无症状高尿酸血症动物模型的建立及初步研究
高尿酸血症动物模型的建立及抗痛风中药的筛选解析
山东大学博士学位论文高尿酸血症动物模型的建立及抗痛风中药的筛选姓名：刘文波申请学位级别：博士专业：内科学（风湿病学）指导教师：李兴福20080420山东大学博士学位论文符号说明英文缩写ＸＯＤＣＯＸ英文全称ｘａｎｔｈｉｎｅｏｘｉｄａｓｅｃｙｃｌｏｘｙｇｅｎａｓｅｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ．１中文全称黄嘌岭氧化酶环氧化酶白细胞介素１Ｂ肿瘤坏死因子Ｑ微晶型尿酸钠ＩＬ—ｌｐＴＮＦ．ａＢｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ．ｎＭＳＵＵＡＯＡＮＳＡＩＤｓｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｕｒａｔｅｃｒｙｓｔａｌｕｒｉｃａｃｉｄｏｘｏｎｉｃａｃｉｄＮｏｎ．ｓｔｅｒｏｉｄａｌａｎｔｉ．．尿酸氧嗪酸非甾体抗炎药ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇＬＴＰＧＩｇＩｐｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａＩｉｎｏｓｉｎｅ白细胞三烯前列腺素灌胃给药腹腔注射次黄嘌呤核苷酸５一磷酸核糖一１一焦磷酸花生四烯酸质量／电荷，质荷比表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术ｉｎｊｅｃｔｉｏｎＩＭＰＰＲＰＰｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ５一Ｐｈｏｓｐｈｏｒｂｏｓｙｌ—ｌ－ｐｙｒｏｐｈｏｓ—ｐｈａｔｅＡＡａａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄＭ／ＺＳＥＬＤＩ．ＴＯＦＭＳＭａｓｓ／ＣｈａｒｇｅＳｕｒｆａｃｅｅｎｈａｎｃｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｌｌ原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。
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论文作者签名：翻童遗Ｅｌ期：矽扎５．矽关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。
高尿酸血症动物模型的建立及抗痛风中药的筛选的开题报告
高尿酸血症动物模型的建立及抗痛风中药的筛选的开题报告一、研究背景和意义高尿酸血症和痛风是伴随现代生活方式和食品结构变化日益增加的代谢性疾病，严重影响人类健康。
目前已经有相当成熟的文献报道了人体高尿酸血症和痛风的发生机制，但由于人体复杂的生理系统和道德伦理的限制，很难进行实验研究。
动物模型是研究疾病发生和药物治疗的必要手段，建立高尿酸血症动物模型可以通过模拟人体代谢紊乱的情况，进一步研究高尿酸血症和痛风的病理生理表现和药物治疗机制，为人体的临床应用提供有力的支持和借鉴。
中草药在痛风和高尿酸血症治疗中有着悠久的历史，以及广泛的临床应用。
其中活血化瘀、清热解毒、利水消肿、祛痰止咳、化痰止痛等中草药常常被用于防治痛风，这些中药可以通过抑制尿酸的合成和促进其排泄、调节体液及酸碱平衡、降低炎症程度、减轻疼痛感等渠道发挥疗效。
本课题旨在建立高尿酸血症动物模型，对相应的生理生化指标和组织学变化进行分析，探究中药对痛风的治疗作用及其机制，为开发中药新药提供参考和方向。
二、研究内容和方法1. 实验动物的选用及处理：选择健康的雄性大鼠，按照一定的比例随机分配到对照组和高尿酸血症组，对于高尿酸血症组的动物，使用高嘌呤饲料喂养，同时通过控制水和草酸的摄入，评估患病过程中的代谢状态。
经过一定的喂养和处理后，使用高效液相色谱法和尿酸转化酶比色法等方法检测实验动物的生理生化指标。
2. 组织学分析：通过动物离体检测法，观察高尿酸血症大鼠不同器官的组织构型和结构变化，比较其与对照组的差异。
采用显微相机系统对切片进行图像采集和分析。
3. 中草药的筛选和验证：针对日常临床应用中常用的活血化瘀、清热解毒、利水消肿、祛痰止咳、化痰止痛等中药，进行单药和复方药物的筛选和验证，通过实验数据的分析，评估这些药物在治疗痛风方面的功效和安全性。
4. 数据分析和验证：最终将实验得到的数据进行统计学分析和验证，评估药物在动物模型中的治疗效果和机制。
三、研究预期结果1. 成功建立高尿酸血症动物模型，对高尿酸血症大鼠的代谢状态以及相关的组织结构变化进行分析，为照顾这种动物的临床治疗提供了理论依据。
轻度高尿酸血症小鼠模型的实验研究
