吹 打为单细胞悬液，用PBS调节细胞密 度为105-106 个/ml。
2.细胞染毒
• 染毒组：取1ml细胞悬液加入10-3 M H2O2 溶液50μl ，混匀，37℃ 水浴30min； • 阴性对照组：取1ml细胞悬液加入50μl PBS缓冲液，同等条件下水浴30min。
• 经碱处理和在碱性电解质的作用后，DNA 解旋，损伤的DNA断链及其片段会被释放 出来，而在电泳条件下， DNA片段可进入 凝胶孔隙发生迁移。由于这些DNA分子量 很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向 正极移动，形成彗星状的图像。 • 在一定条件下，DNA迁移距离和DNA含量分 布与DNA损伤程度呈线性相关。随着DNA损 伤程度加剧，断片数目增加，表现为尾部 DNA含量增加，彗尾延长，荧光强度加强。
3.制片
• 第一层胶：在完全磨毛的载玻片上 铺180μL质量分数为 1%的正常熔点 琼脂糖(NMA)，室温固化10min； • 可将玻片用吹风机稍微加热，以延 缓琼脂糖凝固。
• 第二层胶：取50μL 质量分数为0.8%的 低熔点琼脂糖（LMA）和30μL的细胞悬 液，混匀后滴加于第一层胶上，加该盖 片使其均匀铺开，4℃凝固10min；
8. 染色观察 • 用20μg/L的吖啶橙染色3－5min， 用双蒸水洗掉表面的染料，24小 时内在荧光显微镜下观察。
三 结果观察
50
45
40
Tail DNA%18
100 150
Tail moment
16 ¶ H2O2Ũ È 14 12 10 8 6 4 0 50 100 150
实验十七单细胞凝胶电泳技术丁书茂实验十七单细胞凝胶电泳技术丁书茂?单细胞凝胶电泳技术singlecellgelelectrophoresisscge也称彗星试验cometassay是ostlingo和johansonkj首次提出后经singh等进一步完善的一种在单个细胞水平上检测dna损伤交联和修复的方法