电针对骨性关节炎软骨细胞JAK_STAT信号通路表达的影响_吴明霞

电针治疗骨性关节炎具有独特的特色与优势，其治疗成本小，副作用少，患者痛苦少，临床效果显著［1-2］，但具体作用机制有待于深入研究。

本研究采用4%木瓜蛋白酶注射SD 大鼠双膝关节腔复制骨性关节炎模型，给予电针治疗，旨在观察电针对关节软骨中JAK-STAT 信号转导通路的影响，探讨电针治疗骨性关节炎的可能作用机制，为中医防治骨性关节炎提供新的思路。

1实验材料与方法1.1实验动物清洁级成年SD 大鼠60只，2月龄，雌雄各半，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK （沪）2007-0005。

医学实验动物环境设施为福建中医药大学动物实验中心鼠类实验室，清洁级（合格证号：医动学第23-016号）。

实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2主要试剂及仪器透明质酸钠（山东正大福瑞达制药有限公司，国药准字H10960136），电子针疗仪（华佗牌SD-Z 型，苏州医疗用品厂有限公司）。

TGF-β1试剂盒（北京普尔伟业生物科技有限公司），逆转录试剂盒（Promega 公司），木瓜蛋白酶（上海泛柯生物科技有限公司），TRIZOL （Invitrogen 公司），RT-PCR 引物（上海生工生物技术有限公司），SYBR 荧光定量试剂盒（美国Invitrogen 公司），蛋白核酸分析仪（DU-640，美国贝克曼公司），荧光定量PCR 仪（Bio-rad iCycler iQ 伯乐公司）。

1.3实验方法SD 大鼠抽签法随机分为2组，即：正常组（10只）和实验组（50只）。

实验组第1、4、7天，水合氯醛3mL ／kg 麻醉成功后，4%木瓜蛋白酶0.2mL 双膝关节腔注射复制骨性关节炎模型［3］，术后2周，抽签法随机分为5组，即模型组（10只）、对照组（10只）、实验1组（10只）、实验2组（10只）、实验3组（10只），包括正常组，共6组。

正常组、模型组，常规饲养，未行治疗；对照组关节腔注射透明质酸钠0.04mL ／100g ，7天1次，连续5周；实验组取穴内、外膝眼，电针（脉冲频率8Hz ，输出脉冲强度10V ）治疗，实验1组5min ／d 、实验2组10min ／d 、实验3组15min ／d ，5d 为1个疗程，疗程间休息2d ，治疗5个疗程。

根据临床上电针治疗骨性关节炎时间为30min ，参照动物的体表面积计算法，根据实验动物的平均体重，采用Meeh-Rubner 氏公式计算电针干预的临床等效时间为15min 。

1.4放射免疫分析法检测TGF-β1测定各组SD 大鼠水合氯醛腹腔麻醉成功后，常规膝关节腔穿刺术，先注入0.9%生理盐水1.5mL 后，反复活动膝关节20次，缓慢抽取关节液，离心取上清；按照放射免疫分析法检测说明，测定关节液中TGF-电针对骨性关节炎软骨细胞JAK-STAT 信号通路表达的影响吴明霞1，李西海2，李俐1，梁文娜3，林久茂2，刘献祥2（1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州350003；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350108；3.福建中医药大学中医学院，福建福州350108）摘要：目的探讨电针影响骨性关节炎软骨细胞JAK-STAT 信号通路表达的作用机制。

方法采用成年SD 大鼠60只，抽签法随机分为正常组、造模组，造模组采用4%木瓜蛋白酶双膝关节腔注射建立骨性关节炎模型，抽签法随机分为模型组、对照组、实验1组、实验2组、实验3组，实验组采用电针干预，检测关节液中TGF-β1含量，Real time RT-PCR 检测软骨细胞STAT3、Smad3、LepR mRNA 的表达。

结果电针治疗后关节液中TGF-β1含量明显高于模型组（P ＜0.01），关节软骨中STAT3、Smad3、LepR mRNA 表达均明显高于模型组（P ＜0.01，P ＜0.05）。

结论电针有效增加TGF-β1含量及促进关节软骨中STAT3、Smad3、LepR mRNA 的表达，可能是其防治骨性关节炎的重要机制之一。

关键词：骨性关节炎；电针；信号转导；关节软骨中图分类号：R245.3文献标志码：A文章编号：1004-5627（2011）06-0021－03收稿日期：2011-09-18基金项目：国家自然科学基金（30873277），陈可冀中西医结合发展基金（CKJ2008003）作者简介：吴明霞（1965—），医学博士，主任医师，主要从事针灸防治骨关节病研究。

·实验研究·Journal of Fujian University of TCM December 2011，21（6）福建中医药大学学报2011年12月第21卷第6期21DOI:10.13261/ki.jfutcm.002568β1的浓度。