轻度高尿酸血症小鼠模型的实验研究黄智勇;谢红【摘要】目的:探讨氧化应激在无症状轻度高尿酸血症内皮损伤时的作用.方法:20只雄性昆明小鼠,随机分为对照组和模型组,模型组腹腔注射氧嗪酸+尿酸,14d后取血测尿酸(UA)、尿素氮(UN)、一氧化氮(NO)、血管性血友病因子(vWF)和过氧化氢(H2O2),光镜下观察大血管及肾脏情况.结果:模型组血UA水平升高(P<0.05),血UN差异无统计学意义,两组小鼠肾脏及大血管组织病理上均无明显病变,但模型组血H2O2水平升高(P<0.05),血NO水平降低(P<0.05),血vWF水平升高(P<0.05).结论:无症状高尿酸血症时存在氧化应激增强,内皮功能损伤,应考虑干预治疗.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2012(025)022【总页数】3页(P2727-2728,2731)【关键词】高尿酸血症;小鼠;动物模型;氧化应激;内皮细胞【作者】黄智勇;谢红【作者单位】解放军第175医院肾内科,福建省漳州市,363000;解放军第175医院肾内科,福建省漳州市,363000【正文语种】中文【中图分类】R363.1高尿酸血症是一种常见病，多种原因可导致血尿酸水平升高，包括饮食、肾脏排泄受损和过多内源性嘌呤的分泌，基因因素也起到一定作用。
随着人们饮食结构的改变，以及对高尿酸血症认识的提高，高尿酸血症的发病率明显增加［1］。
人们不仅认识到痛风性关节炎和尿酸盐结晶对肾脏的损伤，而且众多研究表明，尿酸升高与高血压、肾脏疾病、代谢综合征、脑卒中、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱、心血管事件及全因死亡率成独立正相关［2，3］。
由于越来越多的证据提示尿酸与高血压、代谢综合征、心血管疾病等之间的联系，似乎对高尿酸血症的治疗将使伴有其他危险因素的患者获益。
然而，在临床实践中，对于血尿酸水平轻度升高的无症状患者是否给予治疗仍存在争议。
本研究拟通过建立高尿酸血症动物模型，了解高尿酸血症时机体状态的变化，探讨无症状高尿酸血症时是否需要早期干预。
大鼠高尿酸血症肾损害模型的建立
大鼠高尿酸血症肾损害模型的建立目的：建立高尿酸血症肾损害的动物模型，为进一步研究高尿酸血症肾损害的发病机制创造条件。
方法：分别腺嘌呤、氧嗪酸钾两种药物灌胃，观察大鼠血清尿酸、血肌酐，行肾组织病理检查。
结果：1.腺嘌呤法：模型组血尿酸未显著升高已出现明显肾损害表现，2.氧嗪酸钾法：模型组血尿酸较对照组显著升高，血肌酐无统计学差异。
模型组肾脏组织切片HE染色光镜下见肾小管上皮细胞颗粒变性。
结论：1. 腺嘌呤所致高尿酸血症不排除腺嘌呤代谢产物2，8-二羟基腺嘌呤导致肾损害继发高尿酸可能，腺嘌呤造模方法不适合用于研究高尿酸血症肾损害。
2.氧嗪酸钾法造模所致肾损害符合高尿酸血症肾损害。
标签：高尿酸血症；动物模型；腺嘌呤；氧嗪酸钾前言尿酸是人体内嘌呤核苷酸的分解代谢产物，嘌呤核苷酸80%由人体细胞代谢产生，20%从食物中获得[1]。
由于合成增多和（或）排泄减少，血尿酸浓度超出正常范围，称为高尿酸血症（hyperuricemia HU）。
血中尿酸过高就会形成结晶沉积于关节、泌尿系，形成痛风、肾结石、尿酸性肾病，且越来越多的证据表明高HU是肾脏、心血管疾病的独立危险因素[2-3]。
为方便研究HUA对肾脏、心血管等的损害机制，建立动物模型是很有必要的。
1材料與方法1.1实验材料1.1.1.实验动物：雄性Wistar大鼠40只，初始体重200g±30g，6-7周龄，由山东中医药大学实验动物中心提供。
1.1.2.主要设备：罗氏MODULAR生化自动分析仪，由山东省千佛山医院检验科提供，病理检查由山东千佛山医院病理科提供。
1.1.3.药物：腺嘌呤：购自Amresco公司，批号0683。
氧嗪酸钾：购自济南德信佳生物科技有限公司，批号10080201。
1.1.4.药物配制方法：腺嘌呤：用灭菌蒸馏水配成25mg/ml悬浊液，按100mg/kg体重灌胃，一天一次。
氧嗪酸钾：用灭菌蒸馏水配成100mg/ml的悬浊液，按400mg/kg体重灌胃，一天两次。
无症状高尿酸血症动物模型的建立及初步研究
无症状高尿酸血症动物模型的建立及初步研究目的：建立新型的无症状高尿酸血症小鼠模型。
方法：选取雄性尿酸氧化酶基因敲除杂合子C57BL/6J小鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只，两类小鼠均按随机数字表法分为对照组和模型组，每组各10只，模型组给予高酵母饲料饲养并予以氧嗪酸钾盐悬液（1次/d，250 mg/kg）腹腔注射。
分别于造模前和造模后第1、2、3、4周时鼠尾静脉取血检测小鼠血清尿酸水平（UA），并于造模后第5周取小鼠肾脏行病理切片及HE染色。
结果：造模1周后，两模型组小鼠血清尿酸水平均较对照组明显升高，且杂合子模型组尿酸水平明显高于野生型模型组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），但肾脏病理切片HE染色显示，两种小鼠对照组和模型组均无明显病理变化。
结论：以高酵母饲料饲养并予以氧嗪酸钾盐悬液腹腔注射处理的尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠所构建的高尿酸血症动物模型具有尿酸值高，模型稳定的特点，为较理想的小鼠高尿酸血症动物模型。
尿酸是人类嘌呤代谢的最终产物。
在约1500万年前人类由于基因突变失去了尿酸氧化酶基因[1]，因此人类的尿酸水平高于其他物种，这种改变有利于人类适应当时的生存环境，但尿酸水平仍控制在一定范围内。
现在所谓的高尿酸血症（hyperuricemia）是指嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄障碍导致的血尿酸水平增高[2]。
随着人们生活水平的提高及饮食结构的变化，高尿酸血症的发病率日渐增高[3-4]，由于雌性激素的作用尿酸水平在男性中比绝经前女性更高[5-6]。
高尿酸血症动物模型，是研究高尿酸血症及筛选降尿酸药物的重要工具[7-9]。
目前尚未见尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠制作高尿酸动物模型的报道，本实验对尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠进行高酵母饲养及氧嗪酸钾悬液腹腔注射处理，观察其血清尿酸等指标，目的在于获得尿酸值较高且稳定的理想高尿酸血症动物模型。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物选择以C57BL/6J小鼠为背景的尿酸氧化酶基因敲除杂合子小鼠（基因型为Uox+/-）20只及野生型C57BL/6J小鼠（基因型为Uox+/+）20只，均为雄性，6～8周龄，体质量18～25 g，尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠构建于上海南方模式生物研究中心，由本院实验动物中心SPF级动物饲养房饲养。
实验性鸡高尿酸血症模型的建立
第１ ２卷 第 ５期
２ ０ １ ３年 １ ０月
摘要 ： 目的 ： 探 讨 制备 鸡持 续 高 尿 酸 血 症 动 物 模 型 的 方 法 。 方 法 ： 本试验选取 ６ ０ 日龄 的 “ 罗 曼蛋 鸡 ” ８ Ｏ只 ， 随 机 分 成 ４组 ， 每组 ２ Ｏ只 ， Ａ 组 高蛋 白 组喂 高蛋 白饲 料 ； Ｂ组 高钙 组 喂 高 钙 饲 料 ； Ｃ 组 高钙 高蛋 白组 喂 饲 高 钙 高 蛋 白饲 料 和 Ｄ 组 对 照 组 喂 基 础 饲 料 。 各 组 试 验 用 鸡 采 取 自 由采 食 、 限制饮 水的方 法， 分 别 于试 验 的 １ 、 ７ 、 １ ７ 、 ２ ７ ｄ测 量 鸡 体 重 ， 鸡 的踝 关 节 周 径 ， 经翅 静 脉 进 行 采 血 ， 测 定血 清尿 酸含 量 。 结 果 ： 与对照组相 比， 高蛋 白组 在 第 １ ７ ｄ时 ， 血尿酸值 为 ４ ７ ６ ． ８ ４ － ７ ８ ． ６ “ ｍｏ ｌ ／ Ｌ， 达 到 高尿 酸 血 症 水 平 ， 高钙 高蛋 白 组在 第 ２ ７ ｄ时 血尿 酸值 为 ６ ９ ７ ． ５ ±３ １ ２ ． ３ ｔ ￣ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ， 达 到 高尿
中 图分 类号 ： Ｒ ５ ８ ９ ． ７
文献标识码 ： Ａ
文章 编 号 ： １ ６ ７ １ — ８ ２ ７ ５ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ５ — ０ １ ３ ３ — ０ ３
嘌 呤 代 谢 紊 乱 和 尿 酸 排 泄 减 少 会 引 起 高 尿 酸 血 症 （ ｈ ｙ ｐ ｅ ｍｒ ｉ ｃ ｅ ｍｉ ａ ） 和痛 风 （ ｇ ｏ ｕ ｔ ） 疾病， 痛 风 的 病 理 基 础 产 生 于高 尿 酸 血 症 ， 痛 风都 会伴 有高 尿酸 血 症ｏ Ｄ ］ 高 尿 酸 血 症 是 指 细胞 外 液 的 尿 酸 盐 呈 超 饱 和 状 态 ， 当血 尿 酸 盐 大 于 等 于４ １ ７ ｙ ． ｍｏ ｌ ／ Ｌ时 应 考 虑 高 尿 酸 血 症 。 引 起 嘌 呤 代 谢 紊 乱 的重 要 原 因 认 为 是 超 高 蛋 白膳 食 ， 过 量 摄入 糖 、 盐、 脂肪、 蛋 白质 及 大 量 饮 酒 与 该 病 也 有 重 要 关 系 。鸡 痛 风 病 又 称 尿石症 、 肾结 合 内脏 或 营 养 性 痛 风 等 ，是 家 禽 的 一 种 常 见 病 ，以 鸡 多 见 ， 在 我 区各 鸡 场 时 有 发 生 ， 造 成 鸡 场 不 小 损 失 。人 类 痛 风 是 由 单 钠 尿 酸 盐 （ ＭＳ Ｕ） 沉 积 所 致 的 晶 体 相 关性关节 病 ， 与 嘌 呤代 谢 紊 乱 和 （ 或） 尿 酸 排 泄 减 少 所 致 的