1.5Real time RT-PCR法检测各组STAT3、Smad3、LepR mRNA的表达各组关节软骨标本，采用液氮研磨法提取总RNA，每50mg组织加入Trizol1mL，按Triol操作说明提取总RNA，取1μg RNA逆转录成cDNA，以此cDNA为模板行SYBR Real time RT-PCR扩增STAT3（116bp，S 5′-AAC TTC AGA CCC GCC AAC AAA T-3′，A 5′-CAG ATC CAC GAT CCT CTC CTC C-3′）、Smad3（102bp，S5′-TCC CTA CAA TCC TCT CCC TT-3′，A5′-CGC TCA GAC TGT CCC TTA CC-3′）、LepR（184bp，S5′-CTT ATG CTG GGA TGT GCC TT-3′，A5′-ATC AGT TGT ACT CGG TGG CG-3′）、GAPDH（143bp，S5′-CGG CAA GTT CAA CGG CAC AG-3′，A5′-CGC CAG TAG ACT CCA CGA CAT-3′），Primer5设计引物序列。

Real time RT-PCR扩增反应条件：94℃4min，（94℃30s，50℃40s，72℃45s），40循环，溶解曲线分析确定Real time RT-PCR扩增的特异性。

基因表达的差异分析，以GAPDH mRNA表达为内参照基因，检测待测样品中的目的基因的表达水平，以对照组数据为标准样本，各实验组为待测样品，比较待测样本相对校准样本的表达差异，采用2-ΔΔCt法计算基因表达的差异。

1.6统计学处理SPSS13.6统计软件处理数据，计量资料采用x±s表示，组间比较用One－Way ANOVA方差分析，多重比较用SNK－q检验。

2结果2.16组干预后TGF-β1含量变化见表1。

2.2SD大鼠关节软骨组织总RNA鉴定各组SD大鼠关节软骨组织所有抽提的总RNA经微量核酸－蛋白定量仪定量，且OD260／OD280值均在1.80～2.00范围内，表明RNA纯度高，无蛋白和DNA污染，可用于后续的实验研究。

2.36组干预后关节软骨中STAT3、Smad3、LepR mRNA表达差异见表2。

3讨论骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性进展性关节疾病，发病率随年龄而增加，以关节软骨退变为主要特征。

研究表明，促合成性细胞因子TGF-β1作为调节者，通过调节激酶信号转导子与转录激活子（janus kinase-signal transducers and activator of transcription，JAK-STAT）通路，在关节软骨的修复过程中发挥重要的作用［4-5］。

电针具有行气止痛、舒筋通络的作用，治疗作用具有多层面、多途径、多靶点的特点，其作用机制可能是电针信号经过中枢神经系统整合后，可有效的调控内分泌系统功能释放激素、自主神经系统释放神经递质、信号转导通路调节细胞因子的分泌以及机体的免疫应答，从而能有效减轻患者的临床症状［6］。

JAK-STAT信号通路是众多细胞因子信号转导的重要途径之一，广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡过程。

细胞因子是骨性关节炎发病过程中的重要调节因素之一，通过激活各种信号转导通路调节软骨细胞的生物学功能，从而有效调控关节软骨退变。

JAK蛋白酪氨酸激酶是以与细胞因子受体胞浆区偶联的方式发挥作用，其受体与相应配体结合后活化，并通过激活STAT而调控目的基因的表达［7］。

Leptin与靶细胞上的Lep结合后，可以通过激活JAK-STAT信号通路，诱导一系列细胞内反应，从而激活相应目的基因的转录与表达，调控细胞的生物学功能［8］。

TGF-β超家族分子通过细胞膜表面Ⅰ和Ⅱ型丝氨酸／苏氨酸激酶受体进行信号转导，在软骨细胞增殖、分化以及相关疾病发生过程中具有重要的作用［9］。

Smad2、3蛋白是TGF-β通路胞浆信号转导的关键分子，其中表16组干预后TGF-β1含量比较（x±s）组别正常组模型组对照组实验1组实验2组实验3组TGF-β115.80±3.148.46±2.332）12.56±2.402）3）5）9.16±3.062）11.82±2.802）3）4）13.42±3.171）3）5）pg／mL注：与正常组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较，3）P＜0.01；与实验1组比较，4）P＜0.05，5）P＜0.01。

表26组干预后关节软骨中STAT3、Smad3、LepR mRNA表达差异比较（x±s）组别正常组模型组对照组实验1组实验2组实验3组STAT31.00±0.000.69±0.062）0.80±0.062）4）0.74±0.072）0.79±0.092）3）0.83±0.082）4）5）注：与正常组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01；与实验1组比较，5）P＜0.05，6）P＜0.01。

Smad31.00±0.000.75±0.052）0.85±0.092）3）0.79±0.072）0.84±0.072）3）0.88±0.082）4）5）LepR1.00±0.000.77±0.072）0.87±0.052）4）5）0.78±0.072）0.86±0.062）3）5）0.91±0.081）4）6）福建中医药大学学报第21卷22Smad3介导的TGF-β1信号抑制关节表面软骨细胞的肥大性分化，从而抑制关节软骨的退变［10］。