高尿酸血症动物模型研究进展
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3 高尿酸血症动物模型的应用现状和存在问题 3.1 造模效果的稳定性 建立持续时间较长且稳定的高尿酸血症动物模型对研究高尿酸血症及其治疗药物的筛选具有重 要意义。有研究表明使用氧嗪酸钾造模必须连续给药，中途不能停药，否则造模效果会受到影响[7]。 还有报道发现，氧嗪酸钾所诱导的动物体内血尿酸水平在一日内并不稳定 [6]，这可能夸大造模大鼠 与对照大鼠血尿酸水平的差异。 奚九一[26]等给予大鼠含有 10%酵母干粉和 0.1%腺嘌呤的混合饲料连 续 19 天后，停用该高嘌呤饲料，结果发现在此后的 52 天内，模型组大鼠血尿酸水平虽呈现先增高 后下降的趋势，但均明显高于对照组。因此，在造模后 2 个月内，可用该模型进行药物降血尿酸的 疗效观察。 3.2 单用和合用 单用一种机制的药物造模往往不能取得很好的效果。故目前大多数研究采用联合造模的方式， 即两药合用甚至三药合用。联合造模不仅能使高尿酸血症模型维持时间更长，血尿酸升高更明显， 而且也更接近人类高尿酸血症的发生机制和实际情况。 有报道[27]单用含 60%果糖的饲料饲喂大鼠 10 周，与空白对照组相比，血尿酸升高 37%；单用氧嗪酸钾造模，大鼠血尿酸升高 45%；而联合使用 果糖与氧嗪酸钾，可使血尿酸升高 55%。还有研究表明，当联合使用氧嗪酸钾和乙胺丁醇腹腔注射 给予大鼠时，在显著升高血尿酸的同时还可减少尿中尿酸的排出量，避免肾损害的发生。此联合造 模方法既存在抑制尿酸排泄的因素，又没有补充外源性尿酸，适用于降尿酸药物的筛选 [28]。 3.3 造模导致的肾损害 许多研究表明，使用造模药物后往往会出现不同程度的肾损害。超过一定剂量的腺嘌呤在黄嘌 呤氧化酶作用下可生成极难溶于水的 2,8-二羟基腺嘌呤，沉积于肾脏造成肾损害。Kensar[4]的研究表 明，尿酸介导的氧化应激在肾损害及肾脏疾病的发生中有重要作用。有报道显示，连续 8 周给予大 鼠含 10%果糖的饮用水造模，与对照组相比，果糖组大鼠血肌酐和尿素氮水平升高，而尿中 24h 尿 酸和肌酐排泄量降低；肾组织病理组织学检查结果显示，肾小管扩张，肾小管上皮细胞刷状缘损失， 小管上皮细胞变性和坏死[3]。关于单用氧嗪酸钾造模对肾脏的影响，现有研究结论不近相同，有研 究表明，较长时间使用氧嗪酸钾并未见明显肾损害[10]，但也有研究显示[4]，单独给氧嗪酸钾 4 周即 可显著增加血肌酐和血尿素氮浓度，并造成明显的肾小管间质性炎症、肾小管上皮细胞脱落和间质 细胞浸润。 3.4 造模机制与人类高尿酸血症的发病机制的差别 目前常用的造模方法与人类原发性高尿酸血症的发病机制都有一定的差异。在人体内，由于内 源性嘌呤产生过多而导致高尿酸血症者仅占 10%~15%。嘌呤代谢受相关酶的反馈调节，而遗传缺陷 可导致酶缺乏或酶活性改变。如 1-焦磷酸-5-磷酸核糖（phosphori bosylpyrophosphate，PRPP）合成 酶（PRPPS）活性过高，可导致 PRPP 和嘌呤核苷酸生成过多而产生过多的次黄嘌呤核苷酸，嘌呤 生成的负反馈抑制减低，间接致血清尿酸增多；而通过给予尿酸前体物质制造高尿酸血症模型的方 法由于外源性嘌呤过多，反而可通过负反馈机制抑制了 PRPPS 活性。原发性高尿酸血症另一个重要 的酶缺陷是由于次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hyoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase， HGPRT）活性减少，抑制了嘌呤核苷酸的补救合成途径；而目前的造模方法大多是通过大量增加嘌 呤来源，使得 HGPRT 活性增高。 4 小结 高尿酸血症的发病率正在不断增加，建立良好的高尿酸血症动物模型对于研究高尿酸血症的发 生机制和评价治疗药物的效果有重要意义。目前，对于高尿酸血症动物模型的研究虽然取得了很大 进展，但现有模型仍存在一些问题和局限性，需要进一步改善。深入开展高尿酸血症动物模型的研 究，建立与人体尿酸代谢更相似、更接近人类发病机制的动物模型，是今后研究的主要方向。 参考文献 [1] Huang J, Wang S, Zhu M, et al. Effects of Genistein, Apigenin, Quercetin, Rutin and Astilbin
高尿酸血症肾损害动物模型建立及
Ｃｏｃｋｔａｉｌ（美国Ｓｉｇｍａ．Ａｌｄｒｉｃｈ）的细胞裂解液（０．１％ ＳＤＳ，Ｏ．５％脱氧胆酸钠，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ，２０ １ ｍｍｏｌ／Ｌ ｍｍｏ］／Ｌ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ７．５，５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，
ＰＭＳＦ）裂解组织后低温离心取上清，
ＢＣＡ法测定蛋白浓度。取４０斗ｇ蛋白，１０％ＳＤＳ． ＰＡＧＥ电泳，半干法转至ＰＶＤＦ膜。一抗为ＥＧＦＲ（美
Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ ｕｒｉｃ ａｃｉｄ
ｗｅｉｇｈｅｄ ２００—２２０ ｇ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｓｓｉｇｎｅｄ
ｉｎｔｏ ２ ｇｒｏｕｐｓ：ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ（凡＝９），ｔｈｅ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ ｇｒｏｕｐ∞＝９）．ＵＡＮ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｏｒａｌ
氧嗪酸钾１５００ ｍｇ／蜡、水化，０．０１ ｍｏｌ／Ｌ枸橼酸缓冲液高压修复８ ｍｉｎ，正常山羊血 清封闭３０ ｍｉｎ，仅一ＳＭＡ鼠多克隆抗体（美国Ｓｉｇｍａ— Ａｌｄｒｉｃｈ，１：２００）４℃过夜，生物素标记山羊抗鼠 ＩｇＧ ３７０Ｃ孵育６０ ｍｉｎ，ＤＡＢ显色，苏木素复染，封 片，显微镜观察并拍片。 ７．统计学分析：应用ＳＰＳＳｌ７．０统计软件进行 统计学处理，所有数据采用瑟±ｓ表示，组问比较采 用单因素方差分析，以Ｐ＜０．０５为有统计学意义。
ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，ＵＡＮ）对人类健康的影响亦 日益凸显［１－２１。模拟高尿酸血症肾损害患者的病
理生理状况，建立优质的高尿酸血症肾损害的动 物模型，探求ＵＡＮ的发生机制，寻求启动ＵＡＮ病 理机制的关键致病靶点，对ＵＡＮ的防治具有重要 意义。我们新近报道，基因或药物方式阻断表皮 生长因子受体（ＥＧＦＲ）活化可阻断单侧输尿管结 扎（ＵＵＯ）诱导的肾间质纤维化进展ｐ】，但ＥＧＦＲ活 化在高尿酸血症肾损害机制中的作用未见报道， 本研究通过建立ＵＡＮ动物模型，探讨高尿酸血症 肾损害的发生机制。
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无症状高尿酸血症动物模型的建立及初步研究目的：建立新型的无症状高尿酸血症小鼠模型。
方法：选取雄性尿酸氧化酶基因敲除杂合子C57BL/6J小鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只，两类小鼠均按随机数字表法分为对照组和模型组，每组各10只，模型组给予高酵母饲料饲养并予以氧嗪酸钾盐悬液（1次/d，250 mg/kg）腹腔注射。
分别于造模前和造模后第1、2、3、4周时鼠尾静脉取血检测小鼠血清尿酸水平（UA），并于造模后第5周取小鼠肾脏行病理切片及HE染色。
结果：造模1周后，两模型组小鼠血清尿酸水平均较对照组明显升高，且杂合子模型组尿酸水平明显高于野生型模型组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），但肾脏病理切片HE染色显示，两种小鼠对照组和模型组均无明显病理变化。
结论：以高酵母饲料饲养并予以氧嗪酸钾盐悬液腹腔注射处理的尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠所构建的高尿酸血症动物模型具有尿酸值高，模型稳定的特点，为较理想的小鼠高尿酸血症动物模型。
尿酸是人类嘌呤代谢的最终产物。
在约1500万年前人类由于基因突变失去了尿酸氧化酶基因[1]，因此人类的尿酸水平高于其他物种，这种改变有利于人类适应当时的生存环境，但尿酸水平仍控制在一定范围内。
现在所谓的高尿酸血症（hyperuricemia）是指嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄障碍导致的血尿酸水平增高[2]。
随着人们生活水平的提高及饮食结构的变化，高尿酸血症的发病率日渐增高[3-4]，由于雌性激素的作用尿酸水平在男性中比绝经前女性更高[5-6]。
高尿酸血症动物模型，是研究高尿酸血症及筛选降尿酸药物的重要工具[7-9]。
目前尚未见尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠制作高尿酸动物模型的报道，本实验对尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠进行高酵母饲养及氧嗪酸钾悬液腹腔注射处理，观察其血清尿酸等指标，目的在于获得尿酸值较高且稳定的理想高尿酸血症动物模型。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物选择以C57BL/6J小鼠为背景的尿酸氧化酶基因敲除杂合子小鼠（基因型为Uox+/-）20只及野生型C57BL/6J小鼠（基因型为Uox+/+）20只，均为雄性，6～8周龄，体质量18～25 g，尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠构建于上海南方模式生物研究中心，由本院实验动物中心SPF级动物饲养房饲养。
1.1.2 仪器和试剂日本东芝TBA-40FR全自动生化分析仪；Nikon90i显微镜；高酵母饲料（北京科澳协力饲料有限公司）；氧嗪酸钾盐（美国Aldrich公司）。
1.2 实验方法1.2.1 动物分组及建模杂合小鼠及野生型小鼠适应性饲养7 d后，按随机数字表法分别分为对照组和模型组，每组10只。
模型组小鼠予以高酵母饲料饲养及氧嗪酸钾悬液腹腔注射（1次/d，250 mg/kg），对照组小鼠饲以普通小鼠颗粒饲料，并给予同体积蒸馏水腹腔注射。
1.2.2 观察指标与测定方法杂合小鼠和野生型小鼠均分别于造模前和造模后第1、2、3、4周时鼠尾静脉取血，室温下静置1 h后，3500 rpm，4 ℃离心15 min，收集血清，应用全自动血液生化仪检测记录血尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CH）、谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST）的水平，并对所得数据进行分析。
1.2.3 病理切片及HE染色造模第5周将小鼠麻醉后，迅速打开腹腔，取肾脏，置于4%的甲醛溶液中固定，脱水，常规石蜡包埋，包埋后肾脏纵切以观察肾门、肾盂结构，苏木素-伊红染色，封片，于Nikon90i显微镜下观察组织切片。
1.3 统计学处理采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料均以（x±s）表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 四组小鼠不同时期血尿酸水平比较造模前，各组小鼠血尿酸水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。
造模1～4周，杂合子模型组小鼠血尿酸水平与造模前比较均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
野生型模型组小鼠血尿酸水平1～4周也明显升高，与给药前比较差异有统计学意义（P＜0.05）；两模型组小鼠血清尿酸水平均高于对照组（P＜0.05）；杂合子模型组小鼠与野生型模型组小鼠组比较，造模后1～4周尿酸水平升高更明显，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表1、图1。
2.2 各组小鼠血肌酐、尿素氮、甘油三酯、胆固醇，谷丙转氨酶及谷草转氨酶的变化造模前后，所有模型组小鼠血肌酐、尿素氮、甘油三酯、胆固醇、谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平与相应对照组比较无明显差异。
2.3 各组小鼠肾脏病理切片HE染色比较建模5周后处死小鼠留取肾脏标本进行HE染色，光镜下观察，模型组小鼠肾皮质、髓质结构清晰，未见明显病理改变，与各自对照组比较无显著差别，见图2～3。
3 讨论在中国高尿酸血症患病率高达5.0%～23.5%，已接近欧美发达国家水平[10]。
近年来国内外研究资料显示，高尿酸血症患者中约20%可发生痛风。
另外，作为心脑血管疾病的独立危险因素，高尿酸血症可诱发和加重动脉粥样硬化性疾病，增加心脑血管疾病发病率和死亡率[11-13]，同时，高尿酸血症也与代谢综合征、肾脏疾病密切相关[14-18]。
人类在进化过程中尿酸氧化酶基因失活，导致嘌呤代谢的终产物以尿酸的形式存在，这是人类易患高尿酸血症的重要原因[19-20]，当然这还与多种因素有关[21-22]。
而低级动物体内却能产生尿酸氧化酶（Uox），它可将尿酸分解为更易溶于水的小分子尿囊素排出体外，这是许多低级动物（包括小鼠）维持尿酸稳态的主要途径。
目前国内外建立高尿酸血症动物模型的方法主要有4类，分别为酵母法、补充尿酸或尿酸前体法、尿酸酶抑制剂法及破坏尿酸酶基因法[23]。
传统的对野生型C57BL/6J小鼠进行药物刺激造模的方法血尿酸升高并不理想，存在尿酸值不稳定、小鼠状态差等缺点，不适宜进行长期实验。
尿酸氧化酶基因敲除后，小鼠可出现高尿酸血症和痛风症状，成为与人类高尿酸血症发病机制非常相似的自发性高尿酸血症小鼠动物模型。
但1994年文献报道的模型存在下列缺陷：（1）尿酸氧化酶基因缺失的纯合子小鼠于出生后4周内有超过一半死亡；（2）该基因敲除小鼠背景为129品系，具有免疫排斥，无法在小鼠体内模拟人类的发病过程；（3）纯合子小鼠血尿酸水平是杂合子及野生型小鼠的10倍余，合并致死性肾脏疾病等，从而无法对该模型进行长期观察及实验。
本课题组应用TALEN靶向基因修饰技术将C57BL/6J小鼠的尿酸氧化酶基因敲除，构建了自发性高尿酸血症小鼠模型，但与Uox+/+小鼠和Uox+/-小鼠相比，Uox-/-小鼠的出生率约15.8%，低于孟德尔遗传定律的25%，而且Uox-/-小鼠死亡率较高。
Uox+/-小鼠的出生率约53.3%，死亡率仅4.45%。
基于Uox-/-小鼠的出生率较低，死亡率较高，价格昂贵，本实验选用Uox+/-小鼠进行高尿酸模型研究。
实验结果显示杂合子小鼠高酵母饲养+氧嗪酸钾溶液腹腔注射造模后血尿酸升高明显高于野生型小鼠造模组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
可应用此模型对受试药物进行实验研究。
本实验认为对杂合子小鼠高酵母饲养并予以腹腔注射氧嗪酸钾盐法可建立较理想的小鼠高尿酸血症动物模型。
但本法仍不能形成持久的高尿酸血症是其不足之处。
将高酵母饲养与尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾盐腹腔注射序贯应用或改变给药方式，以期获得更可靠的的高尿酸血症动物模型是笔者下一步的实验研究方向。
参考文献[1] Gibson T.Hyperuricemia，gout and the kidney[J].Curr Opin Rheumatol，2012，24（2）：127-131.[2] Grobner W.Hyperuricemia and gout[J].Dtsch Med Wochenschr，2015，140（21）：1615-1626.[3]吴鹏涛，曾佑勤.北京市体检人群高尿酸血症患病率现状调查及危险因素分析[J].中国医学创新，2015，12（8）：55-57.[4] Yadav D，Lee E S，Kim H M，et al.Hyperuricemia as a potential determinant of metabolic syndrome[J].J Lifestyle Med，2013，3（2）：98-106.[5] Soltani Z，Rasheed K，Kapusta D R，et al.Potential role of uric acid in metabolic syndrome，hypertension，kidney injury，and cardiovascular diseases：is it time for reappraisal[J].Curr Hypertens Rep，2013，15（3）：175-181.[6] Guo M，Niu J Y，Li S R，et al.Gender differences in the association between hyperuricemia and diabetic kidney disease in community elderly patients[J].J Diabetes Complications，2015，29（8）：1042-1049.[7]郭建军，倪晓俊，史丽，等.高尿酸血症与急性脑梗死的关系临床研究[J].中国医学创新，2015，12（26）：51-53.[8] Guo Y，Jiang Q，Gui D，et al.Chinese herbal formulas Si-Wu-Tang and Er-Miao-San synergistically ameliorated hyperuricemia and renal impairment in rats induced by adenine and potassium oxonate[J].Cell Physiol Biochem，2015，37（4）：1491-1502.[9] Ma Y Y，Wu Y L，Zhu E W，et al.Rats hyperuricemia model established by lipid emulsion simulating irregular of diet[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2015，40（10）：2009-2013.[10] Ito R，Takahashi T，Katano I，et al.Current advances in humanized mouse models[J].Cell Mol Immunol，2012，9（3）：208-214.[11] Testa A，Prudente S，Leonardis D，et al.A genetic marker of hyperuricemia predicts cardiovascular events in a meta-analysis of three cohort studies in high risk patients[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2015，25（12）：1087-1094.[12] Fernández-Llama P，Calero F.Hyperuricemia and cardiovascular risk：myth or fact[J].Hipertens Riesgo Vasc，2015，32（4）：131-132.[13] Andia I，Rubio-Azpeitia E.Angiogenic and innate immune responses triggered by PRP in tendon cells are not modified by hyperuricemia[J].Muscles Ligaments Tendons J，2014，4（3）：292-297.[14]俞婧，吴皓，李明珍，等.天津市高中生血清谷丙转氨酶升高与高尿酸血症的关系[J].中国医学创新，2014，11（3）：5-8.[15]谭鹤长，孟晓燕，罗春明.无症状性高尿酸血症患者血浆脂联素与抵抗素水平观察[J].中国医学创新，2015，12（21）：34-36.[16]赵丽，赵敏，朱华.2型糖尿病并高尿酸血症相关因素分析[J].中国医学创新，2011，8（33）：25-26.[17]王莉，徐柳青，施映枫，等.高尿酸血症肾损害动物模型建立及发生机制研究[J].中华肾脏病杂志，2015，31（3）：203-207.[18]刘建华，张振萍.高尿酸血症与2型糖尿病、脑梗死等相关意义探讨[J].中国医学创新，2010，7（3）：123-124.[19] Levy G，Cheetham T C.Is it time to start treating asymptomatic hyperuricemia[J].Am J Kidney Dis，2015，66（6）：933-935.[20] Takir M，Kostek O，Ozkok A，et al.Lowering uric acid with allopurinol improves insulin resistance and systemic inflammation in asymptomatic hyperuricemia[J].J Investig Med，2015，63（8）：924-929.[21] Wakuda H，Uchida S，Ikeda M，et al.Is hyperuricemia a risk factor for arteriosclerosis？Uric acid and arteriosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice[J].Biol Pharm Bull，2014，37（12）：1866-1871.[22] Stelmach M J，Szczerbinski L，Wasilewska N，et al.Hematological parameters in adolescents with hyperuricemia[J].Indian Pediatr，2014，51（12）：1003-1005.[23]陈瞳，崔凌凌，王希波，等.高尿酸血症大鼠模型的建立及其肾脏损伤观察[J]. 山东医药，2013，53（43）：29-31.[24]田腾跃，包永睿，孟宪生，等.基于生化指标的小鼠高尿酸血症模型考察[J].亚太传统医药，2015，11（18）：3-5.[25]孟笑玮，樊克涛，代向东，等.高尿酸血症动物模型的实验研究[J].天津中医药，2015，31（10）：614-617.[26]赵旭，包剑锋.非酒精性脂肪性肝病伴高尿酸血症动物模型探究[J].中国药物与临床，2015，15（8）：1097-1099.[27]王爱玲，于海荣，孙阁，等.无症状高尿酸血症对大鼠血压及尿蛋白β2-微球的影响[J].河北医学，2015，21（6）：905-907.。